Name: Lextraction dacide nucléique et efficace de lARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Découvrez une méthode robuste d'extraction d'acides nucléiques à partir d'écouvillons pour le séquençage du gène 16S rRNA. Cette technique permet de caractériser les communautés bactériennes humaines avec une grande qualité d'ADN et d'ARN.

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Nous tenons à remercier Elizabeth Byrne, David Gootenberg, et Christina Gosmann pour des commentaires critiques sur le protocole; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco, et Jason Norman pour la préparation des échantillons d&#39;orientation et démonstrations; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower, Skip Virgin, et Bruce Walker pour obtenir des conseils de protocole et des discussions fructueuses; et Jessica Hoisington-Lopez pour le soutien de séquençage. Ce travail a été soutenue par la Fondation Bill et Melinda Gates, et le NIAID (1R01AI111918). DSK a reçu un soutien supplémentaire du Fonds Burroughs Wellcome. MNA a été soutenu par plusieurs prix T32GM007753 du NIGMS, et Paul et Daisy Soros Fellowship. Le contenu est exclusivement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;NIGMS ou le NIH.

<ol><li>Huttenhower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486, 207-214 (2012).</li>
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<li>Aldunate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+concentrations+of+lactic+acid+potently+inactivate+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Vaginal concentrations of lactic acid potently inactivate HIV.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68, 2015-2025 (2013).</li>
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<li>Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+mouse+model+of+phage-bacterial+host+dynamics+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20236-20241 (2013).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variability+of+human+vaginal+bacteria+and+relationship+with+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial vaginosis.</a> PloS one. 5, e10197(2010).</li>
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<li>Segata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+microbial+community+profiling+using+unique+clade-specific+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes.</a> Nature methods. 9, 811-814 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).</li>
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<li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+in+women+with+bacterial+vaginosis%3A+high+resolution+phylogenetic+analyses+reveal+relationships+of+microbiota+to+clinical+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria.</a> PloS one. 7, e37818(2012).</li>
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<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPARSE%3A+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature. 10, 996-998 (2013).</li>
<li>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer, V1.0 User Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available at: http://www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/ATG/CAD/CAD Documents/Product Manuals & Specifications/Molecular Spectroscopy/UV Visible Spectrophotometers/Spectrophotometer Systems/NanoDrop/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).</li>
<li>AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://http://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna-sample-technologies/dna-rna-protein/allprep-dnarna-mini-kit/ - orderinginformation (2015).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li>
<li>UltraClean PCR Clean-Up Kit Instruction Manual. MoBio. , Available from: http://www.mobio.com/images/custom/file/12500(1).pdf (2013).</li>
<li>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent. Invitrogen. , Available at: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf (2008).</li>
<li>Quality Scores for Next-Generation Sequencing. Illumina. , Available from: http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdf (2011).</li>
<li>split_libraries_fastq.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html (2015).</li>
<li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greengenes%2C+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li>
<li>pick_open_reference_otus.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/pick_open_reference_otus.html (2015).</li>
<li>summarize_taxa_otus.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/summarize_taxa.html (2015).</li>
<li>Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMPeror%3A+a+tool+for+visualizing+high-throughput+microbial+community+data%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data.</a> GigaScience. 2, 16(2013).</li>
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<li>Eren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+diversity+of+Gardnerella+vaginalis+in+the+genitourinary+tract+microbiota+of+monogamous+couples+through+subtle+nucleotide+variation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation.</a> PloS one. 6, e26732(2011).</li>
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<li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole pour l&#39;identification et la caractérisation des abondances bactériennes relatives dans un prélèvement vaginal humain. Ce protocole peut facilement être adapté à d&#39;autres types d&#39;échantillons, tels que des selles et des tampons d&#39;autres sites du corps, et pour les échantillons prélevés à partir d&#39;une grande variété de sources. L&#39;extraction de l&#39;acide nucléique par billes raclée dans une solution tamponnée de phénol et de chloroforme, permet d&#39;isoler de l&#39;ADN et l&#39;ARN, ce qui est particulièrement important lorsque l&#39;on travaille avec des échantillons prélevés précieux au moyen d&#39;études cliniques. L&#39;ADN bactérien isolé est excellent pour l&#39;identification taxonomique bactérienne et l&#39;assemblage génomique, tandis que la collecte simultanée de l&#39;ARN offre la possibilité de déterminer bactérienne fonctionnelle, l&#39;hôte et les contributions virales par l&#39;ARN-seq. Le protocole décrit utilise une seule étape primaire ensemble validé qui a été déployé avec succès sur un large éventail de types d&#39;échantillons, y compris