Name: Candida albicans biofilm développement sur les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez la formation de biofilms de Candida albicans chez la souris par imagerie bioluminescente. Cette méthode permet de quantifier l'infection fongique in vivo et d'évaluer l'efficacité des traitements antifongiques.

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Ce travail a été soutenu par la KU Leuven PF 'IMIR', la communauté de recherche FWO sur la biologie et l’écologie des biofilms bactériens et fongiques (FWO : WO.026.11N) et par le projet FWO G.0804.11. SK remercie chaleureusement la KU Leuven pour la bourse PDMK 11/089 et la FWO pour la bourse postdoctorale. Nous sommes reconnaissants à Nico Vangoethem pour son aide dans la préparation des figurines. Nous tenons à remercier Celia Lobo Romero pour son assistance technique lors des procédures expérimentales in vivo.

NOTE: Toutes les expériences animales ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de la KU Leuven (numéro de projet 090/2013). Maintenir les animaux conformément aux lignes directrices de soins aux animaux KU Leuven. 1. C. albicans Croissance <ol><li> Vingt-quatre heures avant le début de l&#39;expérience animale, préparer des boîtes de YPD en ajoutant 10 g d&#39;extrait de levure de granules, 20 g de peptone bactériologique, et 15 g d&#39;agar granulé. Maquillage volume à 900 ml avec de l&#39;eau Milli-Q et autoclave. </li><li> Ajouter 50 ml de 40% de glucose stérile. Bien mélanger et verser dans des boîtes de Pétri. Laissez plaques d&#39;agar refroidir et se solidifier. NOTE: Dans cette étude, utiliser deux souches de type sauvage, à savoir C. albicans SC5314 - GLUC souche négative (dénommé WT) et C. albicans SKCA23 souche, qui est un type sauvage C. albicans SC5314 transformée avec Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 .Dans cette souche (nommé SKCA23- ACTgLuc) Gluc a été fusionné au gène endogène PGA59 sous le contrôle de ACT1 (actine) promoteur (ce promoteur est actif dans la levure, ainsi que l&#39;étape de croissance des hyphes fongiques). Cette souche peut être demandé au laboratoire du professeur Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgique. Plasmide Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 a été gracieusement offert par le professeur C. d&#39;Enfert, Institut Pasteur, Paris, France. </li><li> Maintenir les deux souches de stock de glycérol et conserver à -80 ° C. </li><li> Avant toute expérience souches à balayage sur une plaque YPD. Incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 2. Préparation cathéter Pieces <ol><li> Avant l&#39;expérience, déterminer le nombre de cathéters sont nécessaires. Il est possible d&#39;implanter jusqu&#39;à six morceaux de cathéters par souris (3 cathéters à gauche et trois cathéter sur le côté droit de l&#39;animal (Figure 2A). </li><li> Vingt-quatre heures avant la chirurgie animale, ouvrez le packâge contenant triple cathéter à sous le cabinet de sécurité biologique. Retirez toutes les pièces inutiles avec pinces stériles et coupez la partie attachée au cathéter avec un scalpel stérile. Placez la règle sous le paquet en plastique et couper des morceaux de cathéter de polyuréthane d&#39;exactement 1 cm selon l&#39;échelle sur la règle (Figure 1). NOTE: Il est important de mentionner que ce type de pièce de cathéter ne est pas phosphorescente et donc approprié pour BLI 18,19. </li><li> Placez un maximum de 15 pièces de cathéter de coupe (étape. 2.2) dans 2 ml microtubes. Toujours préparer trois morceaux supplémentaires, qui sont utilisés pour énumérer la quantité de cellules de Candida attachés sur le dispositif après la période d&#39;adhésion. </li><li> Supplément cathéters à environ 1,8 ml de 100% de sérum bovin fœtal (FBS). </li><li> Vigoureusement vortex et ajouter d&#39;autres 100-200 pi de 100% de FBS. Couvrir complètement toutes les pièces de cathéter avec du sérum. