Name: Purifier limpur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons danimaux associés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Apprenez à purifier et séquencer des échantillons complexes de mucus de patients atteints de mucoviscidose pour étudier les communautés microbiennes et virales par métagénomique et métatranscriptomique.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de la santé (1 R01 GM095384-01) décerné Forest Rohwer. Nous remercions Epicentre, une société Illumina pour fournir un accès précoce aux kits Ribo-Zero Epidémiologie. Nous remercions Mark Hatay pour la conception et la production du support de tube d&#39;ultracentrifugation. Nous remercions Andreas Haas et Benjamin Knowles pour des lectures critiques et discussions du manuscrit, et Lauren Paul pour aider le processus de tournage.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La métagénomique virales Les particules virales sont concentrées en utilisant du polyethylene glycol (PEG) ou de petits concentrateurs de volume. Dans certains cas, la concentration peut ne pas être nécessaire, mais pré-filtration ou étapes de centrifugation basse vitesse sont utilisés pour éliminer les cellules eucaryotes et microbiennes. Lysats viraux seront enrichis et purifiés par gradient de densité 9,41 ultracentrifugation ou des filtres de petite taille (par exemple, 0,45 um) pour éliminer les cellules microbiennes eucaryotes et grandes 25. ultracentrifugation en gradient de densité est généralement effectuée avec des solutions denses mais inertes, tels que saccharose ou du chlorure de césium pour isoler et concentrer les particules virales 41. La séparation physique est basée sur la taille et la densité de flottaison des particules virales. Par conséquent, un choix approprié de la taille des pores du filtre et la préparation rigoureuse des gradients sont essentielles pour isoler les communautés viraux spécifiques, comme le succès de la récupération physique deVLP détermine la communauté isolé 41 (c.-à-particules virales qui ne passent pas par le filtre ou relèvent de la densité de l&#39;extraction ne sera pas détecté dans le métagénome). Après l&#39;isolement du virus et de la concentration, il peut y avoir contamination de matériau non viral génomique présent dans l&#39;échantillon à la fois sous la forme d&#39;acides nucléiques libres et microbiennes et des cellules eucaryotes. Par conséquent, il est essentiel de vérifier la pureté des particules virales dans des échantillons (figures 1A et 1B). Un traitement au chloroforme est généralement utilisé pour lyser les cellules restantes, suivi par traitement à la nuclease pour dégrader les acides nucléiques libres avant l&#39;extraction d&#39;acide nucléique. Une mise en garde au flux de travail présenté était l&#39;utilisation de gradient de densité de séparation pour isoler des particules virales comme il peut exclure particules virales enveloppées qui peuvent être trop soutenue pour entrer dans le gradient de CsCl. Une alternative &quot;fourre-tout&quot; méthode consiste à omettre le separ de gradient de densitéation et d&#39;isoler l&#39;ADN de la communauté des 0,45 um - filtrats traités avec du chloroforme et DNase I. Cette approche est également approprié pour accueillir petits volumes d&#39;échantillons tels que ceux de tampons ou plasma sanguin. Toutefois, cela peut entraîner la contamination bactérienne du chloroforme et résistant montant plus élevé de l&#39;ADN extracellulaire DNase I résistant. Protocoles de séquençage actuelles exigent une ng à 1 ug d&#39;acides nucléiques pour la préparation de la bibliothèque de séquençage lequel des rendements plus élevés d&#39;ADN fournissent un plus grand choix d&#39;options de séquençage. La concentration d&#39;ADN de viromes générés varie souvent en dessous de la limite de détection à plus de 200 ng / ul. La quantité d&#39;acides nucléiques viraux récupérés peut être insuffisant pour la préparation de la bibliothèque de séquençage direct. Dans de tels cas, l&#39;amplification de l&#39;acide nucléique est essentielle. Linker amplification shotgun bibliothèques (LASLs) 2,42,43 et l&#39;amplification du génome entier basé sur l&#39;amplification par déplacement multiple (MDA) sont les deuxméthodes les plus couramment utilisées pour générer suffisamment d&#39;ADN pour le séquençage. MDA méthodes telles que celles basées sur l&#39;ADN polymerase Phi29 sont connus pour souffrir d&#39;biais d&#39;amplification, et peuvent amplifier préférentiellement ADNsb et d&#39;ADN circulaire, d&#39;où la non-taxonomique quantitative et la caractérisation fonctionnelle 44,45. Une version optimisée de l&#39;approche LASLs a été montré à introduire seulement biais minimes, favorise une plus grande sensibilité (pour de petites quantités de matière première), et est facilement adapté pour différentes plates-formes de séquençage 43. Cependant, l&#39;approche comporte de nombreuses étapes, nécessite un équipement spécialisé pour minimiser la perte de l&#39;ADN, et est limitée à des modèles de ADNdb. Dans notre laboratoire, cette approche a été adaptée avec