humain, canin, et des échantillons environnementaux 10 </sup&gt;. La disponibilité de milliers d&#39;amorces permet le multiplexage à code-barres d&#39;échantillons et d&#39;énormes économies sur les coûts de séquence. Le coût complet (y compris tous les réactifs, un seul cycle de séquençage, et des amorces mais pas l&#39;équipement) est d&#39;environ 20 $ par échantillon lorsque 200 échantillons sont multiplexés. En outre, il est très grande reproductibilité lorsque plusieurs tampons à partir du même site d&#39;échantillonnage sont traitées indépendamment par l&#39;ensemble du pipeline. Dans l&#39;ensemble, le protocole est rentable, flexible, fiable et reproductible. La partie d&#39;extraction d&#39;acide nucléique de ce protocole est limitée par les mesures de sécurité nécessaires lorsque l&#39;on travaille avec du phénol et du chloroforme, et les défis de l&#39;automatisation de la conduite à un haut-débit, le format de plaque à 96 puits. En outre, la perle battre vigoureuse utilisé pour des cisailles de lyse mécanique l&#39;ADN bactérien à environ 6 fragments de kilobases; si des fragments d&#39;ADN plus longs sont nécessaires pour les applications en aval, la durée du bourrelet battant should être raccourci. Les limites de la partie d&#39;identification bactérienne de ce protocole sont inhérentes à toute méthode qui repose sur le séquençage des gènes ARNr 16S. Le séquençage de l&#39;ARNr 16S est idéal pour l&#39;identification bactérienne au niveau du genre et de même espèce, mais fournit rarement identification de niveau de tension. Alors que la région variable V4 du gène ARNr 16S fournit la discrimination robuste chez la plupart des espèces bactériennes 11, les méthodes de calcul supplémentaires tels que oligotypage 31 peuvent devoir être utilisés pour identifier précisément certaines espèces, telles que Lactobacillus crispatus. Enfin, des informations sur les capacités fonctionnelles bactériennes précises au sein d&#39;un échantillon particulier ne peut pas être déterminée par ARNr 16S séquençage du gène seul, bien que ce protocole permet l&#39;extraction de l&#39;ADN du génome entier et de l&#39;ARN qui peut être utilisé à cette fin. L&#39;étape la plus essentielle pour assurer le succès de ce protocole prend grand soin pour éviter la contamination durment le prélèvement d&#39;échantillons, l&#39;extraction d&#39;acide nucléique, et une amplification par PCR. Assurer la stérilité au moment de la collecte d&#39;échantillons en portant des gants propres et en utilisant des écouvillons stériles, tubes, et des ciseaux. Pour évaluer la contamination des matériaux de collecte, de recueillir des tampons de contrôle négatif en plaçant des tampons inutilisés supplémentaires directement dans des tubes de transport au moment de l&#39;échantillonnage. Dans le laboratoire, effectuer toutes les étapes de pré-amplification dans une hotte stérile contenant des fournitures ne décontaminés et en utilisant uniquement la biologie moléculaire, des réactifs exempts d&#39;ADN. Au cours de l&#39;extraction d&#39;acide nucléique, d&#39;empêcher la contamination croisée à l&#39;aide d&#39;une pince stérile et de nouveaux gants frais à chaque échantillon, et en gardant l&#39;ensemble des tubes fermés sauf lors de l&#39;utilisation. Traitement des tampons inutilisés en parallèle assure la stérilité à la fois du prélèvement de l&#39;échantillon et l&#39;extraction d&#39;acide nucléique; les tampons inutilisés ne devraient pas donner une pastille après précipitation de l&#39;isopropanol et le lavage à l&#39;éthanol. Si une pastille ne semble, effectuer des ARNr 16S amplification génique pour déterminer une source possible dela contamination (par exemple, la présence de Streptococcus ou Staphylococcus indiquerait une contamination de la peau). En outre, effectuer des amplifications par PCR avec aucune réaction de commande de modèle en parallèle pour garantir que les réactifs et les réactions PCR sont pas contaminés. Si un groupe apparaît dans une commande pas de modèle, jeter des réactifs et répéter l&#39;amplification avec des réactifs frais. Compte tenu de ces précautions permettra d&#39;assurer le séquençage réussie des bactéries d&#39;intérêt. L&#39;étape d&#39;amplification PCR a tendance à exiger le plus dépannage. Amplifier dans des ensembles de douze échantillons fournit un équilibre entre l&#39;efficacité et la cohérence. L&#39;absence totale de bandes dans tous les échantillons dans un ensemble d&#39;amplification donnée indique une défaillance systématique, par exemple, en oubliant d&#39;ajouter un réactif ou de programmation de façon incorrecte le thermocycleur. L&#39;absence d&#39;une bande de quelques échantillons est généralement dû à une erreur humaine, et les amplifications doivent être re-rnon avec le même appariement de l&#39;échantillon et l&#39;amorce inverse. Dans le cas d&#39;une absence continue d&#39;une bande, l&#39;échantillon peut être ré-amplifié en utilisant une amorce inverse avec un code à barres différent. échecs répétés d&#39;amplification avec plusieurs amorces inverses peuvent indiquer un inhibiteur présent dans l&#39;échantillon. Dans ce cas, le nettoyage de l&#39;ADN avec une colonne souvent éliminer les inhibiteurs sans altérer de manière significative les abondances bactériennes relatives. Si plusieurs bandes résultent après amplification, re-amplifier l&#39;échantillon avec un autre code à barres amorce inverse. En plus de prévenir la contamination de l&#39;environnement et de veiller à l&#39;amplification d&#39;un produit spécifique unique, le séquençage succès repose sur les soins lors de la préparation de la piscine de la bibliothèque. L&#39;objectif est de combiner des quantités équimolaires des amplicons de chaque échantillon pour assurer approximativement le même nombre de lectures par séquençage de l&#39;échantillon. Si les concentrations d&#39;acide nucléique avant amplification sont comparables, en ajoutant simplement des volumes égaux de chacun saLes amplicons de Mple est suffisante lors de la création de la piscine de la bibliothèque. Cependant, si les concentrations d&#39;acides nucléiques sont très différentes et ajoutée en volume égal de l&#39;échantillon avec la concentration d&#39;acide nucléique faible sera mal représentée avec un faible nombre de lectures. Dans ce cas, il est possible d&#39;ajouter un plus grand volume des amplicons