Purifier l'impur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons d'animaux associés

Utilisation de la fibrose kystique voies aériennes, par exemple, l'article présente un flux de travail complète comprenant une combinaison d'approches metagénomiques metatranscriptomic et de caractériser la communauté microbienne et virale dans des échantillons d'origine animale associée.

L’objectif global de cette procédure est de collecter et de traiter des échantillons complexes associés à l’hôte, tels que des expectorations de fibrose kystique, afin d’étudier les communautés virales et microbiennes à l’aide d’approches métagénomiques et méta-transcriptomiques. Pour ce faire, le sujet doit d’abord inhaler une solution saline hypertonique à 7 % via un nébuliseur, puis collecter des échantillons d’expectorations induites sur une période de 30 minutes. Ensuite, l’échantillon est immédiatement homogénéisé et réparti uniformément dans quatre tubes étiquetés comme métagénome viral, métagénome microbien, méta-transcriptome et expectorations supplémentaires.

Ensuite, le tube méta-transcriptome est scellé, placé horizontalement et les expectorations homogénéisées à vitesse moyenne pendant 10 minutes. Enfin, les aliquotes individuelles sont traitées séparément pour isoler et purifier les cellules virales ou bactériennes avant l’isolement des acides nucléiques pour les études métagénomiques. En fin de compte, les acides nucléiques isolés sont utilisés pour la préparation de banques de séquençage à haut débit afin de générer des banques de métagénomique et de méta-transcriptomique.

Le principal avantage de cette procédure est qu’elle fournit un flux de travail complet pour traiter des échantillons complexes associés à l’hôte pour l’étude des communautés virales et bactériennes au niveau de l’ADN et de l’ARN. La démonstration visuelle de cette procédure est essentielle car les étapes de prétraitement de l’échantillon sont importantes pour assurer une manipulation correcte de l’échantillon, tandis que les étapes de purification des cellules virales et microbiennes sont difficiles à apprendre En raison de la complexité de la procédure. Avant le prélèvement de l’échantillon, étiquetez quatre tubes de 15 millilitres par échantillon avec les éléments suivants, le premier avec le métagénome viral, le second en tant que métagénome microbien numéro trois avec méta-transcriptome et le tube numéro quatre en tant qu’expectoration supplémentaire. Ajoutez deux millilitres de billes de silice de 0,1 millimètre dans le tube étiqueté méta-transcriptome, suivis de six millilitres de tampon de lyse d’ARN à base d’isothiocyanate de guine, ou tampon de lyse GITC.

En suivant la procédure de prélèvement d’échantillon décrite dans le protocole textuel et à l’aide de gobelets d’échantillonnage préalables, estimer le volume de l’échantillon en pesant le gobelet après le prélèvement de l’échantillon et soustraire le poids du gobelet vide. Pour le poids restant, un gramme équivaudra à un millilitre d’échantillon. Si le volume de l’échantillon est inférieur à huit millilitres, ajoutez le volume approprié de 0,02 micromètre filtré un XPBS pour porter le volume final à huit millilitres.

Ensuite, utilisez immédiatement une seringue de trois millilitres pour homogénéiser l’échantillon jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’amas visibles dans les expectorations à l’aide de la même seringue, prélevez immédiatement deux millilitres d’expectoration et injectez-les dans le tube de micro-transcriptome contenant des billes de silice et un tampon de lyse GITC. Fermez le couvercle et utilisez un film para pour bien sceller le couvercle Pour éviter les fuites, utilisez un vortex, monsieur, pour homogénéiser immédiatement les expectorations à vitesse moyenne pendant 10 minutes. À l’aide de la même aliquote de seringue, deux millilitres d’expectoration chacun dans les tubes étiquetés métagénome vira et métagénome microbien, et transférez les expectorations restantes de la cupube dans le tube étiqueté expectoration supplémentaire.

Conservez tous les tubes à quatre degrés Celsius ou sur de la glace et transportez-les au laboratoire si nécessaire pour générer un métagénome viral. Suite à la préparation des tampons et des solutions. Prétraitez les échantillons en ajoutant un tampon de magnésium salin filtré de 0,02 micromètre à un volume total de six millilitres.

Pour faciliter la dissolution du mucus, ajoutez six millilitres de 6,5 millimolaires de DTT à chaque échantillon. Vortex vigoureusement pour mélanger et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après avoir vigoureusement tourbillonné, les échantillons tournent à nouveau à 3056 G et 10 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes.

Recueillir chaque surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez un filtre ponctuel de 45 micromètres monté sur une seringue pour filtrer les surnageants dans de nouveaux tubes de 15 millilitres. Prélever 100 microlitres d’échantillon dans un tube de micro-fuge, puis effectuer un traitement au chloroforme.

Extraire le surnageant et effectuer le traitement DN un. Ajouter un volume égal de 4 % de formaldéhyde pour fixer l’échantillon. Pour la microscopie à fluorescence épiscopale, reportez-vous au protocole texte pour une approche fourre-tout d’enrichissement en particules virales.