succès pour amplifier quantité détectable et indétectable de l&#39;ADN extrait de lavage- broncho, VLP coral- et maritimes provenant de l&#39;eau (non publiées et de Hurwitz et al. 46). Développer pipelines d&#39;analyse de données a classically été l&#39;un des aspects les plus difficiles de l&#39;analyse virale métagénomique en raison de la nature très diverse et largement inconnu des communautés virales. Bien qu&#39;il existe environ 10 huit génotypes viraux dans la biosphère, à ce jour des bases de données virales actuelles contenir ~ 4000 génomes viraux, soit environ 1 / 100.000ème de cette diversité virale total approximatif. Par conséquent, les recherches par similarité (telles que BLAST 47) pour l&#39;affectation taxonomique et fonctionnelle dans métagénomes virales possèdent défis inhérents. De nombreuses séquences manquer d&#39;avoir des similitudes importantes avec génomes dans la base de données, et par conséquent, sont classés comme inconnu. Bien que les recherches reposant sur ​​l&#39;homologie sont les applications les plus importantes pour l&#39;attribution taxonomie et fonctionnent de séquencer les données, des approches alternatives basées sur l&#39;analyse de base de données indépendante ont été développés 48- 50. Fancello et al. 51 fournissent un examen complet des outils informatiques et des algorithmes utilisés dans viral métagénomique. Microbienne métagénomique Typiquement, la quantité totale d&#39;ADN extrait de communautés microbiennes de lyse traité hypotonique (HL-ADN) vont de 20 ng à 5 ug. Le rendement est fortement tributaire de l&#39;état de santé du patient et de la quantité d&#39;échantillon d&#39;expectorations recueilli, ce qui explique les variations observées dans la production totale de HL-ADN extrait dans cette étude (tableau 2). Les étapes essentielles pour générer des données de séquences de bonne qualité se appuient sur ​​la qualité des bibliothèques de séquençage générées. La figure 2 montre une gamme typique de taille pour les bibliothèques de séquençage générées par ADN microbien FC crachats dérivé en utilisant une procédure de fragmentation de l&#39;ADN à base enzymatique. La taille optimale de la bibliothèque dépend du choix de la plateforme de séquençage et d&#39;application, et par conséquent, la procédure de fragmentation peut être optimisé, si nécessaire, par des approches alternatives, telles que la sonication et la nébulisation. En plus deles résultats représentatifs présentés, le succès de la méthode présentée sur crachats FC recueillies auprès de plusieurs patients à travers de multiples points dans le temps est également illustrée dans Lim et al. (2012) 9 et Lim et al. (2014) 10. Des études antérieures suggèrent que 9,10 chaque patient abrite un ensemble unique de communauté microbienne qui se déplace dans le temps, reflétant ainsi la persistance des acteurs majeurs au sein de la communauté tout fluctuations sont probablement dues à des perturbations telles que les traitements antibiotiques. Que ces fluctuations se produisent quotidiennement, même sans perturbations externes ou en raison de la procédure d&#39;échantillonnage et le traitement de l&#39;échantillon, est toujours en question. Sur la base de la metagénomique HL-ADN et analyse de l&#39;ADNr 16S de l&#39;amplicon, l&#39;échantillonnage longitudinal 7 jours montre que la variation journalière de profils microbiens sans perturbation antibiotique (jour 1, 2 et 3) a été minime (figures 3A et 3B). Dès l&#39;introproduction d&#39;antibiotiques par voie orale immédiatement après l&#39;échantillonnage Jour 3, les changements dans le profil de la communauté est devenu évident lors de la Journée 4. Alors que le antibiotique ciprofloxacine cible un large spectre de bactéries pathogènes connus tels que P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus et la pneumonie, le traitement a augmenté l&#39;abondance relative de P. aeruginosa tout en diminuant le Streptococcus spp. et P. melaninogenica. Par Jour 6, la communauté récupéré lentement à la structure de la communauté de départ initial. Les résultats suggèrent que les fluctuations de profils microbiens dans un seul patient sont plus probablement due à des perturbations de la communauté dans les voies respiratoires. Compte tenu de la cohérence entre les profils microbiens des bibliothèques et métagénomes ADNr 16S de l&#39;ADN HL dérivés, nous nous sommes prononcés sur les biais provenant des amorces 16S ARNr utilisées dans cette étude. Une explication possible pour les différences observées dans l&#39;ADNr 16S taxonomiqueal profils générés à partir d&#39;ADN et l&#39;ADN total de HL-dérivé (figure 3B) peut être la présence de quantités élevées de Pseudomonas spp. ADN extracellulaire après le traitement antibiotique. Ceci est soutenu par les résultats que ces différences étaient plus apparent au Jour 7, trois jours après le traitement aux antibiotiques, qui vise Pseudomonas spp. en plus des autres. La ciprofloxacine est couramment utilisé comme traitement de première ligne chez les patients atteints de mucoviscidose et P. chronique aeruginosa