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant une nuit. </li&gt; </ol> 3. Les animaux et la suppression du système immunitaire <ol><li> Gardez Female souris BALB / c (environ huit semaines d&#39;âge) dans les cages individuellement ventilées haut de filtres avec un accès libre à la nourriture standard et de l&#39;eau ad libitum. </li><li> Initier la suppression de système immunitaire 24 heures avant la chirurgie des animaux par l&#39;addition de dexaméthasone (0,4 mg / L) dans l&#39;eau de boisson des animaux. Afin d&#39;éviter toute contamination bactérienne de l&#39;hôte, de compléter l&#39;eau de boisson avec un antibiotique, par exemple, l&#39;ampicilline de sodium en poudre (0,5 g / L). </li><li> Gardez immunosuppression des animaux pendant toute l&#39;expérience (jusqu&#39;à 6 jours). </li></ol> 4. Substrats de polyuréthane ex vivo C. albicans Adhérence sur FBS revêtues <ol><li> Transférer chaque pièce de cathéter enduites de sérum dans un nouveau tube de 1,5 ml à centrifuger. </li><li> Grattez un certain C. albicans cellules cultivées sur des plaques YPD (étape 1) et les suspendre dans 1 ml de PBS. </li><li> Diluer Cancellules Dida (1: 100) dans un tube à centrifuger séparée. Prendre 10 pl de l&#39;échantillon dilué et de l&#39;appliquer sur une chambre de comptage de cellules. Comptez au moins 16 petits carrés. </li><li> Préparer cellules de Candida (chaque souche séparément) dans du milieu RPMI 1640 à une concentration finale de 5 x 10 4 cellules / ml. </li><li> Ajouter 1 ml de suspension cellulaire à chaque élément de cathéter enduites de sérum. </li><li> Vigoureusement Vortex et se assurer que les cathéters sont immergés dans le milieu et non flottant au-dessus. </li><li> Incuber les cathéters à 37 ° C pendant 90 minutes (durée de l&#39;adhérence). </li><li> Retirer les cathéters avec pinces stériles et les laver deux fois avec 1 ml de PBS. Au cours de cette étape se assurer que le fluide de lavage passe à travers la lumière du cathéter en le mettant en position verticale pendant le rinçage très doucement les cathéters. Surtout, ne pas utiliser un fort débit qui peut conduire à l&#39;élimination des cellules attachées. </li><li> Transférer chaque cathéter lavé pour un microtube propre (une pièce par tuêtre). </li><li> Placez sur la glace et y tenir jusqu&#39;à ce que la chirurgie. </li></ol> 5. Anesthésie <ol><li> Préparer anesthésie en mélangeant 75 ul de kétamine (100 mg / ml) avec 100 ul de médétomidine (1 mg / ml) et 825 ul de solution saline stérile. Administrer par voie intraperitoneale (ip) de 60 à 80 pl de cocktail anesthésiant par 10 g de poids corporel, résultant en une dose de 45-60 mg / kg de kétamine et de 0,6 à 0,8 mg / kg de médétomidine. </li><li> Par inversion de l&#39;anesthésie, diluer 50 ul atipamézole (5 mg / ml) dans 4,95 ml de solution saline, d&#39;administrer ip 100 ul par 10 g de poids corporel comme antidote, d&#39;où une dose de 0,5 mg / kg. </li><li> Après l&#39;injection de l&#39;anesthésie, placer l&#39;animal dans une cage séparée et attendre jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit totalement endormi. </li><li> Confirmer le bon anesthésie de l&#39;animal par pincement de la peau claire et pincement de l&#39;orteil, qui ne cause pas de dommages à la peau. Tout mouvement observé indique que l&#39;animal ne est pas suffisamment anesthésiée à pratiquer la chirurgie. Si cela se produit, attendez un couple de minutes de plus jusqu&#39;à ce que l&#39;animal ne montre pas de signes de mouvement sur la peau ou pincement de l&#39;orteil. </li></ol> 6. chirurgie animale <ol><li> Transfert anesthésié l&#39;animal de la cage sur un tissu propre placée sur le coussin chauffant, pré-chauffé à 37 ° C (figure 2A, (1)). NOTE: Une alternative moins coûteuse est d&#39;utiliser les couvertures chauffantes. Il est également possible d&#39;utiliser des serviettes isothermes, qui doivent être réchauffés au micro-ondes avant la chirurgie des animaux. