Name: Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Apprenez à isoler des monocytes dérivés de la moelle osseuse de souris pour la recherche cardiovasculaire. Cette méthode efficace réduit les coûts et le nombre d'animaux utilisés.

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Ce travail a été soutenu par la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fondation allemande pour la recherche) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centre de recherche collaborative). 
Merci à Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Université Otto-von-Guericke de Magdebourg, Magdebourg, Allemagne, pour le soutien technique.

Cette étude a été réalisée avec la permission de l&#39;Etat de Saxe et de Saxe-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, selon l&#39;article 8 de la loi allemande pour la protection des animaux (24D-9168,11 à 1 / 2008-24). Une cellule d&#39;isolement 1.1 Préparation du fémur et du tibia <ol><li> Anesthésier la souris en utilisant une concentration d&#39;isoflurane à 5% par vaporisation d&#39;isoflurane dans un bac fermé. Après la souris a cessé de bouger pendant 3 secondes, effectuer la dislocation cervicale. </li><li> Désinfecter les membres postérieurs avec de l&#39;éthanol (96%). Enlever la peau et les muscles et séparer les os avec un scalpel stérile. <ol><li> Commencez par une incision inguinale de la peau, et d&#39;étendre l&#39;incision vers la malléole interne et effectuer une dissection circulaire de la peau autour du mollet. Retirez la peau des jambes complètement par éplucher proximale. </li><li> Détachez le muscle quadriceps du fémur avec un scalpel, enlever les deux péroné antérieureset les groupes musculaires jumelles et disjoignent la jambe à l&#39;articulation de la hanche en localisant et en disséquant les ligaments. </li><li> Commencez en avant et procéder autour de l&#39;articulation en tournant soigneusement la jambe et sectionnant les ligaments, désarticulant ainsi la commune. </li></ol></li><li> Laver fémur et le tibia avec 96% d&#39;éthanol pendant au moins 90 secondes pour garantir préparation cellulaire aseptique. Poursuivre le processus de lavage avec du PBS stérile pour rincer éthanol restant. Remarque: Toutes les étapes suivantes doivent être stériles pour éviter la contamination. </li></ol> 1.2 La récolte de moelle osseuse <ol><li> Couper l&#39;extrémité proximale et distale de chaque os avec une paire de ciseaux fins d&#39;accéder aux arbres fémorale et tibiale. Soyez prudent avec cette étape, puisque ces os se cassent très facilement. </li><li> Rincer les os avec un milieu chaud (M199 + 10% de sérum de veau foetal (FCS), + 1% de pénicilline / streptomycine). Utiliser une aiguille stérile 28-G, une seringue de 1 ml, et entre 10 à 15 ml par milieuosseuse pour le rinçage. </li><li> Maintenez l&#39;os avec une pince fine et rincer une par une jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne semi-translucide. Appliquer soigneusement pression à l&#39;extrémité du plongeur de la seringue afin de minimiser le stress cellulaire. </li><li> Filtrer la moelle osseuse à travers un nylon web 70 um et de recueillir le filtrat. Pour extraire la quantité maximale de la moelle osseuse, rincer de manière répétée à partir des extrémités distale et proximale. </li><li> Rincez le tamis avec du PBS et recueillir le filtrat. Déloger soigneusement les débris et les conglomérats cellulaires par agitation douce et pipetage. </li></ol> 1.3 Culture <ol><li> Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec environ 25 ml de milieu. Répéter une fois. </li><li> Resuspendre les cellules dans 6 ml de milieu après la seconde étape de lavage. Mélanger 50 ul de la solution de cellules avec 50 pi de bleu trypan. Compter les cellules dans une chambre de comptage au microscope optique. Calculer le nombre de caunes dans la solution à l&#39;aide de cette formule: <img alt="Equation 1" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" /></li><li> Ensemencer les cellules sur des plaques de surface à très faible fixation 6 puits pour empêcher l&#39;adhérence permanente au fond de la plaque. Utiliser une concentration de 10 6 cellules par ml avec jusqu&#39;à 6 ml par puits. </li><li> Compléter la suspension avec 20 ng / ml de M-CSF pour promouvoir la différenciation cellulaire. </li><li> Culture des cellules pendant 5 jours à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone et d&#39;observer tous les jours. </li></ol> 1.4 La récolte des cellules Remarque: ces étapes doivent être effectuées sur la glace. Procéder à 1.4.1 ou 1.4.2 soit en conséquence. <ol><li> À ce stade, récolter toute la culture, y compris les macrophages différenciés qui adhèrent à la culture plaques, même se ils sont des plaques de surface ultra-faible fixation. <ol><li> Récolter la culture entière par pipetage doux et détacher avec une solution de 4 ° C PBS, 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM d&#39;EDTA. Répétez jusqu&#39;à ce que les plaques sont clairement de rester cellules adhérentes - confirmer sous un microscope en cas de doute. </li></ol></li><li> Sinon, jetez macrophages adhérentes en récoltant le surnageant avec