de l&#39;échantillon à faible concentration en fonction de l&#39;intensité relative de la bande de gel. En variante, il est possible d&#39;éliminer de manière plus rigoureuse à partir amplicons amorces individuelles, de quantifier la concentration de l&#39;amplicon de l&#39;échantillon individuel à l&#39;aide d&#39;un kit de quantification fluorométrique ADNdb, et précisément combiner des quantités équimolaires de chaque échantillon. Une fois une piscine amplicon bien équilibré est généré, il devient essentiel de mesurer soigneusement la concentration de la piscine. dilution soigneuse ultérieure et spike-in avec PhiX pour augmenter la complexité de lecture est essentielle pour obtenir des résultats optimaux de séquençage. séquenceurs à haut débit qui utilisent séquenCing par synthèse sont très sensibles à la densité de la grappe sur la cellule d&#39;écoulement. Chargement d&#39; une piscine bibliothèque qui est trop concentré se traduira par Redondance, avec des scores de qualité inférieure, la sortie de données inférieure, et démultiplexage inexactes 32. Chargement d&#39;une piscine bibliothèque qui est trop diluée se traduira également par la production de données à faible. Soigneusement quantifier la piscine de la bibliothèque avant le séquençage permettra d&#39;assurer des résultats optimaux. séquençage du gène ARNr 16S fournit une évaluation complète des bactéries présentes dans un échantillon donné et est une première étape absolument essentiel dans la production d&#39;hypothèse. La présence d&#39;un riche ensemble de métadonnées permet en outre aux chercheurs de tester les associations entre certaines espèces bactériennes et les facteurs biologiques importants. En outre, les mêmes informations 16S peut être utilisée pour déduire les fonctions bactériennes en utilisant des outils tels que PICRUSt 33. Le but ultime est d&#39;utiliser la caractérisation 16S pour identifier des associations nouvelles qui peuvent êtreen outre testé et validé dans des systèmes modèles, en ajoutant à notre compréhension croissante de l&#39;impact du microbiome bactérien sur la santé humaine et de la maladie.

Le tube humain faible reproduction, système gastro - intestinal, les voies respiratoires et la peau sont colonisées par des communautés bactériennes complexes qui sont essentielles pour le maintien de l&#39; homéostasie tissulaire et en soutenant la santé de l&#39;hôte 1. Par exemple, certains lactobacilles créer un environnement inhospitalier pour les agents pathogènes , en acidifiant la voûte vaginale, produisant effecteurs antimicrobiens et la modulation de l&#39; immunité d&#39;hôte local 2-4. L&#39;appréciation croissante de l&#39;importance du microbiome bactérien a également accru l&#39;intérêt pour la caractérisation des communautés bactériennes dans de nombreux contextes cliniques. Nous décrivons ici une méthode pour déterminer la composition du microbiome bactérienne des frottis génitaux. Le protocole peut être facilement modifié pour les échantillons de selles et des prélèvements provenant d&#39;autres emplacements anatomiques et d&#39;autres espèces hôtes. En raison des limites inhérentes au nombre d&#39;échantillons qui peuvent être collectées et stockées à partir d&#39;un plot donnéy participant, ce protocole a été conçu pour extraire l&#39; ADN, l&#39; ARN, et peut -être même protéine à partir d&#39; un tampon en utilisant une adaptation du phénol-chloroforme bourrelet raclée méthode basée sur 5,6. La combinaison de la perturbation physique des parois des cellules bactériennes avec un bourrelet de battage et de perturbation chimique avec des détergents permet la lyse rapide des bactéries Gram-positives, Gram-négatives, et acidorésistants sans étapes supplémentaires de digestion enzymatique. Afin d&#39;obtenir l&#39;ARN de haute qualité, il est recommandé d&#39;utiliser des tampons secs qui ont été conservés au niveau ou en dessous de 4 ° C immédiatement après le prélèvement et pendant le transport au laboratoire (le cas échéant), et à long terme conservés à -80 ° C. Pour déterminer le microbiome bactérien dans un échantillon donné, cette procédure utilise ARNr 16S séquençage de l&#39;amplicon du gène, qui est actuellement le moyen le plus rentable pour affecter globalement la taxonomie bactérienne et effectuer une quantification relative. Les méthodes alternatives incluent qPCR 7 ciblés, microarr personnaliséays 8, et l&#39; ensemble du séquençage du génome 9. Le gène ARNr 16S contient neuf régions hypervariables, et il n&#39;y a pas de consensus sur la région optimale de V à la séquence pour les études sur le microbiome vaginal. Ici , nous utilisons l&#39;ensemble d&#39; amorces 515F / 806R et de construire sur le pipeline conçu par Caporaso et al. , 10-12. Caporaso et al &#39;s. 515F / 806R ensemble d&#39; amorces permet le multiplexage de centaines d&#39;échantillons sur un seul passage de séquençage en raison de la disponibilité de milliers d&#39;amorces validées code - barres et la compatibilité avec les plates - formes de séquençage Illumina. Contrairement à 27F / 338R l&#39;amorce du projet microbiome humain défini 13, 515F / 806R amplifie aussi efficacement Bifidobacteriaceae et capture ainsi précisément Gardnerella vaginalis, un membre important de la communauté microbienne vaginale chez certaines femmes. En variante, une paire d&#39;amorces 338F / 806R est utilisé avec succès pour pyroséquençage des échantillons vaginaux 14 et une paire d&#39;amorces 515F / 926R a recently deviennent disponibles pour le séquençage de prochaine génération 12. Enfin, ce protocole donne des instructions de base pour effectuer une analyse de 16S amplicon utilisant les Insights quantitatives en écologie microbienne (QIIME) progiciel 15. la mise en œuvre réussie des commandes QIIME décrites ici donne un tableau contenant les abondances taxonomiques bactériens pour chaque échantillon. De nombreuses mesures supplémentaires de contrôle de la qualité, les méthodes de classification taxonomique, et les étapes d&#39;analyse peuvent être incorporés dans l&#39;analyse, comme décrit en détail sur le site QIIME (http://qiime.org/index.html). Si l&#39;analyse sera effectuée sur un ordinateur Apple, le paquet MacQIIME 16 permet une installation facile de QIIME et ses dépendances. Logiciels alternatifs pour 16S ARNr analyse de la séquence du gène comprennent mothur 17 et UPARSE 18.