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux. </li><li> Raser le bas du dos de l&#39;animal avec un rasoir électrique. Retirez tous les poils d&#39;animaux et de transférer des animaux sur un tissu propre. Désinfecter la peau (par exemple, 1% d&#39;isopropanol avec de l&#39;iode ou 0,5% de chlorhexidine à 70% d&#39;alcool) et quitter la zone désinfecté à sécher pendant environ 1 min (Figure 2A, (2)). </li><li> Faire une petite incision dans la peau (un à gauche et l&#39;autre sur le côté droit de l&#39;animal) (environ 0,5 &amp;# 8211; 1 cm) (Figure 2A, (3)). </li><li> Disséquer l&#39;hypoderme avec une paire de ciseaux pour créer deux tunnels sous-cutanées. Chaque tunnel devrait être d&#39;environ 1,5 cm de long et 1 cm de large. </li><li> Insérez trois pièces de cathéter, préalablement infectées par Candida, dans chaque tunnel. Se assurer que les cathéters se trouvent à côté de l&#39;autre dans une disposition horizontale et qu&#39;ils ne couvrent pas les uns les autres pour permettre l&#39;implantation de six fragments de cathéter au total (Figure 2A, (4)). </li><li> Fermez les incisions avec des sutures. Vous pouvez également utiliser Dermabond pour fermer la plaie. </li><li> Désinfectez la plaie très doucement avec 0,5% de chlorhexidine à 70% d&#39;alcool ou avec de l&#39;isopropanol iode (1%). </li><li> Appliquer un anesthésique local (gel de xylocaïne à 2%) directement sur la plaie. </li><li> Administrer inversion de l&#39;anesthésie (protocole 5, étape 2): voie intrapéritonéale 100 pi par 10 g de poids corporel. </li><li> Transfert des animaux dans une cage propre préalablement placé sur une plaque chauffante. Gardez l&#39;animalséparée et chaud jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est complètement éveillé. Pendant ce temps, poursuivre l&#39;opération et l&#39;implant de l&#39;animal suivant. Une fois que tous les animaux sont exploités pleinement éveillé. Transfert à une cage. Surveiller régulièrement les animaux. </li></ol> 7. La bioluminescence Imaging: Préparation de coelentérazine (CTZ), le substrat de G. luciférase princeps <ol><li> Préparer coélentérazine frais (CTZ) solution mère en dissolvant 5 mg / ml dans de l&#39;éthanol acidifié CTZ ou selon les instructions du fabricant. </li><li> Préparer la solution de travail 1,2 mM par dilution de la solution mère 1:10 dans du PBS stérile. REMARQUE: Injecter 100 ul CTZ solutions de travail sous-cutanée dans la zone entourant les cathéters. Utiliser des seringues d&#39;insuline pour injection sous-cutanée de la CTZ. </li><li> Toujours garder CTZ dans l&#39;obscurité (par exemple, couvrir microtubes contenant CTZ une feuille d&#39;aluminium). Conserver la solution de stock à -80 ° C pendant la durée des expériences. </li></ol&gt; 8. bioluminescence Imaging <ol><li> Réinitialisez l&#39;appareil BLI. </li><li> Anesthésier les animaux en utilisant une boîte d&#39;induction. Utilisation d&#39;un mélange gazeux d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène, N 2 O / O 2, ou de l&#39;air à 3.2%. </li><li> Après l&#39;induction, de maintenir l&#39;anesthésie dans la zone d&#39;induction et dans la chambre d&#39;imagerie à 1,5 à 2%. </li><li> Avant de commencer la session d&#39;imagerie, placer la plaque d&#39;imagerie en position A, qui correspond à un champ de vision de 10 cm. Veiller à ce que la bonne position des sorties d&#39;anesthésie et animaux en plaçant un animal de couchage dans la boîte. </li><li> Prenez quelques photos jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est en position d&#39;imagerie désiré, dans le champ de vision droite sous la caméra. </li><li> Préparer deux seringues à insuline contenant chacun 100 ul de la solution de travail CTZ. </li><li> Placez un animal sur le banc et le garder endormi au moyen d&#39;un cône de nez fournissant anesthésie gazeuse. </li><li> Apportez les aiguilles des seringues dans un endroit entourant cathéters sous-cutanée et injecterla CTZ simultanément au-dessus des cathéters. </li><li> Immédiatement après l&#39;injection, placez l&#39;animal sur la plaque chaude dans la boîte de la caméra et lancer l&#39;acquisition d&#39;image de bioluminescence. </li><li> Acquérir des balayages consécutifs avec des temps d&#39;acquisition de 20 à 60 secondes (selon l&#39;intensité du signal) jusqu&#39;à ce que l&#39;intensité du signal maximum est atteint. Lors de l&#39;acquisition de la trame suivante, mesurer l&#39;intensité du signal BLI des cadres précédemment acquis en plaçant un ROI sur chaque cathéters trio et en mesurant le flux de photons à travers ce ROI. </li><li> Répétez l&#39;étape 