l&#39;infection, même si son spectre d&#39;activité inclut la plupart des agents pathogènes des FC associée. Nous émettons l&#39;hypothèse que le traitement antibiotique éradique communautés sensibles en incluant Streptococcus spp. et donc la création d&#39;un créneau rempli par P. résistant aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa peut gagner la résistance en augmentant ses communautés des biofilms et de l&#39;ADN extracellulaire a été démontré que le principal soutien structurel de son architecture de biofilm 52. Même en tant que til structure de la communauté récupéré, l&#39;ADN extracellulaire soit restée dans les expectorations FC. Par conséquent, ces données suggèrent que la lyse hypotonique et les étapes de lavage présentés dans ce flux de travail potentiellement bénéficier non seulement de retirer l&#39;ADN d&#39;origine humaine, mais l&#39;ADN extracellulaire également origine microbienne qui peuvent déformer les profils microbiens réels. Metatranscriptomics Une haute qualité metatranscriptome doit contenir relativement peu de séquences ARN ribosomique (ARNr) et représentent un échantillonnage biaisé des transcriptions communautaires (ARNm). En raison de la courte demi-vie et de la quantité limitée de l&#39;ARNm, il est essentiel que le protocole, tel que présenté ici, réduit au minimum la manipulation des échantillons de maximiser le nombre de transcrits récupérés. Au cours des dernières années, plusieurs approches pour l&#39;ARNr épuisement ont été développés et adaptés dans des kits disponibles dans le commerce. Il se agit notamment MICROB Enrich, Ribo-Zero, et spécifique échantillon h soustractiveybridizations 53 qui sont basées sur l&#39;hybridation d&#39;oligonucléotides, et l&#39;ARNm-ONLY kit qui est basée sur l&#39;activité enzymatique de l&#39;ARN exonucléase de ciblage contenant une &#39;monophosphate 5. En outre, plusieurs approches pour enrichissements ARNm tels que le Kit II-bactéries MessageAmp que polyadenylates préférentiellement et amplifie l&#39;ARN linéaire sont également disponibles. Certaines de ces méthodes (par exemple, ARNm-ONLY, MICROB E xpress et MessageAmp) sont utilisés en même temps pour une efficacité optimale. Cependant, l&#39;efficacité de toutes ces approches sont limitées, en particulier lorsque vous travaillez avec partiellement dégradée ARNr, aussi souvent observé dans l&#39;ARN total extrait à partir d&#39;échantillons FC. Polyadénylation de l&#39;ARN-dépendante amplification ne peut pas être utilisé pour générer metatranscriptomes constitués à la fois de l&#39;ARNm eucaryote et procaryote. En outre, le poly (A) ajouté à la queue les séquences peuvent réduire la quantité de données de séquences utiles. Régions avec des étendues d&#39;homopolymère auront tendance à avoir des scores de qualité inférieure, cAUtilisation un nombre important de lit à filtrer par séquençage et logiciel de post-séquençage, et la durée moyenne de lecture utile après rogner poly (A) queues seront réduits de manière significative 54. Traiter avec les communautés microbiennes du FC complexes et ARN partiellement dégradé (figures 4A et 4C), notre étude précédente a montré que la méthode d&#39;hybridation de capture par le kit Ribo-Zero or était plus efficace pour éliminer à la fois ARNr humaine et microbienne par rapport aux traitements combiner à l&#39;aide d&#39;autres kits 9 (tableau 3). Les données résultantes permet l&#39;analyse simultanée de deux hôte humain et les transcriptions microbiennes. Selon le rendement et la qualité de l&#39;ARN, ainsi que le choix final de la plate-forme de séquençage, beaucoup de ces procédés comprenant l&#39;étape de synthèse d&#39;ADNc peut être simplifié avec la génération de la bibliothèque de séquençage. Par exemple, l&#39;ARN traité Ribo-Zero peut être utilisé pour faire le séquençage de metatranscriptome libraRies utilisant le kit ScriptSeq ARN-Seq Bibliothèque Préparation. Analyse métagénomique des communautés animales associées fournit une représentation globale de l&#39;entité fonctionnelle globale qui comprend l&#39;hôte et ses communautés associées. Le flux de travail présenté ici peut être adapté à une variété d&#39;échantillons d&#39;origine animale associée complexes, en particulier ceux qui contiennent du mucus épais, de grandes quantités de débris cellulaires, de l&#39;ADN extracellulaire, les protéines et les complexes glycoprotéiques, ainsi que des cellules hôtes, en plus de la microbienne virale et souhaitée particules. Bien que les particules virales et microbiennes peuvent être perdues à chaque étape, les particules isolement et la purification sont essentiels pour réduire au minimum la quantité d&#39;ADN de l&#39;hôte. Bien que les données de la métagénomique fournit potentiels métaboliques des communautés examinés, metatranscriptomics compléter ce en révélant l&#39;expression différentielle des fonctions codées 9. Une évaluation complète de la génomique et les transcriptions des données a donné de nouvelles insDROITS à la dynamique des interactions communautaires et facilite le développement d&#39;améliorer les thérapies 9,10,55.