<table><tbody><tr><td>Equipement :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Station de travail</td><td></td><td></td> PCR <td>N’importe quelle cagoule PCR peut être utilisée, par exemple l’AirClean 600.</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td></td><td></td><td>N’importe quel thermocycleur avec un couvercle chauffant peut être utilisé, par exemple MJ Research PTC-200.</td></tr><tr>Système <td></td><td></td><td>d’électrophorèse N’importe quel système d’électrophorèse peut être utilisé, par exemple le système d’électrophorèse Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel.</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Toute autre méthode de quantification de l’ADN sera suffisante</td></tr><tr><td>Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Une alternative est l’instrument Agilent 2200 TapeStation. Pas absolument nécessaire mais très utile.</td></tr><tr><td>MiSeq ou HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catch-All Sample Collection écouvillon</td><td>Epibio</td><td>QEC89100</td><td>D’autres écouvillons peuvent être utilisés, mais l’écouvillon fourre-tout est recommandé par le Human Microbiome Project.</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher</td><td>04-355-31</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de filtration SteriFlip 50 ml (0,22 & micro ; m)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>0,1 mm billes de verre</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 ml tubes à bouchon à vis</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td>Pour le battage des billes</td></tr><tr><td>UltraPure 5M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td>Biologie moléculaire Grade</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9856</td><td>Biologie moléculaire Grade</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9260G</td><td>Biologie moléculaire Grade</td></tr><tr><td>Dodécyl sulfate de sodium, solution à 20 %</td><td>Fisher</td><td>BP1311-200</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Eau distillée sans DNase/RNase</td><td>Ambion</td><td>10977-015</td><td>Biologie moléculaire Grade, pour la préparation de tampon</td></tr><tr><td>BioRéactif de 2-Propanol, pour la biologie moléculaire, &ge ; 99.5 %</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td>Biologie moléculaire Qualité</td></tr><tr><td>Phénol :Chloroforme :IAA, 25:24:1</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td>Avertissement :</td></tr><tr><td>Toxique 3 M Acétate de sodium, pH 5.5</td><td>Life Technologies</td><td>AM9740</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Grade Pince jetable en polystyrène stérile, PS</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06443-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml, transparent, tubes propres PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>22364120</tr><tr><td>Eau de qualité PCR</td><td>MoBio</td><td>17000-11</td><td>Pour PCR</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Sigma</td><td>D7295-0.5mL</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8-tube avec bouchons plats transparents attachés, naturel</td><td>USA Scientific</td><td>1492-3900</td><td>Toutes les bandelettes de 8 tubes qui sont sans volonté de DNase, RNase, ADN et inhibiteur de PCR work</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3121-25</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE buffer</td><td>Lonza</td><td>51216</td><td></td></tr><tr><td>DNA gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA Loading Dye</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>50 bp GeneRuler Ladder</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>SM0373</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep Kit ADN/ARN</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage PCR UltraClean</td><td>MoBio</td><td>12500-100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td>Une alternative est Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Amorces :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>515F (amorce avant) 5'-AATGATACGGCGACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'Commande</td><td></td><td></td> <td>à 100 nmole ; Purification : Dessalage standard. Remettre en suspension à 100 &micro ;M. **Critical : les amorces doivent être remises en suspension avec de l’eau de qualité PCR MoBio (voir ci-dessus) dans une hotte pour éviter toute contamination.**</td></tr><tr><td>Reverse primeurs, voir le fichier de code supplémentaire et : ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt</td><td>IDT est recommandé</td><td></td><td>Si vous commandez de grands ensembles d’amorces, commandez sous forme de plaque à 96 puits à l’échelle de 100 nmole. Remise en suspension à 100 &mu ;M. Instructions complètes pour la commande de l’amorce et la remise en suspension à http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc.&nbsp ; **Critical : les amorces doivent être remises en suspension avec de l’eau de qualité MoBio PCR (voir ci-dessus) dans une hotte pour éviter toute contamination.**</td></tr><tr><td>Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GT GT CCA GCM GCC GCG GTA A-3'25</td><td></td><td></td> <td>nmole ; Purification : Dessalage standard. Remise en suspension à 100 &micro ;M.</td></tr><tr><td>Lire 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'26</td><td></td><td></td> <td>nmole ; Purification : Dessalage standard. Remise en suspension à 100 &micro ;M.</td></tr><tr><td>Index Sequençage Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3'27</td><td></td><td></td> <td>nmole ; Purification : Dessalage standard. Remise en suspension à 100 &micro ;M.</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>Requis si le séquençage est effectué en interne. Si le séquençage sera effectué par un centre de séquençage tiers, il disposera déjà de PhiX.</td></tr></tbody></table>