7 pour l&#39;animal (s) suivante. </li><li> Après l&#39;imagerie, retourner les animaux dans leur cage. Répétez BLI au cours d&#39;une expérience pour longitudinale, suivi non invasif de la formation de biofilm. </li><li> Analyser les données à l&#39;aide de BLI Vivre logiciel Image. Placez un ROI rectangulaire de taille fixe sur chaque trio de cathéter et mesurer le flux de photons (éclat) à travers chaque ROI. Répétez cette opération pour chaque animal. </li><li> Rapportl&#39;intensité du signal de chaque BLI trio de cathéter flux de photons par seconde. Représenter les données BLI sur une échelle logarithmique en reportant la moyenne et l&#39;écart du flux de photons par seconde pour chaque groupe. Effectuer une analyse statistique sur les données transformées log 10. </li></ol> 9. cathéter explantation <ol><li> Préparer microtubes contenant 1 ml de PBS, un pour chaque dispositif de cathéter et de les garder sur la glace. </li><li> Euthanasier les animaux par dislocation cervicale (figure 2B, (1)). </li><li> Désinfecter la peau du dos avec 0,5% de chlorhexidine à 70% d&#39;alcool ou de l&#39;iode avec de l&#39;isopropanol (1%). </li><li> Faire une incision (environ 3 cm) au-dessus des cathéters. </li><li> Couper le tissu sous-cutané et enlever les fragments de cathéter, un par un à partir de sous le tissu sous-cutané en utilisant des pinces stériles (Figure 2B, (2)). </li><li> Poignée cathéter doucement en position verticale et laver deux fois avec 1 ml de PBS stérile. Placez chaque cathéterpièce dans un tube de microcentrifugeuse séparé (préparé dans l&#39;étape 1). </li></ol> 10. Quantification des cellules associées à un biofilm par unités formatrices de colonies comte (UFC) et analyse statistique des résultats <ol><li> Cathéters Soniquer préalablement placées dans 1 ml de PBS pendant 10 min à 40 000 Hz dans un sonicateur à bain d&#39;eau et de les placer sur la glace. </li><li> Après sonication, Vortex vigoureusement pendant 30 secondes et le lieu à nouveau sur la glace. </li><li> Préparer deux microtubes supplémentaires contenant 900 pi de PBS. </li><li> Assurez 01h10 et 1: 100 dilutions de votre échantillon original (celui qui contient le cathéter) et de garder tous microtubes sur la glace. </li><li> Planche 100 pi des échantillons originaux, 1:10 et 1: 100 dilutions sur des plaques de gélose YPD en double. </li><li> Incuber les plaques pendant 2 jours à 37 ° C et compter UFC. </li><li> Compter les colonies cultivées sur des plaques de gélose YPD (montant dénombrable de colonies, au maximum 300 colonies / plaque) et multipliez-les par le bon dilutionsfacteur de tion (1x-originale, 10x ou 100x dilution). En outre multiplier chaque pièce de cathéter en 10x, ce qui correspond à la quantité finale de colonies en 1 ml tube contenant le cathéter. Apportez le montant final de colonies de se connecter 10 cellules / pièce de cathéter avec une déviation standard (SD). Exprimez données comme une moyenne ± SD. </li><li> Placez toutes les valeurs pour chaque cathéter et groupe spécifique dans un tableur et / ou statistique, pour effectuer les calculs mentionnés ci-dessus et des analyses statistiques. Indiquer groupes spécifiques de comparer, à savoir WT vs. mutant ou deux jours vs. 6 jours de formation de biofilm et effectuer des test t non apparié et ANOVA avec Tukey post-test sur les données de log10-transformé. <ol><li> Exprimer le niveau de signification d&#39;une valeur de p. Dans cette étude indiquer l&#39;importance si la valeur de p &lt;0,05, représentée comme suit: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,005, *** p &lt;0,0005. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

L&#39;utilisation de modèles animaux, et en particulier les modèles rongeurs, pour les études réservés aux biofilms microbiens est très important que le système immunitaire de l&#39;hôte est un facteur essentiel dans la formation de biofilm que les modèles in vitro ne peuvent pas expliquer. Dans cette étude, nous décrivons un sous-cutanée C. relativement simple biofilm modèle de la souris albicans, qui peut être facilement adopté dans un laboratoire de recherche et ne nécessite pas de compéten...

