Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

Notre laboratoire utilise la méthode du myographe filaire pour mesurer la contractilité des muscles lisses vasculaires depuis de nombreuses années. Nous utilisons cette technique pour étudier le mécanisme de contraction des muscles lisses. Nous utilisons cette méthode pour explorer de nouveaux médicaments pour le traitement de l’hypertension.

Le principal avantage de cette technique est que le segment vasculaire survit au moins quatre heures après le montage et conserve la contractilité induite par un potassium élevé pendant de nombreuses fois. Le système multicanal offre la possibilité d’un dépistage thérapeutique élevé de nouveaux médicaments. Épinglez le corps de la souris euthanasiée avec son abdomen vers le haut et humidifiez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, après avoir utilisé des ciseaux pour couper la peau le long de la ligne médiane ventrale à partir de l’aine, faites des incisions le long de chaque jambe à partir du début de la première incision. Tirez la peau vers l’arrière des deux côtés, puis faites des incisions similaires pour ouvrir le péritoine. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper l’œsophage, le côlon et d’autres tissus conjonctifs afin d’isoler complètement le tractus gastro-intestinal avec le système vasculaire d’alimentation du corps.

Après avoir rincé le sang du tractus gastro-intestinal avec HEPES-Tyrode, ou solution H-T, transférez le segment isolé dans une boîte de Pétri enrobée pour une dissection de l’artère mésentérique à température ambiante. Lissez l’estomac, le jéjunum, l’iléon et le caïcum dans le sens des aiguilles d’une montre et épinglez l’estomac et le cæcum respectivement à gauche et à droite. Allumez la source lumineuse de transmission d’un microscope stéréoscopique et fixez l’intestin avec des broches pour exposer les artères mésentériques disséquées.

Ensuite, clampez les tissus adipeux autour des artères avec des pinces et isolez soigneusement les artères en coupant tous les tissus conjonctifs avec des ciseaux de dissection. Saisissez une artère en excès avec une pince et transférez-la et immergez-la dans une solution froide de H-T sans ions calcium. Coupez une partie de 1,4 millimètre de l’artère proximale à la paroi intestinale d’une arcade mésentérique et utilisez deux pinces pour ouvrir soigneusement les deux côtés de ce segment d’artère.

Préparez deux segments de fil d’acier inoxydable de 2,5 centimètres de long et placez-les dans le même plat. À l’aide d’une pince, clampez doucement une extrémité de l’artère. Ensuite, à l’aide d’une autre pince, insérez soigneusement deux fils dans la lumière de l’artère un par un.

Assurez-vous que les fils sont maintenus droits et ne touchent pas l’endothélium. À l’aide de deux pinces, clampez simultanément les deux fils à l’extérieur du vaisseau fileté et transférez soigneusement le récipient de la boîte de Pétri vers une chambre myographe remplie de solution H-T. Vissez les mâchoires de la chambre pour faire de la place pour le montage, puis saisissez les deux côtés de l’un des deux fils insérés à l’aide de deux pinces et placez le récipient dans l’espace de la mâchoire.

Enroulez les deux côtés du fil serré autour des vis de la mâchoire reliées au micromètre. Fixez la vis du côté gauche en la tournant dans le sens des aiguilles d’une montre. Ensuite, utilisez une pince pour redresser le fil.

Ensuite, fixez la vis du côté droit en la tournant dans le sens des aiguilles d’une montre. Assurez-vous que le récipient est toujours à l’intérieur de l’espace de la mâchoire, mais ne touchez pas la mâchoire pour éviter de l’endommager. Fermez les deux mâchoires à l’aide du micromètre.

Assurez-vous que les deux mâchoires sont suffisamment proches mais qu’elles ne se touchent pas, et que le fil non fixé se trouve au-dessus du fil fixe. À l’aide de la pince de droite, pliez soigneusement le fil dévissé au coin de la mâchoire relié au transducteur de force et enroulez-le dans le sens des aiguilles d’une montre autour de la vis de droite. Ensuite, fixez la vis.

