L'extraction d'acide nucléique et efficace de l'ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

L’objectif global de cette procédure est d’isoler de l’ADN et de l’ARN de haute qualité à partir d’écouvillons, puis de déterminer leur composition bactérienne à l’aide du séquençage du gène de l’ARNr 16S. Cette méthode peut aider un chercheur à identifier les bactéries contenues dans un échantillon humain donné et à déterminer les associations entre des bactéries particulières et les caractéristiques de l’hôte ou l’état de la maladie. Bien que cette méthode ait été conçue pour donner un aperçu des communautés bactériennes vaginales humaines, elle peut également être appliquée pour étudier les communautés bactériennes d’autres sites du corps, tels que les narines, la bouche, la peau et le rectum et d’autres organismes.

Notez que cette vidéo met en évidence les parties les plus délicates du protocole et ne couvre pas la partie séquençage ou l’analyse du séquençage. Brittany Bowman, une technicienne de mon laboratoire, fera une démonstration. Commencer cette procédure par des écouvillons ectocervicaux prélevés et entreposés sur de la glace humide, comme décrit dans le document d’accompagnement.

En préparation de l’extraction des acides nucléiques, nettoyez toutes les surfaces de la hotte et tous les articles introduits dans la hotte avec de l’eau de Javel suivie d’un décontaminant qui élimine les RNases, les DNases et l’ADN. Dans la hotte, placez un tube de perles par échantillon. Dans chaque tube, ajoutez 500 microlitres de tampon NaCl-Tris-EDTA, 210 microlitres de 20 % SDS et 500 microlitres d’alcool isoamylique phénol chloroforme.

Une manipulation soigneuse des écouvillons est essentielle pour obtenir des résultats clairs avec ce protocole. Il faut un peu de pratique pour transférer l’écouvillon sans le faire tomber et c’est plus facile si vous utilisez un écouvillon à tige creuse comme celui-ci. À l’aide d’une pince stérile, transférez l’écouvillon du flacon de transport dans le tube de perles.

Frottez soigneusement la tête de l’écouvillon contre les parois internes du tube pendant au moins 30 secondes. Placez le tube sur de la glace. Ensuite, changez de gants et répétez la procédure d’écouvillonnage avec l’échantillon suivant.

Une fois que tous les échantillons ont été frottés vigoureusement, laissez-les refroidir sur de la glace pendant au moins 10 minutes. Après 10 minutes pour retirer l’écouvillon, tenez la poignée avec une pince à épiler stérile et, à l’aide d’une pointe P200 propre, appuyez la tête contre l’intérieur de la paroi du tube. Ce processus libère le liquide de l’écouvillon, augmentant ainsi la récupération des acides nucléiques.

Placez le tube de perlage dans la perleuse et homogénéisez l’échantillon pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez le tube de perlage à 6 000 g et quatre degrés Celsius pendant trois minutes pour granuler les débris et séparer les phases aqueuse et phénolique. Après la rotation, trois phases peuvent généralement être vues.

La couche supérieure est la phase aqueuse, contenant l’ADN et l’ARN. La couche inférieure est la phase organique, contenant les lipides et les débris des cellules et des écouvillons. La fine couche intermédiaire blanche, appelée interphase, contient des protéines.

Transférez la phase aqueuse, environ 500 à 600 microlitres, dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Ajouter un volume égal de phénol chloroforme alcool isoamylique. Mélange par inversion et bref vortex.

Centrifugez le tube pendant cinq minutes. Après l’essorage, transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube stérile de 1,5 millilitre. Veillez à ne pas transférer de matériau de l’interphase ou de la phase phénolique sous-jacente.

Notez le volume transféré et conservez la phase phénolique pour l’isolement futur des protéines. Ensuite, ajoutez 0,8 volume d’isopropanol et 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires. Mélangez soigneusement par inversion et brièvement vortex.

Faites précipiter l’acide nucléique en refroidissant le tube à 20 degrés Celsius pendant au moins deux heures et toute la nuit. Après les précipitations, centrifugez le tube pendant 30 minutes. Après l’essorage, utilisez soigneusement une pipette pour retirer le surnageant, en laissant la pastille intacte.

Ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 100 %. Délogez le granulé avec un vortex doux ou un pipetage sans toucher le granulé. Centrifuger pendant cinq minutes.

À l’aide d’une pipette P10, retirez et jetez autant d’éthanol que possible sans déranger la pastille. Faites sécher le granulé à l’air libre à température ambiante pendant 15 minutes. Remettez le granulé en suspension dans 20 microlitres de tampon UltraPure 0.1X-Tris-EDTA.

Laissez l’échantillon refroidir sur de la glace pendant 10 minutes et pipetez à plusieurs reprises pour assurer une remise en suspension complète. Mesurez la concentration d’acides nucléiques à l’aide d’un spectrophotomètre. Si vous le souhaitez, séparez l’ADN de l’ARN à l’aide d’un kit de nettoyage de colonne en suivant le protocole du fabricant.

La configuration de la PCR est une étape critique de cette procédure. Il est très important de minimiser la contamination en assurant la stérilité des réactifs, de la cagoule PCR et des gants. Travaillez rapidement mais soigneusement et utilisez la bonne technique lorsque vous déplacez des objets dans et hors de la hotte.