<html> Communautés virales et microbiennes associées avec le corps humain ont été étudiés en détail dans la dernière décennie grâce à l&#39;application des technologies de séquençage 1,2. Les résultats ont conduit à la reconnaissance des microbes d&#39;importance en matière de santé humaine et la maladie. La principale initiative est venue du projet humain de microbiome qui décrit les bactéries (et certains archées) résidant sur ​​la peau humaine, et à l&#39;intérieur des cavités orales, les voies respiratoires, tractus urogénital, tractus gastro-intestinal et 3. D&#39;autres études sur le microbiome de voies respiratoires humains sains par lavage broncho-alvéolaire (LBA) 4,5 et 4 prélèvements nasopharyngés ont montré que le poumon peut servir de dispositif d&#39;échantillonnage de l&#39;environnement, les résultats dans la colonisation microbienne transitoire dans les voies respiratoires. Toutefois, l&#39;incidence de la colonisation microbienne de surfaces des voies aériennes aveugles peut conduire à des infections pulmonaires sévères et chroniques, telles que celles observées dans la fibrose kystique (CF) patients. t &quot;&gt; CF est une maladie génétique létale provoquée par la mutation dans la fibrose kystique régulateur transmembranaire (CFTR) 6. Ces mutations donnent lieu à des protéines CFTR défectueux qui à son tour affecte le transport des ions transépithélial sur la surface apicale de l&#39;épithélium. La maladie affecte systèmes d&#39;organes multiples, mais la majorité de la mortalité et de la morbidité est imputable à la maladie pulmonaire CF 7. Le FC poumon fournit un écosystème unique pour la colonisation microbienne. Le défaut de transport d&#39;ions provoque le mucus à se accumuler dans les voies aériennes des FC, la création des micro-environnements constitués d&#39;aérobie , microaérophiles ou des compartiments anaérobies ancrés par une surface muqueuse riche en éléments nutritifs statique. Cet environnement facilite la colonisation et la prolifération des microbes, notamment virales, des bactéries et des champignons. aiguë et les infections microbiennes pulmonaires chroniques conduisent à des réponses immunitaires constants mais inefficaces, d&#39;où vaste remodelage des voies respiratoires, perte de capacité pulmonaire, et, finalement, pulmoéchec naire. Les communautés bactériennes associées au poumon CF ont été bien décrits en utilisant deux approches de la culture-dépendantes et indépendante de la culture, qui comprennent l&#39;aide de l&#39;ARN ribosomal 16S (ARNr) de séquençage des gènes 8 et métagénomique de fusil de chasse 9,10. L&#39;approche fondée sur les ARNr 16S est capable de caractériser un large éventail d&#39;espèces microbiennes et de capturer de vastes changements dans la diversité de la communauté. Toutefois, il est limité dans sa résolution en définissant les collectivités (résumé dans Claesson et al. 2010 11) et les prédictions des potentiels métaboliques sont limités aux fonctions générales connues pour la taxons identifiés. Par conséquent, ARNr 16S méthodes de séquençage de gènes sont insuffisantes pour l&#39;exactitude taxonomique et fonctionnelle analytique nécessaire des diverses communautés microbiennes présentes dans les poumons des FC. L&#39;approche métagénomique décrit ici complète l&#39;approche fondée sur les ARNr 16S, surmonte ses limites, et permet une manière relativement efficaced&#39;analyser à la fois la taxonomie de la communauté microbienne et contenu génétiques dans les poumons des FC. ADN isolé à partir d&#39;échantillons microbiens d&#39;origine animale associé contient souvent une grande quantité d&#39;ADN de l&#39;hôte. Échantillons d&#39;expectorations ou de tissus du poumon CF contiennent généralement une grande quantité d&#39;ADN humain libérée par les neutrophiles dans la réponse immunitaire, souvent supérieure à 99% de l&#39;ADN total de 12 à 14. Bien que certaines cellules humaines intactes peuvent être présents, plus de cet ADN est libre en solution ou adsorbé à la surface des microbes. En outre, la présence de bouchons de mucus visqueux exceptionnellement, les débris cellulaires et d&#39;autres contaminants inconnus compliquent encore l&#39;isolement de cellules microbiennes. Plusieurs procédés ont été testés pour appauvrissant ces échantillons d&#39;ADN humain, y compris les gradients de Percoll à humain distinct de cellules microbiennes 15, le traitement par la DNase I, du bromure d&#39;éthidium à monoazoture dégrade sélectivement l&#39;ADN humain 16, et le kit MolYsis, le tout avec un succès limité.<html> A ce jour, le procédé de purification plus efficace de l&#39;ADN microbien pour expectorations CF a été une modification du procédé décrit par Breitenstein et coll. (1995) 17. Cette approche, appelée ici méthode de lyse hypotonique (HL), utilise une combinaison de β-mercaptoéthanol pour réduire les liaisons disulfures de mucine, une lyse hypotonique des cellules eucaryotes, et le traitement de l&#39;ADN de la DNase I soluble 9. Malgré l&#39;absence de solutions de rechange la méthode de HL a soulevé certaines préoccupations en raison de (i) de biais possibles résultant de lyse indésirable de microbes et (ii) si les fluctuations observées dans la composition des communautés 9,10 sont un artefact de variations associées avec le traitement des échantillons. En plus de la génération de métagénomes de fusil de chasse, nous abordons ces questions en comparant les profils de gènes ARNr 16S de l&#39;ADN total et de l&#39;ADN microbien extrait de la méthode de HL en utilisant le même ensemble d&#39;échantillons de crachats prélevés chez un seul patient sur sept jours consécutifs. ent &quot;&gt; Comparé aux communautés microbiennes, la caractérisation des communautés virales associé avec des animaux est limitée 18,19 Les communautés virales dans les voies respiratoires des FC ne ont été caractérisé minimalement 20 -.. 