Candida albicans est un organisme commensal, qui se trouve à différents sites d&#39;individus en bonne santé, par exemple sur la peau ou en tant que partie de la flore vaginale et gastro-intestinal. Cependant, dans hospitalisé, et surtout les patients immunodéprimés, il peut provoquer un large éventail d&#39;infections 1. Chez ces individus, le système immunitaire est affaibli permet aux cellules de Candida pour diffuser dans la circulation sanguine et envahissent les tissus profonds provoquant des infections potentiellement mortelles. En outre, la présence de substrats abiotiques tels que des cathéters veineux centraux et des voies urinaires, des soupapes et des joints cardiaques artificielles peut fournir un créneau pour Candida accessoire 2. Adhérence à ces substrats est un préalable à la poursuite du développement du biofilm, ce qui représente une couche de cellules de levure et hyphes enrobé dans un matériau polymère extracellulaire, constitué principalement de deux polysaccharides. C. albicans cathéter associée au gène infectionssont associés à des taux de mortalité élevé. Une caractéristique générale de biofilms est leur sensibilité diminuée aux antifongiques connus, tels que les azoles 3,4. Seulement nouvelles classes de médicaments antifongiques tels que échinocandines et formulation liposomale d&#39;amphotéricine B se sont révélées actives contre les infections liées aux cathéters 5-7. En raison de biofilm résilience aux antifongiques, les approches thérapeutiques sont très limitées, conduisant souvent à l&#39;enlèvement du cathéter et son remplacement ultérieur comme une solution unique. La plupart de notre compréhension actuelle de C. le développement de biofilm albicans provient des études in vitro sur des substrats abiotiques tels que le polystyrène, ou des matières plastiques utilisées pour la fabrication des dispositifs mentionnés ci-dessus, ce est à dire, silicone, polyuréthane 2. Ces modèles sont très avancés et essaient d&#39;imiter le plus fidèlement la situation in vivo que possible. Toutefois, ces systèmes ne comportent pas l&#39;écoulement sanguin continu et til système immunitaire de l&#39;hôte. Il en a résulté le développement de systèmes de modèle in vivo, tels que le modèle cathéter veineux central (CVC) 8-10, le modèle de prothèse dentaire de la stomatite candidose buccale 11 et un modèle murin pour cathéter associé candidurie 12. En outre, C. le développement de biofilm albicans a été étudiée in vivo sur les surfaces des muqueuses, telles que celles de la cavité vaginale 13 et 14 par voie orale. Notre laboratoire a contribué à la création d&#39;un sous-cutanée C. modèle de biofilm albicans, qui est basé sur l&#39;implant de morceaux de cathéters infectés sur le dos de rats Sprague-Dawley 15. Ce modèle a été utilisé avec succès dans notre laboratoire pour tester la sensibilité au fluconazole biofilm et échinocandine médicaments 5,16, pour étudier l&#39;effet de la thérapie combinatoire de diclofénac et caspofungine 17. Plus récemment, nous avons adapté ce système pour une utilisation dans souris BALB / c 18,19. Encomparaison avec d&#39;autres modèles in vivo, le principal avantage de ce modèle sous-cutanée est la possibilité d&#39;étudier plusieurs biofilms par animal développé à l&#39;intérieur du lumen de cathéter de pièces implantées. Pour réduire le nombre d&#39;animaux de laboratoire, nous avons adapté ce modèle pour étudier le développement de C. albicans biofilms non invasive en utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI) 18,19. Cette méthode se est avérée une technique puissante, qui peut être utilisée pour quantifier les biofilms en mesurant le signal spécifique BLI à la région d&#39;intérêt (dans notre cas, la zone de cathéters implantés), évitant le sacrifice animal. Par rapport à des bactéries, qui peut exprimer à la fois le gène et le substrat nécessaire à la réaction de bioluminescence en raison de l&#39;introduction d&#39;un opéron lux 20 spécifique, la plupart des organismes eucaryotes, y compris C. albicans, dépendent de l&#39;expression hétérologue d&#39;un gène de la luciférase couplée à laadministration externe d&#39;un substrat spécifique, telle que D-luciférine ou 21 coelentérazine. Probablement en raison de la présence de la paroi cellulaire fongique et C. albicans morphogenèse, la délivrance intracellulaire du substrat pour l&#39;enzyme luciférase a été un défi principal 21. Afin de résoudre ce problème, Enjalbert et al. 22 conçu une souche où C. synthétique albicans version optimisée codon du gène de la luciférase de Gaussia princeps naturellement sécrétée (Gluc) a été fusionné à l&#39;C. PGA59 gène albicans, une ancre GPI protéine de la paroi cellulaire. En raison de la présence de la luciférase à la paroi cellulaire, des problèmes concernant la disponibilité intracellulaire du substrat pourraient être évités. Ce système particulier a été utilisé pour étudier les infections superficielles provoquées par C. 22 albicans. Très récemment, BLI a également été utilisé pour suivre la progression de la candidose oropharyngée et son possibltraitement de l&#39;e 23. Ces résultats appuient l&#39;utilisation de BLI comme une technique prometteuse pour étudier les infections causées par des cellules vivant en liberté, mais aussi les infections associées aux périphériques. Dans cette étude, nous décrivons la C. albicans développement d&#39;un biofilm sur des morceaux de cathéters de polyuréthanne dans des souris BALB / c et sa quantification à l&#39;aide de BLI. Nous fournissons un protocole détaillé de la colonisation in vitro de cathéters de polyuréthanne au cours de la période d&#39;adhérence suivie de l&#39;implantation chez la souris et le développement de biofilm subséquente d&#39;animaux vivants. Outre la mesure du signal émis par le BLI C. cellules albicans, on détermine également la unités formant des colonies pour la comparaison avec la technique classique de biofilm fongique charge quantification.