l&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;arnr 16s bactérien pour séquençage génique communautaire caractérisation

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Il y a une prise de conscience croissante du rôle des communautés microbiennes en tant que modulateurs critiques de la santé humaine et la maladie. technologies de séquençage à haut débit ont permis la caractérisation rapide et efficace des populations bactériennes en utilisant le séquençage de l&#39;ARNr 16S des gènes à partir d&#39;une variété de sources. Bien que les outils facilement disponibles pour l&#39;analyse de séquence ARNr 16S ont des flux de travail de calcul normalisées, le traitement des échantillons d&#39;extraction d&#39;ADN reste une source continue de la variabilité entre les études. Nous décrivons ici une méthode efficace, robuste et rentable pour extraire l&#39;acide nucléique à partir des prélèvements. Nous délimiter également des procédés en aval pour le séquençage du gène 16S ARNr, y compris la génération de bibliothèques de séquençage, le contrôle de la qualité des données et l&#39;analyse des séquences. Le flux de travail peut accueillir des échantillons multiples types, y compris les selles et les écouvillons collectés à partir d&#39;une variété d&#39;emplacements anatomiques et les espèces hôtes. En outre, récupéré ADN et l&#39;ARN peut être séparé et utilisépour d&#39;autres applications, y compris le séquençage du génome entier ou de l&#39;ARN-seq. La méthode décrite permet une approche de traitement commun pour les types d&#39;échantillons multiples et accueille l&#39;analyse en aval de l&#39;information génomique, métagénomique et de la transcription.

<html> L&#39;aperçu général du protocole, qui permet la détermination des abondances bactériennes par rapport à partir d&#39; un écouvillon utilisant ARNr 16S séquençage du gène, est représenté sur la figure 1 du protocole .Le a été optimisé pour les prélèvements vaginaux humains, mais peut être facilement adapté pour la plupart des sites muqueux d&#39;échantillonnage et d&#39; autres hôtes. la figure 2 montre l&#39;ADN de haute qualité et de l&#39; ARN qui peut être isolé à l&#39; aide du protocole de perles raclée. la figure 3 illustre une amplification par PCR réussie de 12 échantillons, où chaque amplification avec un échantillon produit une bande unique forte du bon taille et chaque contrôle de l&#39; eau n&#39;a donné une bande. la figure 4 illustre la quantification du pool de bibliothèque finale avant le séquençage. la figure 5 montre un profil typique de qualité de la séquence après une seule fin de 300 pb MiSeq terme. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53939 / 53939fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Schéma Vue d&#39; ensemble du protocole. Tout d&#39; abord, l&#39; acide nucléique est extrait d&#39;un écouvillon en bourrelet raclée dans une solution tampon contenant du phénol, de chloroforme et d&#39;alcool isoamylique. région variable 4 du gène de l&#39;ARNr 16S est ensuite amplifié à partir de l&#39;acide nucléique obtenu par PCR. amplicons PCR provenant jusqu&#39;à des centaines d&#39;échantillons sont ensuite combinés et séquencées sur un seul terme. Les séquences résultantes sont adaptées à une base de données de référence pour déterminer les abondances bactériennes relatives. Le protocole complet peut être effectué en environ trois jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig2.jpg" /> Figure 2. haute qualité Nucleic Acid Extrait Utilisation du Phénol: Perle Chloroforme Beating Méthode. (A) la qualité de l&#39; ADN, comme évalué à l&#39; aide d&#39; un spectrophotomètre. Un rapport A260 / A280 entre 1,8 et 2,0 indique l&#39; acide nucléique pur qui ne soit pas contaminé avec du phénol ou d&#39;une protéine. (B) Après une colonne de nettoyage, ce protocole peut donner l&#39; ARN de haute qualité, indiqué par de forts pics 16S et 23S. (C) dégradation de l&#39; ARN peut se produire si l&#39;échantillon n&#39;a pas été conservé au froid après la collecte (pendant le transport et le stockage) ou si RNases sont présents au cours du traitement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig3.jpg" /> Figure 3. Confirmation du succès ARNr 16S Gene Amplification Utilisation du 515F et Barcoded 806R Primer Set. Top électrophorèse sur gel) est utilisé pour confirmer la présence d&#39;une seule bande autour de 380 paires de bases in chaque échantillon qui a été amplifié avec le modèle. L&#39;absence d&#39;une bande indique une amplification sans succès; cela est généralement dû à une erreur humaine et la réaction PCR à partir de cet échantillon doit être répété. Bottom) Aucun modèle (eau) contrôles fonctionner en parallèle avec la même paire d&#39;amorces ne devraient pas avoir une bande présente. La présence d&#39;une bande dans le contrôle de l&#39;eau indique des réactifs contaminés; jeter les réactifs qui peuvent être contaminés et re-faire les amplifications PCR à la fois du modèle et de l&#39; eau de contrôle