22 La première étude métagénomique caractériser l&#39;ADN des communautés virales des voies respiratoires FC ont montré que la plupart des virus associés aux poumons FC sont phages 20. Le potentiel métabolique de phage dans les FC et les individus non-FC était significativement différente. En particulier, les communautés de phages chez les individus FC réalisées gènes reflète adaptations hôtes bactériennes à la physiologie des voies aériennes des FC, et bactériennes. virulence 20 études métagénomiques ultérieures de virus dans les tissus pulmonaires FC démontré hétérogénéité spatiale distinct de communautés virales entre les régions anatomiques 22. En outre, le tissu pulmonaire FC nourrissait le plus bas diversité virale observée à ce jour dans tout écosystème 22. La plupart des virus identifiés étaient phagesavec le potentiel d&#39;infecter pathogènes FC. Cependant, les virus eucaryotes tels que des virus herpétiques, les adenovirus et les virus du papillome humain (VPH) ont également été détectées. Dans un cas, où kystes dans les tissus pulmonaires ont été observées lors de la dissection, plus de 99% d&#39;un génome de papillomavirus humain a été récupéré, même si le patient n&#39;a jamais été diagnostiqué avec un papillome ou du carcinome pulmonaire. Cela indique que la diversité virale présente non seulement reflète la gravité des lésions tissulaires, mais peut également exposer et expliquer une maladie sous-jacente non caractérisée. Les protocoles décrits ici fournissent un moyen simple, mais puissant pour isoler des particules virales (VLP) à partir d&#39;échantillons constitués de grandes quantités de mucus épais, hôte et des cellules microbiennes, ADN libre, ainsi que les débris cellulaires. En complément de la métagénomique, metatranscriptomics est utilisé pour suivre la dynamique de l&#39;expression génique dans la communauté microbienne et l&#39;hôte 9,23. Dans ce cas, à la fois microbienne et host ARNm doivent être préférentiellement choisi. Étant donné que les ARNm polyadénylés bactériennes ne sont pas, un procédé déroulant ARNm basée sur oligo-dT ne peut être exploitée. Polyadénylation de l&#39;ARN dépendant de l&#39;amplification peut pas être utilisé dans des échantillons de l&#39;hôte associé si les échantillons sont connues pour contenir de grandes quantités d&#39;ARNm eucaryote. De nombreux échantillons d&#39;origine animale, y compris les expectorations associé CF, contiennent une forte densité de cellules en plus de grandes quantités de débris cellulaires et des nucleases qui comprennent des RNases. Par conséquent, un autre défi est d&#39;éviter une dégradation de l&#39;ARN au cours metatranscriptome traitement. Dans la plupart des cas, l&#39;ARN total extrait de crachats CF est partiellement dégradé, ce qui limite les applications en aval et l&#39;utilité de l&#39;ARN dérivé. Au cours des dernières années, plusieurs approches pour l&#39;ARNr épuisement ont été développés et adaptés dans des kits disponibles dans le commerce. L&#39;efficacité de ces approches est toutefois limitée, en particulier lorsque vous travaillez avec partiellement dégradée ARNr 9,24. Les méthodes employées ici permettented pour la récupération de l&#39;ARN total partiellement dégradé adapté pour aval enlèvement de ARNr totale efficace. La comparaison directe de l&#39;efficacité dans l&#39;élimination de l&#39;ARN total à partir de l&#39;ARNr partiellement dégradé comparant deux kits différents a été illustrée par Lim et al. (2012) 9. Dans l&#39;ensemble, l&#39;objectif de ce manuscrit est de fournir un ensemble complet de protocoles (Figure 1) pour générer métagénomes virales et microbiennes fusil de chasse, et un metatranscriptome, à partir d&#39;un seul échantillon de l&#39;animal associé, en utilisant échantillon d&#39;expectoration induite comme un exemple. Moléculaire flux de travail du laboratoire devrait inclure des zones pré- et post-amplification séparés pour minimiser la contamination croisée. Les méthodes sont facilement adaptables à d&#39;autres types tels que les tissus 22, du nasopharynx et oropharyngés 25, lavage broncho-alvéolaire (LBA) et le corail (données non publiées) échantillons. Chaque échantillon doit être traité dès la collecte surtout quand métagénomique microbiennes et a rencontréétudes de atranscriptomics sont souhaitées. Si les échantillons ont été congelés, il limite l&#39;isolement de cellules microbiennes intactes pour que le gel métagénomes microbiennes potentiellement perturber l&#39;intégrité cellulaire. Cependant, la congélation ne exclut pas metatranscriptomics et isolement viral, mais la qualité de l&#39;ARN et la quantité de particules virales récupérées peuvent être affectés par le processus de congélation-décongélation. Il est important de noter que l&#39;expectoration induite a servi de principale source d&#39;échantillons dans de nombreuses études associés aux patients atteints de mucoviscidose adultes et d&#39;autres maladies pulmonaires chroniques comme 26,27 BAL peut être trop envahissante. Dans nos études, les échantillons d&#39;expectoration ont été recueillies avec une méthode d&#39;échantillonnage minutieuse et cohérente, ce est à dire, à la suite rince-bouche et le rinçage de la cavité buccale en utilisant une solution saline stérile pour maintenir la contamination des microbes oraux dans les échantillons de crachats au minimum.