Répétez le dépliage et l’enroulement du côté gauche du fil et fixez la vis du côté gauche. Ensuite, écartez légèrement les mâchoires sans étirer le vaisseau en tournant soigneusement le micromètre de sorte que l’espace entre les deux mâchoires puisse accueillir les deux fils. Ensuite, à l’aide d’une pince, déplacez le fil du côté du micromètre vers le plan horizontal du fil du côté du transducteur.

Après avoir monté les artères dans les autres chambres, connectez toutes les chambres à l’équipement et couvrez les chambres. Fixez l’alimentation en oxygène à 100 % et une sonde de température et commencez à chauffer à 37 degrés Celsius. Ouvrez le logiciel de cartographie.

Appuyez sur le bouton Start' pour démarrer l’enregistrement. Sélectionnez le canal qui vous intéresse dans le menu DMT pour ouvrir la fenêtre de normalisation DMT pour le canal correspondant. Entrez les valeurs constantes suivantes dans la fenêtre :Points d’extrémité des tissus a1, 0,1 ; Points d’extrémité tissulaires a2, 4 ; Diamètre du fil, 40.

La fenêtre affiche alors la longueur calculée du récipient à 1,40 millimètre. Lire le micromètre de la chambre tissulaire appropriée. Entrez la valeur dans la case de lecture du micromètre et cliquez sur le bouton Ajouter un point.

Cette valeur est la valeur initiale de X.Après un délai de 60 secondes, la fenêtre affiche la force et la pression effective correspondant à cette valeur micrométrique. Simultanément, le boîtier de lecture du micromètre devient actif. Étirez le récipient normalisé en tournant le micromètre dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.

Entrez la valeur du micromètre dans la case de lecture du micromètre et cliquez sur le bouton Ajouter un point. Attendez à nouveau un délai de 60 secondes. Continuez à étirer le récipient et à ajouter des valeurs micrométriques jusqu’à ce que la fenêtre affiche la valeur du micromètre X-un, qui est le réglage micrométrique calculé requis pour étirer le récipient à son IC-one.

Réglez le micromètre sur la valeur X-un. Après la normalisation, équilibrez le récipient dans la chambre pendant 15 à 20 minutes. Une fois équilibré, défiez le récipient avec une solution à haute teneur en potassium en remplaçant la solution H-T par 5 millilitres de solution à haute teneur en potassium pour induire la contraction pendant 10 minutes.

Après avoir répété l’incubation de 10 minutes dans une solution fraîche à haute teneur en potassium, laver avec cinq millilitres de solution H-T trois à quatre fois. Encore une fois, défiez le récipient avec cinq millilitres de solution à haute teneur en potassium pour induire la contraction. Après cinq minutes, ajoutez 0,5 microlitre de la solution mère de néoliensinine dans la chambre pour détendre le récipient à une concentration finale d’une micromolaire de néolieninine.

Lorsque la force est stable après plusieurs minutes, ajoutez encore 0,5 microlitre de solution mère de néoliensinine pour augmenter la concentration à deux micromolaires. Ajouter un microlitre de solution mère à chaque fois pour augmenter la concentration à quatre, six, huit et 10 micromolaires afin de générer la courbe dose-réponse. Au cours de la procédure de normalisation, le vaisseau a été étiré plusieurs fois jusqu’à ce qu’il atteigne la valeur IC-100 et chaque cycle d’étirement comprenait une contraction robuste, une relaxation rapide et un maintien de la force en 60 secondes.

La contraction du muscle lisse vasculaire induite par une solution riche en potassium présentait généralement deux phases, une phase robuste et une phase soutenue. Nous avons décrit une méthode pour mesurer la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de la souris à l’aide d’un système de myographe multifilaire. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les fonctions des muscles lisses vasculaires et pour dépister les relaxants des muscles lisses.

La principale différence entre cette méthode et les autres réside dans les étapes de montage. Cette étape, utilisée ici, est facile à réaliser et n’endommage ni les tissus ni l’appareil. Suite à cette procédure, d’autres stimulateurs tels que l’EP et l’angiotensine II peuvent également être utilisés pour stimuler la contraction des muscles lisses afin de trouver de nouveaux médicaments sensibles à cet agoniste.