Placez un support de refroidisseur de paillasse propre pour les tubes de microcentrifugation et un refroidisseur de plaque PCR dans le capot. Étiquetez les tubes à bande de 8 puits avec des bouchons individuels et placez-les dans la glacière PCR. L’amplification doit être effectuée en trois exemplaires et un contrôle de l’eau sans modèle doit être inclus pour chaque paire d’amorces.

Placez un tube de microcentrifugation dans le refroidisseur pour le mélange principal. Ensuite, pour chaque échantillon, combinez de l’eau UltraPure, un tampon HF 5X, des DNTP, une amorce directe 515F et 3 % de DMSO comme décrit dans le document d’accompagnement. Ensuite, ajoutez la polymérase au mélange principal et mélangez par pipetage.

Dans le premier puits, ajoutez 90 microlitres du mélange principal et deux microlitres de l’amorce inversée, mélangez bien. Ensuite, au quatrième puits, qui sert de contrôle sans modèle, ajoutez 23 microlitres du maître et deux microlitres d’eau et mélangez. Ensuite, ajoutez six microlitres de l’échantillon approprié dans le premier puits.

Mélangez bien et transférez 25 microlitres dans le deuxième puits. Changez d’embouts, puis transférez encore 25 microlitres du premier puits au troisième puits. Boucher fermement chaque puits.

Veillez à ne pas toucher l’intérieur des puits ou le bouchon. Ensuite, répétez ce processus pour chaque échantillon. Une fois que tous les échantillons sont préparés, faites tourner rapidement les tubes de bandelettes, transférez-les dans un thermocycleur et exécutez le programme.

Une fois le cycle terminé, faites tourner rapidement les tubes pour recueillir le liquide des parois. Ensuite, sur une paillasse de laboratoire propre, combinez les triples réactions PCR de chaque échantillon dans un tube de microcentrifugation stérile étiqueté. Transférez 25 microlitres de chaque témoin sans gabarit dans un tube stérile séparé.

Ne combinez pas encore les amplicons de différents échantillons. Pour valider la réussite de l’amplification par PCR, chargez cinq microlitres de chaque échantillon sur un gel d’agarose à 1,5 % et effectuez une électrophorèse à 120 volts pendant 30 à 60 minutes. Visualisez le gel sous la lumière UV.

Vérifiez la réussite de l’amplification de chaque échantillon en notant une seule bande forte autour de 380 paires de bases. S’il y a une double bande, réamplifiez l’échantillon avec un code-barres inversé différent. S’il n’y a pas de bande du tout, réamplifiez l’échantillon à l’aide du même code-barres inversé ou d’une amorce avec un nouveau code-barres inversé.

Si la réamplification échoue, des inhibiteurs de PCR peuvent être présents dans l’échantillon, auquel cas effectuer un nettoyage de l’ADN sur colonne pour éliminer les inhibiteurs de PCR. Conservez les 70 microlitres d’amplicon restants à 20 degrés Celsius. Jetez les 20 microlitres restants du témoin sans modèle, en supposant qu’il n’a pas donné de bande.

Pour créer le pool d’amplicons, combinez deux à cinq microlitres de chaque amplicon dans un seul tube stérile. Si la bande d’un échantillon est faible, ajoutez deux fois le volume par rapport au reste des échantillons. Retirez ensuite les amorces PCR à l’aide d’un kit.

Le cas échéant, combinez les pools d’amplicon sans amorce pour créer la bibliothèque finale. Déterminez la concentration d’ADN de la banque à l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un système fluorométrique. Enfin, diluez les échantillons à deux nanomolaires et envoyez-les pour séquençage.

Des informations détaillées sur l’analyse de séquence sont fournies dans le document d’accompagnement. L’ADN et l’ARN de haute qualité ont été isolés et l’ADN a été utilisé comme matrice pour l’amplification par PCR de la région V4 du gène de l’ARNr 16S, comme décrit dans cette vidéo. L’électrophorèse sur gel a été utilisée pour confirmer la présence d’une seule bande d’environ 380 paires de bases dans chaque échantillon amplifié avec une matrice.

Les contrôles sans modèle exécutés en parallèle avec la même paire d’amorces n’avaient pas de bande présente. Les amplicons de PCR ont ensuite été combinés dans un seul tube, quantifiés et dilués avant le séquençage. Voici un graphique à barres représentatif des scores de qualité de séquence à chaque position de la lecture.

Il est normal que la qualité de la séquence chute après 200 paires de bases. Mais le score de qualité moyen doit rester supérieur à 30. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’ADN et l’ARN des écouvillons à l’aide d’une extraction à base de phénol chloroforme, d’amplifier la région V4 du gène de l’ARN ribosomique 16SR et de préparer une banque pour le séquençage à haut débit.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de prendre grand soin de prévenir la contamination lors de la collecte d’échantillons, de l’extraction des acides nucléiques et de l’amplification par PCR. N’oubliez pas que travailler avec du phénol chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler avec une cagoule ventilée et porter des gants imperméables, des lunettes de sécurité avec écrans latéraux et une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de cette procédure.