<table><tbody><tr><td>Tampon de lyse de l’ARN à base d’isothiocyanate de guanidine</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>Le réactif TRIzol LS a été utilisé dans cette étude</td></tr><tr><td>Perles de silice ; 0,1 à 0,15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td> Des <td>billes de zircone-silicate ont été utilisées dans cette étude</td></tr><tr><td>Dithiothreitol, qualité moléculaire (poudre sèche)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Peut être acheté auprès de n’importe quelle autre société</td></tr><tr><td>Filtre à seringue stérile ; 0,45 et micro ; Membrane PVDF hydrophile de taille de pores Enzyme</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp ;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue stérile ; 0,02 & micro ; m taille des pores</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diamètre : 25 mm</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger ultra-clairs</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &frac12 ; in. (14 x 90 mm), convient pour SW41 Ti Rotor et VLP gradient de densité ultracentrifugation</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor Beckman</td><td></td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 rotor à angle fixe Thermo</td><td>Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 ADN polymérase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&micro ; l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Précédemment acheté chez Fidelity Systems Filtre matriciel en</td></tr><tr><td>alumine avec anneau de support annulaire en polypropylène ; 0,02 & micro ; FisherScientific</td><td></td><td>09-926-34</td><td>Des membranes filtrantes Whatman Anodisc ont été utilisées dans cette étude ; diamètre 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Coloration sur gel d’acide nucléique d’or</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase sans RNase I&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Peut être acheté auprès de n’importe quelle autre société</td></tr><tr><td>Glycogène, grade ARN</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Peut être acheté auprès de n’importe quelle autre société</td></tr><tr><td>Oak Ridge Tubes à centrifuger à grande vitesse</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>Pour une procédure d’extraction d’ADN de grand volume, adapté au rotor à angle fixe SS-34</td></tr><tr><td>Kit d’élimination totale de l’ARNr</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>Le kit ScriptSeq Complete Gold (épidémiologie) peut être utilisé pour coupler l’élimination de l’ARNr avec la préparation de la banque de séquençage</td></tr><tr><td>.</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’hexadécytriméthylammonium (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purifier l&#39;impur: séquençage métagénomes et metatranscriptomes de complexes échantillons d&#39;animaux associés

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

L&#39;accessibilité de séquençage à haut débit a révolutionné de nombreux domaines de la biologie. Afin de mieux comprendre les communautés microbiennes et virales hôte associé, un flux de travail complet pour extraction de l&#39;ADN et l&#39;ARN a été développé. Le flux de travail génère simultanément de métagénomes virales et microbiennes, ainsi que metatranscriptomes, à partir d&#39;un seul échantillon pour le séquençage de prochaine génération. Le couplage de ces approches donne un aperçu à la fois des caractéristiques taxonomiques et les fonctions communautaires codé. Les méthodes présentées utilisent la fibrose kystique (CF) crachats, un type d&#39;échantillon problématique, car il est exceptionnellement visqueux et contient une quantité élevée de mucines, l&#39;ADN de neutrophiles libre, et d&#39;autres contaminants inconnus. Les protocoles décrits ici ciblent ces problèmes et avec succès récupérer l&#39;ADN viral et microbienne avec une contamination minimale de l&#39;ADN humain. Pour compléter les études de métagénomique, un protocole de metatranscriptomics a été optimisé pour récupérer deux microbienneet l&#39;ARNm hôte qui contient relativement peu de l&#39;ARN ribosomique (ARNr) séquences. Un aperçu des caractéristiques de données est présenté à servir de référence pour évaluer le succès de ces méthodes. Échantillons de crachats CF supplémentaires ont également été recueillies pour (i) évaluer la cohérence des profils sur le microbiome dans sept jours consécutifs dans un seul patient, et (ii) comparer la cohérence de l&#39;approche métagénomique à un séquençage à base de gène ARN ribosomal 16S. Les résultats ont montré que la fluctuation quotidienne des profils microbiens sans perturbation antibiotique était minime et les profils de taxonomie des bactéries communes CF-associés étaient très similaires entre les bibliothèques ADNr 16S et métagénomes générés par la lyse hypotonique (HL) -derived ADN. Toutefois, les différences entre les profils d&#39;ADNr 16S taxonomiques générés à partir de l&#39;ADN total et HL-ADN dérivé suggèrent que la lyse hypotonique et les étapes de lavage à bénéficier non seulement la suppression de l&#39;ADN d&#39;origine humaine, mais également extracellul origine microbiennear ADN qui peuvent déformer les profils microbiens réels.