<table><tbody><tr><td>Extrait de levure granulé</td><td>Merck</td><td>MERC1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Peptone bactériologique</td><td>Oxoid</td><td>LP037B</td><td></td></tr><tr><td>Gélose granulée</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Fluka</td><td>49159-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate&nbsp ;</td><td>Préparé en laboratoire</td><td></td><td>pour 1 L de 10x PBS : 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4</sub</td></tr><tr><td>>RPMI1640 avec de la L-glutamine et sans carbonate de sodium.</td><td>Sigma</td><td>R6504-1L</td><td>Préparer selon le protocole pour les tests de sensibilité aux médicaments contre Candida albicans&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS)</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>MOPS est utilisé pour ajuster le pH du milieu RPMI (pH 7,0)</td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Tube de cathéter intraveineux en polyuréthane tripe-lumière (2,4 mm de diamètre, Certofix Trio S730)&nbsp ;</td><td>BBraun</td><td>CV-15703</td><td>Pièce en polyuréthane coupée en morceaux de 1 cm</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Fagron SAS, France</td><td>611139</td><td>Immunosuppresseur (solution mère 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Ampicilline&nbsp ;</td><td>Duchefa Biochemie, Pays-Bas</td><td>A0104</td><td>Prophylaxie antibactérienne</td></tr><tr><td>Kétamine 1000</td><td>Pfizer</td><td>804 119</td><td>Anesthésique</td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>134737-1</td><td>Anesthésique</td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>134783-2</td><td>Inversion de l’anesthésie</td></tr><tr><td>Gel de xylocaïne (2 %) - c’est Linisol</td><td>AstraZeneca</td><td>352 1206</td><td>Anesthésique local pour la peau</td></tr><tr>Pommade <td></td><td></td><td>ophtalmique Terramycine/polymyxine-b</td><td>Pour prévenir le dessèchement et l’infection des yeux</td></tr><tr><td>Coelentérazine</td><td>Prolume (Nanolight)</td><td>NF-CTZ-FB</td><td>Agent sensible à la lumière (doit être conservé dans l’obscurité)</td></tr><tr><td>Isopropanol d’iode (1 %)</td><td>3M&trade ; DuraPrep&trade ; &nbsp ;</td><td></td><td>Désinfectant pour la peau</td></tr><tr><td>0,5 % de chlorhexidine dans de l’alcool à 70 %. &nbsp ;</td><td>Cedium</td><td></td><td>Désinfectant pour la peau</td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage</td><td></td><td></td><td></td>cellulaire</tr><tr><td>Seringues à insuline (0,3 ml)</td><td>Terumo Myjector 29G</td><td>324826</td><td>Pour injection de coelenterazine</td></tr><tr><td>Rasoir</td><td></td><td></td> électrique <td>Pour petits animaux</td></tr><tr><td>Outils chirurgicaux</td><td></td><td></td><td>stériles Ciseaux, 2 paires de pinces à épiler, </td></tr><tr><td>scalpel Coussin chauffant</td><td>Leica</td><td>14042321474</td><td></td></tr><tr><td>Suture cutanée</td><td>Johnson& Johnson</td><td>K890H</td><td>Fil chirurgical, aiguille</td></tr> Bain <tr><td>d’eau Sonicateur</td><td>Branson 2210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLI caméra (IVIS Spectrum)&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td>IVISSPE</td><td></td></tr><tr><td>Living Image software&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td></td><td>(version 4.2)&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée suivi par bioluminescence imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans développement de biofilm sur des surfaces biotiques et / ou abiotiques représente une menace spécifique pour les patients hospitalisés. Jusqu&#39;à présent, C. biofilms albicans ont été étudiés principalement in vitro, mais il ya un besoin crucial pour une meilleure compréhension de ce processus dynamique dans des conditions in vivo. Nous avons développé un modèle de rat sous-cutanée in vivo pour étudier C. albicans formation de biofilm. Dans notre modèle, multiple (jusqu&#39;à 9) appareils infectés par Candida sont implantés à la partie arrière de l&#39;animal. Cela nous donne un avantage majeur sur le système de modèle de cathéter veineux central car il nous permet d&#39;étudier plusieurs biofilms indépendants dans un animal. Récemment, nous avons adapté ce modèle pour étudier C. le développement de biofilm albicans chez la souris BALB / c. Dans ce modèle, mûrir C. biofilms albicans développent dans les 48 heures et démontrent l&#39;architecture du biofilm tridimensionnelle typique. La quantification de biofilm fongiqueest traditionnellement analysé post-mortem et exige le sacrifice d&#39;accueil. Parce que cela nécessite l&#39;utilisation de nombreux animaux pour réaliser des études cinétiques, nous avons appliqué la bioluminescence imagerie non invasive (BLI) de