les cellules en suspension, qui contiennent principalement des monocytes. <ol><li> Récolter les cellules non adhérentes avec une solution de PBS sans EDTA et 0,5% de BSA. Ne pas appliquer trop de force pour ne pas déloger les macrophages légèrement adhérentes. </li></ol></li></ol> 1,5 FACS-analyse (Facultatif) Remarque: Il est possible d&#39;épuiser la suspension cellulaire de cellules progénitrices et stem- CD117 + en utilisant des MACS. Utilisez protocoles du fabricant pour cette procédure. <ol><li> Récolter les cellules selon l&#39;une des étapes 1.4.1 ou 1.4.2. </li><li> Centrifuger les cellules à 250 g pendant 10 min à 4 ° C et répéter cette étape. </li><li> Remettre en suspension au moins 250 000 cellules dans 300 pi de FACS buffer par sonde. </li><li> Transfert solution de cellules sur un 96-bien-plaque (30 pi par puits). </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 25 ul d&#39;anticorps à chaque puits (utilisation constructeur dilution). </li><li> Colorer les cellules avec des anticorps (suivant les protocoles du fabricant pour le phénotypage cellulaire après les étapes 1.5.1-1.5.6. Marqueurs couramment utilisés pour l&#39;identification des monocytes / macrophages comprennent CD11b, F4 / 80 (Figure 3), CD115 (Figure 2), et Gr- 1. Remarque: Pour une description plus détaillée des solutions cellulaires, l&#39;utilisation de marqueurs comme CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G et CD192 est recommandé. Caractéristiques cellulaires ont été précédemment décrites 12. </li><li> Incuber les sondes pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger les sondes à 250 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension avec 200 ul de tampon FACS. Répétez eest l&#39;étape deux fois. </li><li> Transférez les sondes dans des tubes FACS et effectuer l&#39;analyse FACS 12. </li><li> Effectuer l&#39;analyse FACS 12 au jour 0, 3 et 5 pour analyser la différenciation cellulaire. </li></ol> 2. Injection veine caudale Préparation 2.1 <ol><li> Réchauffez les animaux sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant environ 10 min. Observer les animaux tout en chauffant à reconnaître les signes de surchauffe. </li><li> Resuspendre les monocytes isolés dans les étapes, 1.1- 1.4, dans 150 ul de NaCl, et de charger les cellules dans une seringue de 1 ml à l&#39;insuline avec une aiguille de 30G. Légèrement vortex la solution avant de charger la seringue pour se assurer que tous les monocytes sont injectés. Toujours manipuler les cellules sur de la glace pour éviter l&#39;attachement de chaleur médiation et l&#39;activation des monocytes. </li></ol> 2.2 Retenir <ol><li> Éviter de déranger les autres souris dans la cage lors du choix d&#39;une souris pour l&#39;injection intraveineuse. </li><li> Passer la souris dans le dispositif de retenue. Eviter trop de prEssure et être prudent avec les membres postérieurs. (Figure 4) Remarque: Vous pouvez également utiliser l&#39;anesthésie générale pour garantir sans stress manipulation des animaux. </li><li> Assurez-vous que la souris possède un espace pour respirer avant la fermeture du dispositif de retenue. </li></ol> 2.3 Injection <ol><li> Désinfecter le site d&#39;injection avec un agent de désinfection. Vaporiser sur la queue de la souris et laisser reposer pendant au moins 1 min. </li><li> Arrêtez veineuse flux sanguin de la queue en appliquant une légère pression sur le côté latéral de la queue au-dessus du site d&#39;injection, pour une meilleure visibilité des veines. </li><li> Mettez la queue de 90 degrés, avant l&#39;injection. (Figure 5) </li><li> Injecter à un angle de 45 degrés. Injecter lentement et pas plus de 5 pi par g pour éviter de nuire animaux. </li><li> Se il ya un blister, qui est un signe d&#39;une injection échoué, cesser immédiatement et répéter l&#39;injection plus proximale. </li><li> Arrêter l&#39;hémorragie sur le côté d&#39;injection en appliquant douce pression pendant environ 1 min. </li><li> A la fin de la procédure, le rétracteur ouvrir et placer la souris dans une cage. </li><li> Observez la souris pendant 20 min pour se assurer que l&#39;animal n&#39;a pas été blessé par l&#39;injection et décubitus sternal est maintenue. Prolonger le délai d&#39;observation jusqu&#39;à ce que la souris reprend conscience suffisante. Retour la souris vers la compagnie d&#39;autres animaux seulement après qu&#39;il a complètement récupéré. </li></ol>

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<li>Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+peripheral+arterial+disease+using+stem+and+progenitor+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy.</a> J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons une méthode simple et rentable pour isoler de grandes quantités de monocytes murins de la moelle osseuse. En comparaison à d&#39;autres protocoles utilisant le sang périphérique, qui obtiennent des rendements de monocytes 5 1.4 x10 6, nous sommes en mesure d&#39;obtenir des rendements plus élevés de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocytes d&#39;une souris donateur. Lors de l&#39;examen des défis avec cette méthode, il est important de mention...