Sinon, à l’aide de solutions de chlorure de césium fraîchement préparées, établissez un gradient de chlorure de césium en chargeant un millilitre de 1,7 gramme par millilitre de solution de chlorure de césium dans chaque tube, suivi d’un millilitre de 1,5 gramme par millilitre, d’un millilitre d’un virgule 35 grammes par millilitre et enfin, d’un millilitre de 1,2 gramme par millilitre de solution de chlorure de césium. Enfin, chargez six à huit millilitres d’échantillon dans des tubes à gradient individuels. Marquez des couches individuelles pour indiquer l’emplacement de chaque fraction.

Ensuite, équilibrez chaque paire de deux opposée à un milligramme près. Verrouillez soigneusement chaque tube dans le godet d’essorage. Chargez sur le rotor et la centrifugeuse à 82, 844 G et quatre degrés Celsius pendant deux heures.

Après la centrifugation, retirez soigneusement les tubes du support sans perturber les gradients de densité à l’aide d’une aiguille de calibre 18 attachée à une seringue de trois millilitres. Assurez-vous que l’extrémité ouverte de l’aiguille est tournée vers le haut. Percez le tube juste en dessous de la couche de densité de 1,5 gramme par millilitre et aspirez lentement environ 1,5 millilitre de solution dans la seringue.

Retirez lentement l’aiguille et laissez la fraction restante dans le tube s’égoutter dans un nouveau tube de 15 millilitres à travers la perforation. Étiquetez-le comme fraction supérieure de la taille Transférez la solution dans la seringue contenant le V ps dans deux nouveaux tubes de micro-fuge. Une fois que les tampons et les solutions ont été préparés, conformément au protocole de texte, ajoutez cinq volumes de point 22 micromètres filtrés un XPBS Pour diluer chaque homogénat sous une hotte chimique, ajoutez de l’éthanol bêta MAR capta à une concentration finale de 2 % volume par volume, et secouez le mélange à température ambiante pendant deux heures après l’incubation.

Faites tourner l’échantillon à 3056 GS et 10 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après avoir jeté le surnageant, utilisez 10 millilitres d’eau de qualité moléculaire pour remettre la pastille en suspension et incubez à température ambiante pendant 15 minutes avant de répéter le lavage. Après un dernier tour, et une fois que le SUP natin a été jeté, utilisez cinq millilitres d’un tampon XDNA pour remettre le granulé en suspension avant d’ajouter 15 microlitres de ds.

Un par millilitre d’échantillon Incuber à 37 degrés Celsius avec mélange répété pendant deux heures. Après avoir essoré les échantillons et jeté le snat, utilisez 10 millilitres de tampon SE pour remettre la pastille en suspension. Ensuite, essorez l’échantillon et répétez le lavage.

Utilisez deux millilitres de tampon SE pour remettre le plomb en suspension et transférer la suspension dans deux micro-tubes de fuge. Faites ensuite tourner les tubes à 16 000 GS à température ambiante pendant 15 minutes. Enfin, après avoir retiré le surnageant, utilisez un kit d’extraction d’ADN génomique en suivant les instructions pour les bactéries à Gram positif.

Pour isoler l’ADN, les résultats précédents pour générer des métagénomes viraux sont résumés ici. Les viromes contiennent peu de séquences dérivées de l’homme, avec un seul échantillon contenant 70 % d’ADN humain CCF quatre A a été omis de l’étape d’ultracentrifugation du gradient de densité et, par conséquent, il contenait plus de 97 % de séquences dérivées de l’homme. Cette figure montre une image fluorescente d’un échantillon typique d’expectoration CF avant et après l’ultracentrifugation à gradient de densité.

Des vlp claires ont été observées en l’absence de grosses particules suite à la séparation par gradient de densité observée ici. Sept échantillons quotidiens d’expectorations ont été prélevés chez un seul patient atteint de mucoviscidose qui a commencé des antibiotiques oraux. Après le troisième jour de collecte, le rendement total de l’ADN dérivé de la lyse hypotonique ou HL collecté à partir de chaque échantillon variait de 210 nanogrammes à plus de cinq microgrammes à partir des banques de séquençage Illumina générées pour chaque échantillon.

Toutes les banques sauf une ont produit plus de 1 million de séquences et plus de 85 % de séquences de haute qualité ont été conservées lors du prétraitement des données. À l’aide d’un logiciel de séquençage d’impression, la quantité totale de séquences dérivées de l’homme variait de 14 % à 46 %Comme le montre ici, les profils microbiens des sous-échantillons sont très similaires à ceux des échantillons après deux traitements de lyse hypotonique. De plus, la deuxième lyse hypotonique augmente la fraction des séquences non humaines de 6 à 17 % dans les métagénomes.

N’oubliez pas que travailler avec des échantillons cliniques et des agents pathogènes potentiels peut être extrêmement dangereux. L’équipement de protection individuelle doit toujours être utilisé en tout temps pendant la manipulation des échantillons. De bonnes techniques de biologie moléculaire et de microbiologie sont nécessaires lors de l’exécution de cette procédure pour garantir l’absence de contamination.

À la suite de cette procédure, vous devriez être en mesure d’effectuer des études métagénomiques virales et microbiennes, ainsi que des études méta-transcriptomiques à partir d’échantillons complexes tels que les expectorations de la mucoviscidose.