Utilisation de la fibrose kystique voies aériennes, par exemple, l&#39;article présente un flux de travail complète comprenant une combinaison d&#39;approches metagénomiques metatranscriptomic et de caractériser la communauté microbienne et virale dans des échantillons d&#39;origine animale associée.

Purifier l&#39;impur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons d&#39;animaux associés

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

L’objectif global de cette procédure est de collecter et de traiter des échantillons complexes associés à l’hôte, tels que des expectorations de fibrose kystique, afin d’étudier les communautés virales et microbiennes à l’aide d’approches métagénomiques et méta-transcriptomiques. Pour ce faire, le sujet doit d’abord inhaler une solution saline hypertonique à 7 % via un nébuliseur, puis collecter des échantillons d’expectorations induites sur une période de 30 minutes. Ensuite, l’échantillon est immédiatement homogénéisé et réparti uniformément dans quatre tubes étiquetés comme métagénome viral, métagénome microbien, méta-transcriptome et expectorations supplémentaires.Ensuite, le tube méta-transcriptome est scellé, placé horizontalement et les expectorations homogénéisées à vitesse moyenne pendant 10 minutes. Enfin, les aliquotes individuelles sont traitées séparément pour isoler et purifier les cellules virales ou bactériennes avant l’isolement des acides nucléiques pour les études métagénomiques. En fin de compte, les acides nucléiques isolés sont utilisés pour la préparation de banques de séquençage à haut débit afin de générer des banques de métagénomique et de méta-transcriptomique.Le principal avantage de cette procédure est qu’elle fournit un flux de travail complet pour traiter des échantillons complexes associés à l’hôte pour l’étude des communautés virales et bactériennes au niveau de l’ADN et de l’ARN. La démonstration visuelle de cette procédure est essentielle car les étapes de prétraitement de l’échantillon sont importantes pour assurer une manipulation correcte de l’échantillon, tandis que les étapes de purification des cellules virales et microbiennes sont difficiles à apprendre En raison de la complexité de la procédure. Avant le prélèvement de l’échantillon, étiquetez quatre tubes de 15 millilitres par échantillon avec les éléments suivants, le premier avec le métagénome viral, le second en tant que métagénome microbien numéro trois avec méta-transcriptome et le tube numéro quatre en tant qu’expectoration supplémentaire. Ajoutez deux millilitres de billes de silice de 0,1 millimètre dans le tube étiqueté méta-transcriptome, suivis de six millilitres de tampon de lyse d’ARN à base d’isothiocyanate de guine, ou tampon de lyse GITC.En suivant la procédure de prélèvement d’échantillon décrite dans le protocole textuel et à l’aide de gobelets d’échantillonnage préalables, estimer le volume de l’échantillon en pesant le gobelet après le prélèvement de l’échantillon et soustraire le poids du gobelet vide. Pour le poids restant, un gramme équivaudra à un millilitre d’échantillon. Si le volume de l’échantillon est inférieur à huit millilitres, ajoutez le volume approprié de 0,02 micromètre filtré un XPBS pour porter le volume final à huit millilitres.Ensuite, utilisez immédiatement une seringue de trois millilitres pour homogénéiser l’échantillon jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’amas visibles dans les expectorations à l’aide de la même seringue, prélevez immédiatement deux millilitres d’expectoration et injectez-les dans le tube de micro-transcriptome contenant des billes de silice et un tampon de lyse GITC. Fermez le couvercle et utilisez un film para pour bien sceller le couvercle Pour éviter les fuites, utilisez un vortex, monsieur, pour homogénéiser immédiatement les expectorations à vitesse moyenne pendant 10 minutes. À l’aide de la même aliquote de seringue, deux millilitres d’expectoration chacun dans les tubes étiquetés métagénome vira et métagénome microbien, et transférez les expectorations restantes de la cupube dans le tube étiqueté expectoration supplémentaire.Conservez tous les tubes à quatre degrés Celsius ou sur de la glace et transportez-les au laboratoire si nécessaire pour générer un métagénome viral. Suite à la préparation des tampons et des solutions. Prétraitez les échantillons en ajoutant un tampon de magnésium salin filtré de 0,02 micromètre à un volume total de six millilitres.Pour faciliter la dissolution du mucus, ajoutez six millilitres de 6,5 millimolaires de DTT à chaque échantillon. Vortex vigoureusement pour mélanger et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après avoir vigoureusement tourbillonné, les échantillons tournent à nouveau à 3056 G et 10 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes.Recueillir chaque surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez un filtre ponctuel de 45 micromètres monté sur une seringue pour filtrer les surnageants dans de nouveaux tubes de 15 millilitres. Prélever 100 microlitres d’échantillon dans un tube de micro-fuge, puis effectuer un traitement au chloroforme.Extraire le surnageant et effectuer le traitement DN un. Ajouter un volume égal de 4 % de formaldéhyde pour fixer l’échantillon. Pour la microscopie à fluorescence épiscopale, reportez-vous au protocole texte pour une approche fourre-tout d’enrichissement en particules virales.Sinon, à