suivre longitudinalement dans vivo mûrir C. albicans biofilms développer dans notre modèle sous-cutanée. C. albicans cellules ont été modifiées pour exprimer le gène de la luciférase de Gaussia princeps (Gluc) fixée à la paroi cellulaire. Le signal de bioluminescence est produite par la luciférase qui convertit la coelentérazine de substrat ajouté à la lumière qui peut être mesurée. Le signal BLI ressemblait nombre de cellules obtenues à partir de cathéters explantées. Imagerie non invasive pour quantifier la formation de biofilm in vivo fournit des applications immédiates pour le dépistage et la validation de médicaments antifongiques dans des conditions in vivo, ainsi que pour les études basées sur les interactions hôte-pathogène et contribuant à une meilleure compréhensiontion de la pathogenèse des infections liées aux cathéters.

Dans cette étude, nous montrons la procédure chirurgicale d&#39;implant de cathéter et explant in vivo au cours de C. albicans développement du biofilm dans une souris. En outre, nous affichons la quantification des biofilms matures non seulement par UFC recensement classique mais aussi par BLI. Comme le montre la Figure 1A, phosphorescents non morceaux de cathéters en polyuréthanne ont été coupés en des dispositifs de 1 cm et ensuite revêtus avec du sérum....

Nous présentons une procédure expérimentale de développement du biofilm de Candida albicans dans un modèle sous-cutané de souris. Les biofilms fongiques ont été quantifiés en déterminant le nombre d’unités formant des colonies et par une imagerie de bioluminescence non invasive, où la quantité de lumière produite correspond au nombre de cellules viables.

Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de valider l’utilisation d’une souche exprimant la luciférase pour la surveillance non invasive de la formation de biofilms in vivo par des cellules de candida albican. Ceci est réalisé en implantant des fragments de cathéter colonisés par une souche exprimant la luciférase de candida albicans dans le dos d’une souris. Au cours de la deuxième étape, la levure est laissée se développer en une épaisse couche de cellules intégrées dans une matrice extracellulaire, générant un biofilm mature à l’intérieur des cathéters.Ensuite, un substrat est ajouté qui sera converti par l’enzyme luciférase. Cette réaction produit une lumière mesurable L’imagerie bioluminescente ou BLI est ensuite utilisée pour enregistrer et quantifier la formation du biofilm au sein de l’hôte vivant. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres techniques existantes, telles que le système central Venmo, est que nous pouvons tester jusqu’à six biofilms à l’intérieur d’un animal, réduisant ainsi considérablement le nombre d’animaux dont nous avons besoin pour l’analyse statistique.Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de la formation du biofilm de Candida albicans, car notre méthode permet de tester facilement les composants antifongiques existants et nouveaux. En outre, cette méthode peut donner un aperçu du candida albicans, des biofilms fongiques. Il peut également être appliqué à d’autres microbes comme les bactéries ou d’autres espèces amusantes.Les procédures proposées sont faciles à mettre en œuvre dans tout laboratoire qui a accès à une animalerie 24 heures avant l’intervention chirurgicale et qui a ouvert l’emballage contenant les cathéters à triple lumière dans une enceinte de sécurité biologique. Utilisez une pince à épiler stérile pour enlever toutes les parties inutiles et un scalpel stérile pour couper la partie attachée au cathéter. Placez ensuite une règle sous l’emballage en plastique et coupez le cathéter en polyuréthane en morceaux d’un centimètre de long.Ensuite, remplissez chaque cathéter avec environ 1,8 millilitre de sérum de veau fœtal à 100 % et incubez les morceaux à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez chaque pièce de cathéter revêtue de sérum dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,5 millilitre, et grattez C albicans d’une plaque A YPD en un millilitre de PBS dans un microtube à centrifuger séparé à une dilution de un à 100. Après le comptage, diluez la suspension cellulaire à une concentration finale de cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre.Et ajoutez un millilitre de cellules à chacune des pièces de cathéter recouvertes de sérum. Laissez les cellules adhérer aux cathéters pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, tenez les tubes en position verticale avec une pince à épiler stérile.Rincez doucement chaque pièce à travers la lumière deux fois avec un millilitre de PBS pour placer les cathéters. Commencez par raser le bas du dos d’une souris anesthésiée de huit semaines positionnée sur un