pour cette paire d&#39;amorces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig4.jpg" /> Figure 4. Quantification de la concentration finale Bibliothèque Piscine et Validation de la taille de la bibliothèque. Après la mise en commun des amplicons d&#39;échantillons individuels, econcentration e de la piscine de la bibliothèque finale doit être déterminée. La piscine de la bibliothèque doit ensuite être diluée pour obtenir une concentration de 2 nM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig5.jpg" /> Figure 5. Représentant Bar Terrain de la séquence de qualité Scores à chaque position de la lecture. Il est normal que la qualité de la séquence d&#39;abandonner après 200 paires de bases, mais le score de qualité moyenne devrait rester au- dessus 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> #SampleID </td><td colspan="2"> code à barre <br/&gt; Séquence </td><td colspan="3"> LinkerPrimer Séquence </td><td> rcbcPrimer </td><td> Échantillons </td><td> Extraction Lot </td><td> Amplification assiette </td><td> La description </td></tr><tr><td> fichier #An exemple de cartographie peut être trouvé à: http://qiime.org/_static/Examples/File_ Formats / Exemple_ Mapping_ Fichier.txt </td><td colspan="2"></td><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> AG2350 </td><td colspan="2"> TCCCTTGTCTCC </td><td colspan="3"> CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT </td><td> rcbc000 </td><td> Cervical Écouvillon </td><td> 1 </td><td> UNE </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Mapping fichier Template. Creating un fichier précis et exhaustif de cartographie est essentielle pour exécuter avec succès le protocole. Le fichier de mappage est non seulement nécessaire pour exécuter QIIME, mais il permet également aux chercheurs de maintenir le lien entre le code - barres de l&#39; échantillon et des métadonnées, pour analyser les données pour les biais systématiques (par exemple, variation de lot à lot), et de déterminer corrélations intéressantes entre les métadonnées et les populations bactériennes. Un fichier de mappage bare-bones est fourni, mais les utilisateurs sont encouragés à ajouter autant de colonnes contenant des métadonnées que possible. Des exemples de métadonnées supplémentaires pour un prélèvement vaginal comprend l&#39;âge, la date / heure de la collecte de l&#39;écouvillon, le type de contraceptif hormonal (le cas échéant), les résultats des tests d&#39;infection sexuellement transmissibles, etc. du participant <img alt="suppliment 1" src="/files/ftp_upload/53939/53939suppliment.jpg" /> Supplemental fichier 1. Liste des Barcoded Amorce Sequences 10 </sup&gt;. Les trois premières colonnes peuvent être utilisés pour compléter le fichier de mappage, et la dernière colonne fournit la séquence d&#39;amorce entière à des fins de commande. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous décrivons une méthode efficace, robuste et rentable pour extraire l&#39;acide nucléique à partir des prélèvements pour la caractérisation des communautés bactériennes en utilisant ARNr 16S séquençage de l&#39;amplicon du gène. La méthode permet une approche de traitement commun pour les types d&#39;échantillons multiples et peut accueillir un certain nombre de processus d&#39;analyse en aval.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler de l'ADN et de l'ARN de haute qualité à partir de prélèvements par écouvillon, puis de déterminer leur composition bactérienne à l'aide du séquençage du gène de l'ARNr 16S. Cette méthode peut aider un chercheur à identifier les bactéries présentes dans un échantillon humain donné et à établir des associations entre certaines bactéries et les caractéristiques de l'hôte ou l'état pathologique. Bien que cette méthode ait été conçue pour fournir des informations sur les communautés bactériennes vaginales humaines, elle peut également être utilisée pour étudier les communautés bactériennes provenant d'autres sites corporels, tels que les narines, la bouche, la peau et le rectum, ainsi que celles d'autres organismes.Remarquez que cette vidéo met en évidence les parties les plus délicates du protocole et ne couvre pas la séquençage ni l'analyse des données de séquençage. Brittany Bowman, technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration. Commencez cette procédure avec des prélèvements cervicaux externes recueillis et conservés sur de la glace fondante, comme décrit dans le document accompagnant.Pour la préparation de l'extraction des acides nucléiques, nettoyez toutes les surfaces de la hotte ainsi que tous les objets introduits dans celle-ci à l’aide d’une solution d’eau de Javel, suivie d’un agent de décontamination éliminant les RNases, les DNases et l’ADN. Dans la hotte, placez un tube de broyage par échantillon. Ajoutez à chaque tube 500 microlitres de tampon NaCl-Tris-EDTA, 210 microlitres de SDS à 20 % et 500 microlitres de phénol-chloroforme-alcool isoamylique.Une manipulation soigneuse des écouvillons est essentielle pour obtenir des résultats clairs avec ce protocole. Il faut un peu de pratique pour transférer l'écouvillon sans le laisser tomber, et c'est plus facile si vous utilisez un écouvillon à manche creux comme celui-ci. À l’aide de pinces stériles, transférez l’écouvillon du flacon de transport vers le tube contenant les billes de broyage.Frottez soigneusement la tête du prélèvement contre les parois internes du tube pendant au moins 30 secondes. Placez