l’aide de solutions de chlorure de césium fraîchement préparées, établissez un gradient de chlorure de césium en chargeant un millilitre de 1,7 gramme par millilitre de solution de chlorure de césium dans chaque tube, suivi d’un millilitre de 1,5 gramme par millilitre, d’un millilitre d’un virgule 35 grammes par millilitre et enfin, d’un millilitre de 1,2 gramme par millilitre de solution de chlorure de césium. Enfin, chargez six à huit millilitres d’échantillon dans des tubes à gradient individuels. Marquez des couches individuelles pour indiquer l’emplacement de chaque fraction.Ensuite, équilibrez chaque paire de deux opposée à un milligramme près. Verrouillez soigneusement chaque tube dans le godet d’essorage. Chargez sur le rotor et la centrifugeuse à 82, 844 G et quatre degrés Celsius pendant deux heures.Après la centrifugation, retirez soigneusement les tubes du support sans perturber les gradients de densité à l’aide d’une aiguille de calibre 18 attachée à une seringue de trois millilitres. Assurez-vous que l’extrémité ouverte de l’aiguille est tournée vers le haut. Percez le tube juste en dessous de la couche de densité de 1,5 gramme par millilitre et aspirez lentement environ 1,5 millilitre de solution dans la seringue.Retirez lentement l’aiguille et laissez la fraction restante dans le tube s’égoutter dans un nouveau tube de 15 millilitres à travers la perforation. Étiquetez-le comme fraction supérieure de la taille Transférez la solution dans la seringue contenant le V ps dans deux nouveaux tubes de micro-fuge. Une fois que les tampons et les solutions ont été préparés, conformément au protocole de texte, ajoutez cinq volumes de point 22 micromètres filtrés un XPBS Pour diluer chaque homogénat sous une hotte chimique, ajoutez de l’éthanol bêta MAR capta à une concentration finale de 2 % volume par volume, et secouez le mélange à température ambiante pendant deux heures après l’incubation.Faites tourner l’échantillon à 3056 GS et 10 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après avoir jeté le surnageant, utilisez 10 millilitres d’eau de qualité moléculaire pour remettre la pastille en suspension et incubez à température ambiante pendant 15 minutes avant de répéter le lavage. Après un dernier tour, et une fois que le SUP natin a été jeté, utilisez cinq millilitres d’un tampon XDNA pour remettre le granulé en suspension avant d’ajouter 15 microlitres de ds.Un par millilitre d’échantillon Incuber à 37 degrés Celsius avec mélange répété pendant deux heures. Après avoir essoré les échantillons et jeté le snat, utilisez 10 millilitres de tampon SE pour remettre la pastille en suspension. Ensuite, essorez l’échantillon et répétez le lavage.Utilisez deux millilitres de tampon SE pour remettre le plomb en suspension et transférer la suspension dans deux micro-tubes de fuge. Faites ensuite tourner les tubes à 16 000 GS à température ambiante pendant 15 minutes. Enfin, après avoir retiré le surnageant, utilisez un kit d’extraction d’ADN génomique en suivant les instructions pour les bactéries à Gram positif.Pour isoler l’ADN, les résultats précédents pour générer des métagénomes viraux sont résumés ici. Les viromes contiennent peu de séquences dérivées de l’homme, avec un seul échantillon contenant 70 % d’ADN humain CCF quatre A a été omis de l’étape d’ultracentrifugation du gradient de densité et, par conséquent, il contenait plus de 97 % de séquences dérivées de l’homme. Cette figure montre une image fluorescente d’un échantillon typique d’expectoration CF avant et après l’ultracentrifugation à gradient de densité.Des vlp claires ont été observées en l’absence de grosses particules suite à la séparation par gradient de densité observée ici. Sept échantillons quotidiens d’expectorations ont été prélevés chez un seul patient atteint de mucoviscidose qui a commencé des antibiotiques oraux. Après le troisième jour de collecte, le rendement total de l’ADN dérivé de la lyse hypotonique ou HL collecté à partir de chaque échantillon variait de 210 nanogrammes à plus de cinq microgrammes à partir des banques de séquençage Illumina générées pour chaque échantillon.Toutes les banques sauf une ont produit plus de 1 million de séquences et plus de 85 % de séquences de haute qualité ont été conservées lors du prétraitement des données. À l’aide d’un logiciel de séquençage d’impression, la quantité totale de séquences dérivées de l’homme variait de 14 % à 46 %Comme le montre ici, les profils microbiens des sous-échantillons sont très similaires à ceux des échantillons après deux traitements de lyse hypotonique. De plus, la deuxième lyse hypotonique augmente la fraction des séquences non humaines de 6 à 17 % dans les métagénomes.N’oubliez pas que travailler avec des échantillons cliniques et des agents pathogènes potentiels peut être extrêmement dangereux. L’équipement de protection individuelle doit toujours être utilisé en tout temps pendant la manipulation des échantillons. De bonnes techniques de biologie moléculaire et de microbiologie sont nécessaires lors de l’exécution de cette procédure pour garantir l’absence de contamination.À la suite de cette procédure, vous devriez être en mesure d’effectuer des études métagénomiques virales et microbiennes, ainsi que des études méta-transcriptomiques à partir d’échantillons complexes tels que les expectorations de la mucoviscidose.

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