coussin chauffant. Ensuite, désinfectez la peau et faites une petite incision de 0,5 à un centimètre de chaque côté de l’animal.Ensuite, disséquez le subcu avec des ciseaux pour créer deux tunnels sous-cutanés d’environ 1,5 centimètre de long et un centimètre de large. Insérez trois pièces de cathéter dans chaque tunnel en veillant à ce qu’elles soient placées les unes à côté des autres dans une disposition horizontale sans se chevaucher. Fermez les incisions avec des sutures puis nettoyez les plaies très doucement avec un désinfectant.Ensuite, appliquez un anesthésique local directement sur les incisions et administrez un agent d’inversion de l’anesthésie en surveillant les animaux jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis. Pour imager la formation du biofilm au moment expérimental approprié, injectez 100 microlitres de stérilet et de térézine fraîchement préparés par voie sous-cutanée dans chaque zone contenant les cathéters chez un animal anesthésié. Acquérez ensuite des balayages consécutifs avec des temps d’acquisition allant de 20 à 60 secondes jusqu’à ce que l’intensité maximale du signal soit atteinte.Lors de l’acquisition de l’image suivante, placez une région d’intérêt sur chaque trio de cathéters pour mesurer l’imagerie bioluminescente ou l’intensité du signal BLI des images précédemment acquises. Placez également une région d’intérêt rectangulaire de taille fixe sur une région de contrôle pour mesurer le signal d’arrière-plan dans un logiciel d’image vivante. Mesurez le flux de photons à travers les régions d’intérêt pour chaque trio de cathéters ainsi que pour l’arrière-plan.Après avoir répété ces mesures pour chaque animal et à différents moments pendant le rapport de formation du biofilm, l’intensité du signal BLI de chaque trio de cathéters est exprimée en flux de photons par seconde. Les données peuvent être copiées et collées directement dans un tableur. À la fin de l’expérience longitudinale, sacrifiez chaque animal coupé dans le tissu sous-cutané et utilisez une pince à épiler stérile pour retirer les fragments de cathéter un par un.Lavez les cathéters deux fois dans un millilitre de PBS comme nous venons de le démontrer. Ensuite, sioninez les pièces dans un nouveau microtube de centrifugation dans un millilitre de PBS frais à 40 000 hertz dans un bain-marie. Sonicate après 10 minutes, placez les tubes contenant les cathéters sur de la glace et placez 100 microlitres des échantillons originaux à une à 10 dilutions et une à 100 sur des plaques de gélose YPD.En double. Enfin, tracez la moyenne et l’écart-type des unités formant une colonie. Et signal BLI pour chaque animal sur une échelle logarithmique.Sur cette image, un animal représentatif affichant le signal de bioluminescence ainsi qu’une région d’intérêt dénotée six jours après le développement du biofilm est montré. Notez l’absence de signalisation dans la zone de fond de contrôle confirmant la limitation du biofilm aux zones immédiatement adjacentes aux cathéters recouverts de candida. Dans cette expérience représentative, on peut observer un signal BLI clair produit par les biofilms exprimant la luciférase, alors que seul le signal de fond semble être produit par la souche de type sauvage.Cette augmentation du signal suit la même tendance que l’augmentation des unités formant des colonies par biofilm et les mesures de flux de photons pour chaque groupe d’animaux pris ensemble. Ces données illustrent que la BLI est une technique puissante pour surveiller et quantifier la formation in vivo de biofilms matures de C albicans dans un modèle murin sous-cutané. Une fois maîtrisé, l’infection des dispositifs par des cellules de candida peut prendre deux heures, tandis que l’implantation du cathéter peut être réalisée en 10 minutes par souris.L’imagerie BLI peut être réalisée en cinq minutes par souris. Le grand avantage de l’utilisation du BLI est que vous pouvez surveiller le développement de la biomasse et du biofilm à plusieurs reprises chez le même animal. Au fil du temps Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’IRM ou la tomodensitométrie peuvent fournir des informations sur la position exacte de la cathédrale.Ces informations peuvent ensuite être utilisées pour la quantification dans des modèles plus complexes comme le modèle de la cathédrale de la veine profonde. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon de réaliser in vivo, le biofilm sous-cutané, le ss chez la souris, et cela peut constituer la base d’une analyse plus approfondie des interactions hôte-pathogène.

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Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging (Vidéo) | JoVE Journal

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