말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 정의된 allo antigen specificity를 가진 human T cell을 식별, 분리 및 복제하는 것입니다. 이는 먼저 밀도 구배 원심분리를 통해 전체 말초 혈액에서 T 림프구를 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 allo antigen specific T cell을 Fluor four conjugated peptide, HLA, tetramers로 표지하고 자기 분리를 통해 농축합니다.

다음으로, 표지된 T cell은 single cell flow cytometry cell sorting에 의해 분리됩니다. 마지막으로, 단세포 배양액은 anti CD 3 및 anti CD 25 항체로 자극됩니다. 궁극적으로 항원 특이적 T 세포의 allo 반응성은 유세포 분석을 통해 평가할 수 있습니다.

벌크 림프구 자극 및 희석 제한과 같은 다른 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 잘 정의된 allo 항원에 대한 특정 반응성을 가진 T 세포 클론을 생성할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 T 세포 클론의 배양 및 확장에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이를 위해서는 절차를 시작하기 전에 배양을 매일 주의 깊게 모니터링해야 합니다.

4 밀리리터의 실온 밀도 구배를 2-4 개의 멸균 15 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브로 나누고 70 % 에탄올을 사용하여 건강한 지원자의 혈액이 들어있는 1-2 개의 채워진 녹색 상단 혈액 수집 튜브의 외부를 닦은 다음 조심스럽게 상단을 제거하고 혈액을 멸균 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 각 수집 튜브를 10ml의 PBS로 재조정합니다. 세척액을 디캔팅된 전혈과 함께 모으고 용액을 부드럽게 혼합한 다음 희석된 혈액의 총 부피 2ml당 25마이크로리터의 인간 T 세포 농축 칵테일로 세포를 배양합니다. 20분 후 10ml 피펫을 사용하여 밀도 구배 매체 위에 최대 10ml의 혈액을 부드럽게 층을 이루고 구배 표면을 방해하지 않도록 주의합니다.

세포를 10분 동안 원심분리한 다음 5ml 피펫을 사용하여 밀도 구배와 희석된 혈장의 경계면에서 백혈구 층을 50ml 원추형 튜브의 멸균 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 수집된 말초 혈액 림프구의 부피를 PBS로 최대 50ml까지 가져오고 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 세포를 계수하고 분석을 위해 1mL 부분 표본을 제거합니다.

다음으로, 세포 resus를 스핀 다운 한 후, 펠릿을 1 밀리리터의 유세포 분석 버퍼에 현탁시키고 50 마이크로 리터의 희석 된 allo antigen 펩타이드 MHC tetramer를 세포 현탁액에 혼합합니다. 세포를 멸균된 5밀리리터 튜브로 옮기고 30분 후에 2밀리리터의 분류 완충액 용액으로 세포를 세척합니다. 100마이크로리터의 분류 완충액에 입천장을 현탁시킨 다음 10마이크로리터의 비오틴 선택 칵테일에 15분 동안 세포를 배양합니다.

다음으로, 5마이크로리터의 자성 입자에 세포를 10분 동안 배양한 다음 세포 현탁액을 2.5ml의 분류 버퍼와 부드럽게 혼합합니다. preen 농축 세포 분석의 100마이크로리터 분취액을 제거한 다음 튜브를 세포 분리 자석에 넣습니다. 5분 후, 튜브와 자석을 함께 잡고 내용물을 새 5ml 튜브에 넣습니다.

그런 다음 자석에서 튜브를 제거하고 2ml의 분류 버퍼로 세포를 세척하고, 펠릿을 냉간 분류 버퍼에 재현탁하고, 샘플 유형당 2ml의 냉간 분류 버퍼로 세포를 분취합니다. 샘플을 다시 회전시킨 후 펠릿을 25마이크로리터의 냉간 분류 버퍼에 다시 현탁시키고 20분 동안 얼음 위에서 5마이크로리터의 인간 FC 블록에 세포를 배양합니다. 다음으로, 튜브에 20마이크로리터의 적절한 항체 칵테일을 배양합니다.

20분 후, 2ml의 냉선별 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 밀리리터당 1-200만 개의 세포로 재현탁합니다. 더 많은 완충액에서 100 마이크로 리터의 인간 T 세포 배양 배지를 96 웰 둥근 바닥 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분취하고 분류가 완료 될 때까지 플레이트를 얼음 위에 보관합니다. 분류 후 플레이트를 원심분리한 다음 셀을 섭씨 37도의 6%CO2 인큐베이터에 넣습니다.

다음으로, 볼텍싱을 통해 적절한 부피의 활성제 비드를 혼합하고 적절한 부피의 비드를 멸균된 5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 자석에서 비드를 세척한 후 세척 용액을 디캔팅하고 튜브에 마이크로비드 0.5마이크로리터당 배지인 100마이크로리터의 인간 T 세포 배양을 추가합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 활성제 비드 현탁액을 96 웰 플레이트의 각 웰로 분취하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.

증식하는 세포의 작은 클러스터는 세포 분리 후 14일 후, 배양 5-7일 후에 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 배양액 상단에서 100마이크로리터의 배지를 100마이크로리터의 신선한 인간 T 세포 배양액으로 조심스럽게 교체합니다. 중간 크기의 세포 클러스터는 섭식 후 2-3일 후에 현미경으로 볼 수 있어야 하며, 거시적으로 세포 펠릿은 배지 변화 후 14일 동안 볼 수 있어야 합니다.

세포 분리 후 28일 후, 200마이크로리터 부피의 성장 양성 배양액 전체를 200마이크로리터의 인간 T 세포 배양 배지가 포함된 48웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 인간 T 세포 배양 배지에 12.5 마이크로 리터의 자극성 항 CD 3 개, 항 CD 28 마이크로 비드를 첨가하고 복원 3-5 일 후에 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 매체가 빨대가 노랗게 변하기 시작해야 합니다.

이 시점에서 배양물을 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮기고 각 배양에 500마이크로리터의 인간 T 세포 배지를 추가합니다. 마지막으로, 재조정 후 10-14일에 각 T 세포 배양액 200마이크로리터를 수집하여 펩타이드의 유세포 분석을 통해 동종 항원 특이성을 평가합니다. MHC 테트라머 결합: 동종 항원 특이 T 세포의 예상 수율은 기증자, 사용된 동종 항원 및 공여체 내 반응성 T 세포의 해당 빈도에 따라 달라집니다.

예를 들어, 평균적인 건강한 헌혈자는 혈액 1밀리리터당 4, 500, 000에서 1,000만 개의 백혈구를 가지고 있으며, 그 중 약 20%는 T 림프구입니다. 이 점도표는 HLAD 4 음성 공여자의 T 세포와 특정 동종 항원의 결합을 측정한 결과를 보여줍니다. 예를 들어, 이 실험에서는 이 시작 세포 집단에서 2,000만 개의 백혈구에서 4개 중 1개의 빈도인 776개의 동종 항원 특이적 T 세포를 열거했습니다.

88 개의 개별 temer 표지 T 세포를 분리 할 수 있었고 2 차례의 마이크로 비드 자극 및 배양 후 현미경 검사로 2 개의 성장 양성 배양을 확인하고 A 2 30 48 HLA DR의 결합을 검사하여 동종 항원 특이성을 평가했습니다. 4개의 사합체. 이 절차를 시도하는 동안 세포 사멸과 배양물의 과다 증식을 방지하기 위해 매일 세포 배양을 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 T 세포 클론을 사용하여 동종 리간드 인식의 생화학을 조사하고 이것이 효과적인 면역 반응으로 어떻게 변환되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.