le tube sur de la glace. Ensuite, changez de gants et répétez la procédure de prélèvement avec l'échantillon suivant.Une fois que tous les échantillons ont été vigoureusement frottés, laissez-les refroidir sur de la glace pendant au moins 10 minutes. Après 10 minutes, pour retirer le prélèvement, tenez le manche avec des pinces stériles et, à l’aide d’une pointe P200 propre, appuyez la tête contre la paroi interne du tube. Ce processus libérera le liquide du prélèvement, augmentant ainsi la récupération des acides nucléiques.Placer le tube de billes dans le batteur à billes et homogénéiser l'échantillon pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifuger le tube de billes à 6 000 g et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes afin de former un culot avec les débris et séparer les phases aqueuse et phénolique. Après la centrifugation, on peut généralement observer trois phases.La couche supérieure est la phase aqueuse, contenant l'ADN et l'ARN. La couche inférieure est la phase organique, contenant les lipides et les débris cellulaires provenant des cellules et des écouvillons. La fine couche intermédiaire blanche, appelée interphase, contient les protéines.Transférez la phase aqueuse, d’environ 500 à 600 microlitres, dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Ajoutez un volume équivalent de phénol-chloroforme-alcool isoamylique. Mélangez par retournements successifs et vortexage bref.Centrifuger le tube pendant cinq minutes. Après la centrifugation, transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube stérile de 1,5 millilitre. Veiller à ne pas transférer de matériau provenant de l'interphase ou de la phase phénolique sous-jacente.Noter le volume transféré et conserver la phase phénolique pour une isolation ultérieure des protéines. Ensuite, ajouter 0,8 volume d'isopropanol et 0,1 volume d'acétate de sodium trois molaire. Mélanger soigneusement par retournement et vortexer brièvement.Précipitez l'acide nucléique en refroidissant le tube à 20 degrés Celsius pendant au moins deux heures, voire toute une nuit. Après la précipitation, centrifugez le tube pendant 30 minutes. À l'issue de la centrifugation, utilisez soigneusement une pipette pour éliminer le surnageant, en laissant le culot intact.Ajouter 500 microlitres d'éthanol à 100 %. Détacher le culot par vortexage doux ou pipetage, sans toucher le culot. Centrifuger pendant cinq minutes.À l’aide d’une pipette P10, retirez et jetez le plus d’éthanol possible sans perturber le culot. Laissez sécher le culot à l’air à température ambiante pendant 15 minutes. Remettez le culot en suspension dans 20 microlitres de tampon UltraPure 0,1X-Tris-EDTA.Laisser refroidir l'échantillon sur de la glace pendant 10 minutes et pipeter plusieurs fois pour assurer une resuspension complète. Mesurer la concentration en acides nucléiques à l'aide d'un spectrophotomètre. Si désiré, séparer l'ADN de l'ARN à l'aide d'un kit de purification sur colonne, en suivant le protocole du fabricant.La préparation de la PCR est une étape cruciale de cette procédure. Il est très important de minimiser les contaminations en assurant la stérilité des réactifs, de la hotte PCR et des gants. Travaillez rapidement mais avec précaution, et utilisez une technique appropriée lors du déplacement des éléments dans et hors de la hotte.Placer une grille de refroidissement pour tubes de microcentrifugeuse et une grille de refroidissement pour plaque PCR sur le banc propre dans la hotte. Étiqueter des tubes en bande de 8 puits avec des bouchons individuels et les placer dans le refroidisseur PCR. L'amplification doit être effectuée en triple exemplaire, et un témoin négatif sans matrice (eau) doit être inclus pour chaque paire d'amorces.Placer un tube de microcentrifugeuse dans le réfrigérateur pour le mélange maître. Ensuite, pour chaque échantillon, combiner l'eau UltraPure, le tampon HF 5X, les dNTP, l'amorce 515F sens, et le DMSO à 3 % comme indiqué dans le document accompagnant. Puis, ajouter la polymérase au mélange maître et homogénéiser par pipetage.Au premier puits, ajouter 90 microlitres du mélange maître et 2 microlitres de l'amorce reverse, puis mélanger soigneusement. Ensuite, au quatrième puits, qui sert de contrôle sans matrice, ajouter 23 microlitres du mélange maître et 2 microlitres d'eau, puis mélanger. Puis, ajouter 6 microlitres de l'échantillon approprié au premier puits.Mélanger soigneusement et transférer 25 microlitres dans le deuxième puits. Changer les embouts, puis transférer encore 25 microlitres depuis le premier puits vers le troisième puits. Boucher fermement chaque puits.Veillez à ne pas toucher l'intérieur des puits ou du capuchon. Ensuite, répétez ce processus pour chaque échantillon. Une fois tous les échantillons préparés, effectuez une brève centrifugation des bandes de tubes, transférez-les vers un thermocycleur et lancez le programme.Une fois l'analyse terminée, faire tourner rapidement les tubes afin de récupérer le liquide des parois. Ensuite, sur un banc de laboratoire propre, rassembler les réactions PCR en tripleté de chaque échantillon dans un tube microcentrifuge stérile étiqueté. Transférer 25 microlitres de chaque témoin sans matrice dans un tube stérile séparé.Ne pas encore combiner les amplicons provenant d'échantillons différents. Pour valider une amplification PCR réussie, charger cinq microlitres de chaque échantillon sur un gel d'agarose à 1,5 % et réaliser