Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

L’objectif global de l’expérience suivante est de valider l’utilisation d’une souche exprimant la luciférase pour la surveillance non invasive de la formation de biofilms in vivo par des cellules de candida albican. Ceci est réalisé en implantant des fragments de cathéter colonisés par une souche exprimant la luciférase de candida albicans dans le dos d’une souris. Au cours de la deuxième étape, la levure est laissée se développer en une épaisse couche de cellules intégrées dans une matrice extracellulaire, générant un biofilm mature à l’intérieur des cathéters.

Ensuite, un substrat est ajouté qui sera converti par l’enzyme luciférase. Cette réaction produit une lumière mesurable L’imagerie bioluminescente ou BLI est ensuite utilisée pour enregistrer et quantifier la formation du biofilm au sein de l’hôte vivant. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres techniques existantes, telles que le système central Venmo, est que nous pouvons tester jusqu’à six biofilms à l’intérieur d’un animal, réduisant ainsi considérablement le nombre d’animaux dont nous avons besoin pour l’analyse statistique.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de la formation du biofilm de Candida albicans, car notre méthode permet de tester facilement les composants antifongiques existants et nouveaux. En outre, cette méthode peut donner un aperçu du candida albicans, des biofilms fongiques. Il peut également être appliqué à d’autres microbes comme les bactéries ou d’autres espèces amusantes.

Les procédures proposées sont faciles à mettre en œuvre dans tout laboratoire qui a accès à une animalerie 24 heures avant l’intervention chirurgicale et qui a ouvert l’emballage contenant les cathéters à triple lumière dans une enceinte de sécurité biologique. Utilisez une pince à épiler stérile pour enlever toutes les parties inutiles et un scalpel stérile pour couper la partie attachée au cathéter. Placez ensuite une règle sous l’emballage en plastique et coupez le cathéter en polyuréthane en morceaux d’un centimètre de long.

Ensuite, remplissez chaque cathéter avec environ 1,8 millilitre de sérum de veau fœtal à 100 % et incubez les morceaux à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez chaque pièce de cathéter revêtue de sérum dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,5 millilitre, et grattez C albicans d’une plaque A YPD en un millilitre de PBS dans un microtube à centrifuger séparé à une dilution de un à 100. Après le comptage, diluez la suspension cellulaire à une concentration finale de cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre.

Et ajoutez un millilitre de cellules à chacune des pièces de cathéter recouvertes de sérum. Laissez les cellules adhérer aux cathéters pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, tenez les tubes en position verticale avec une pince à épiler stérile.

Rincez doucement chaque pièce à travers la lumière deux fois avec un millilitre de PBS pour placer les cathéters. Commencez par raser le bas du dos d’une souris anesthésiée de huit semaines positionnée sur un coussin chauffant. Ensuite, désinfectez la peau et faites une petite incision de 0,5 à un centimètre de chaque côté de l’animal.

Ensuite, disséquez le subcu avec des ciseaux pour créer deux tunnels sous-cutanés d’environ 1,5 centimètre de long et un centimètre de large. Insérez trois pièces de cathéter dans chaque tunnel en veillant à ce qu’elles soient placées les unes à côté des autres dans une disposition horizontale sans se chevaucher. Fermez les incisions avec des sutures puis nettoyez les plaies très doucement avec un désinfectant.

Ensuite, appliquez un anesthésique local directement sur les incisions et administrez un agent d’inversion de l’anesthésie en surveillant les animaux jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis. Pour imager la formation du biofilm au moment expérimental approprié, injectez 100 microlitres de stérilet et de térézine fraîchement préparés par voie sous-cutanée dans chaque zone contenant les cathéters chez un animal anesthésié. Acquérez ensuite des balayages consécutifs avec des temps d’acquisition allant de 20 à 60 secondes jusqu’à ce que l’intensité maximale du signal soit atteinte.

Lors de l’acquisition de l’image suivante, placez une région d’intérêt sur chaque trio de cathéters pour mesurer l’imagerie bioluminescente ou l’intensité du signal BLI des images précédemment acquises. Placez également une région d’intérêt rectangulaire de taille fixe sur une région de contrôle pour mesurer le signal d’arrière-plan dans un logiciel d’image vivante. Mesurez le flux de photons à travers les régions d’intérêt pour chaque trio de cathéters ainsi que pour l’arrière-plan.

Après avoir répété ces mesures pour chaque animal et à différents moments pendant le rapport de formation du biofilm, l’intensité du signal BLI de chaque trio de cathéters est exprimée en flux de photons par seconde. Les données peuvent être copiées et collées directement dans un tableur. À la fin de l’expérience longitudinale, sacrifiez chaque animal coupé dans le tissu sous-cutané et utilisez une pince à épiler stérile pour retirer les fragments de cathéter un par un.

Lavez les cathéters deux fois dans un millilitre de PBS comme nous venons de le démontrer. Ensuite, sioninez les pièces dans un nouveau microtube de centrifugation dans un millilitre de PBS frais à 40 000 hertz dans un bain-marie. Sonicate après 10 minutes, placez les tubes contenant les cathéters sur de la glace et placez 100 microlitres des échantillons originaux à une à 10 dilutions et une à 100 sur des plaques de gélose YPD.

En double. Enfin, tracez la moyenne et l’écart-type des unités formant une colonie. Et signal BLI pour chaque animal sur une échelle logarithmique.

Sur cette image, un animal représentatif affichant le signal de bioluminescence ainsi qu’une région d’intérêt dénotée six jours après le développement du biofilm est montré. Notez l’absence de signalisation dans la zone de fond de contrôle confirmant la limitation du biofilm aux zones immédiatement adjacentes aux cathéters recouverts de candida. Dans cette expérience représentative, on peut observer un signal BLI clair produit par les biofilms exprimant la luciférase, alors que seul le signal de fond semble être produit par la souche de type sauvage.

Cette augmentation du signal suit la même tendance que l’augmentation des unités formant des colonies par biofilm et les mesures de flux de photons pour chaque groupe d’animaux pris ensemble. Ces données illustrent que la BLI est une technique puissante pour surveiller et quantifier la formation in vivo de biofilms matures de C albicans dans un modèle murin sous-cutané. Une fois maîtrisé, l’infection des dispositifs par des cellules de candida peut prendre deux heures, tandis que l’implantation du cathéter peut être réalisée en 10 minutes par souris.

L’imagerie BLI peut être réalisée en cinq minutes par souris. Le grand avantage de l’utilisation du BLI est que vous pouvez surveiller le développement de la biomasse et du biofilm à plusieurs reprises chez le même animal. Au fil du temps Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’IRM ou la tomodensitométrie peuvent fournir des informations sur la position exacte de la cathédrale.

Ces informations peuvent ensuite être utilisées pour la quantification dans des modèles plus complexes comme le modèle de la cathédrale de la veine profonde. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon de réaliser in vivo, le biofilm sous-cutané, le ss chez la souris, et cela peut constituer la base d’une analyse plus approfondie des interactions hôte-pathogène.