l'électrophorèse à 120 volts pendant 30 à 60 minutes. Observer le gel sous lumière UV.Vérifiez l'amplification réussie de chaque échantillon en observant une seule bande intense d'environ 380 paires de bases. S'il y a une double bande, réamplifiez l'échantillon avec une séquence reverse différente. S'il n'y a aucune bande du tout, réamplifiez l'échantillon en utilisant soit la même séquence reverse, soit un amorçage avec une nouvelle séquence reverse.Si la réamplification échoue, des inhibiteurs de la PCR peuvent être présents dans l'échantillon ; dans ce cas, effectuez un nettoyage de l'ADN par colonne pour éliminer les inhibiteurs de la PCR. Conservez les 70 microlitres restants d'amplicon à 20 degrés Celsius. Jetez les 20 microlitres restants du témoin sans matrice, en supposant qu'aucun fragment n'ait été obtenu.Pour créer le pool d'amplicons, combinez deux à cinq microlitres de chaque amplicon dans un tube stérile unique. Si la bande d'un échantillon est faible, ajoutez un volume double par rapport aux autres échantillons. Ensuite, éliminez les amorces de PCR à l'aide d'un kit.Si applicable, combiner les pools d'amplicons sans amorces pour créer la bibliothèque finale. Déterminer la concentration en ADN de la bibliothèque à l'aide d'un spectrophotomètre ou d'un système fluorométrique. Enfin, diluer les échantillons à deux nanomolaires et les envoyer pour séquençage.Des informations détaillées sur l'analyse des séquences sont fournies dans le document accompagnant. De l'ADN et de l'ARN de haute qualité ont été isolés, et l'ADN a été utilisé comme matrice pour l'amplification par PCR de la région V4 du gène ARNr 16S, comme décrit dans cette vidéo. L'électrophorèse sur gel a été utilisée pour confirmer la présence d'une seule bande d'environ 380 paires de bases dans chaque échantillon qui avait été amplifié avec la matrice.Les témoins sans matrice, réalisés en parallèle avec la même paire d'amorces, ne présentaient aucune bande. Les amplicons PCR ont ensuite été regroupés dans un même tube, quantifiés et davantage dilués avant le séquençage. On observe ici un graphique à barres représentatif des scores de qualité des séquences à chaque position de la lecture.Il est normal que la qualité de la séquence diminue après 200 paires de bases. Toutefois, le score de qualité moyen doit rester supérieur à 30. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler l'ADN et l'ARN à partir de prélèvements au moyen d'une extraction basée sur le phénol-chloroforme, amplifier la région V4 du gène de l'ARN ribosomique 16SR et préparer une bibliothèque pour un séquençage à haut débit.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de prendre de grandes précautions pour éviter toute contamination lors du prélèvement des échantillons, de l'extraction des acides nucléiques et de l'amplification par PCR. N'oubliez pas que le travail avec le phénol-chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler sous une hotte ventilée, porter des gants imperméables, des lunettes de sécurité avec écrans latéraux et une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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La spectrométrie de masse à temps de vol laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) et les techniques moléculaires (séquençage du gène de l’ARNr 16S) permettent d’identifier des pathogènes bactériens rares dans les diagnostics de routine. L’objectif de ce protocole réside dans la combinaison des deux techniques qui permet d’obtenir des données plus précises et plus fiables.

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

Un protocole permettant de quantifier les gènes et les transcrits de l’ARNr bactérien 16S des sédiments côtiers par PCR en temps réel est fourni. La méthodologie comprend la co-extraction de l’ADN et de l’ARN ; préparation d’ARN libre d’ADN ; et la quantification du gène et du transcrit de l’ARNr 16S par RT-q-PCR, y compris la construction de la courbe standard.

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Ce manuscrit décrit un protocole normalisé détaillé du séquençage de haut débit 16 s rRNA-amplicon. Le protocole introduit un protocole intégré, en uniforme, possible et peu coûteux à partir de prélèvement d’échantillons fécaux au moyen d’analyses de données. Ce protocole permet l’analyse d’un grand nombre d’échantillons contenant des normes rigoureuses et plusieurs contrôles.

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Nous décrivons ici un protocole pour obtenir des données de séquence amplicon du sol, la rhizosphère et racine endosphère microbiomes. Cette information peut être utilisée pour étudier la composition et la diversité des communautés microbiennes associées aux plantes et est adaptée pour l’utilisation avec un large éventail d’espèces végétales.

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Nous présentons ici un protocole de séquençage de nouvelle génération pour le séquençage d’ARNr 16 s qui permet l’identification et la caractérisation des communautés microbiennes dans les vecteurs. Cette méthode implique l’extraction ADN, l’amplification et codes à barres d’échantillons par PCR, séquençage sur une cellule d’écoulement et la bioinformatique pour faire correspondre les données sur les séquences d’information phylogénétique.

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Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.

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