L’isolement des monocytes est important et critique pour de nombreuses études in vitro et in vivo. Ces cellules sont des cibles pour des maladies telles que les maladies artérielles périphériques, les maladies coronariennes ou d’autres maladies ischémiques, car la croissance des vaisseaux collatéraux est fortement stimulée par l’inflammation locale. Les réponses inflammatoires comprennent l’activation endothéliale et le recrutement local de leucocytes, principalement des monocytes, qui se transforment ensuite en macrophages et créent un environnement hautement artériogène en sécrétant plusieurs facteurs de croissance pour induire le remodelage d’une artériole en une artère collatérale fonctionnelle1-3. Les monocytes deviennent également des cellules dendritiques, qui sont fréquemment utilisées pour les études immunologiques4,5 et la recherche sur le cancer6,7.
Le problème dans l’approche d’isolement des monocytes à partir du sang périphérique8 est le nombre élevé d’animaux donneurs nécessaires pour produire une quantité suffisante de monocytes pour la plupart des analyses. Les protocoles précédents décrivent des méthodes telles que la centrifugation par gradient de densité et l’appauvrissement cellulaire via MACS9 lors de l’isolement des monocytes ; Cependant, ces techniques peuvent modifier les caractéristiques et la fonctionnalité des monocytes, ce qui peut entraîner des difficultés d’interprétation10,11. De plus, ces méthodes sont difficiles et peuvent réduire la reproductibilité expérimentale.
Notre objectif avec ce protocole est de fournir une méthode simple et rentable pour générer de grandes quantités de monocytes dérivés de la moelle osseuse. En raison du rendement cellulaire élevé de 11 x 106 ± 3 x 106 cellules obtenues par ce protocole, nous pouvons réduire considérablement le nombre de souris nécessaires lors de l’isolement des monocytes dérivés de la moelle osseuse. La procédure peut être réalisée dans un minimum de temps et sans utiliser les techniques coûteuses et compliquées mentionnées ci-dessus. Ici, nous extrayons les monocytes de la suspension de moelle osseuse native de souris donneuses, cultivons la suspension sur des plaques de fixation ultra-faibles et complétons la solution avec 20 ng/ml de M-CFS. Au 5e jour d’incubation, les cellules sont récoltées et caractérisées pour confirmer les propriétés fonctionnelles et phénotypiques.
Pour les expériences dans le domaine de l’artériogénèse, la transplantation intraveineuse de ces monocytes dérivés de la moelle osseuse chez la souris est une méthode efficace d’administration systémique de médicaments, qui peut être combinée à la ligature de l’artère fémorale dans les modèles courants de maladie artérielle périphérique.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 6 puits à très faible fixation</td><td>Corning Incorporated, NY, États-Unis</td><td></td><td>Plaque à 6 puits à très faible fixation, avec capuchon,</td></tr><tr><td>stérile de 8 à 12 semaines, mâle, souris balb/c ;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coloration bleue à cellules mortes</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>GE Healthcare, Fribourg, Allemagne</td><td></td><td>Fraction V, pH 7.0</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Allemagne</td><td></td><td>28G, 30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience, San Diego, États-Unis</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience, San Diego, États-Unis</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td>Avec bouchon, steril</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Allemagne</td><td></td><td> Centrifugeuse X-15R</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Veet, Mannheim, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agent de désinfection</td><td>Sch&uuml ; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Allemagne</td><td></td><td>Kodan Tinktur</td></tr><tr><td>forte Scalpel jetable n°10&nbsp ;</td><td>Rasoir de sûreté en plumes Co.Ltd, Osaka, Japon&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 96 %²</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml ; cken, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unité d’extraction Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml ; te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>AbD Serotec, D&uuml ; sseldorf, Allemagne</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>tampon FACS&nbsp ;</td><td>Fabriqué par notre groupe avec des composants</td><td></td> uniques <td>PBS, 0,5 % BSA, 0,1 % NaN3</td></tr><tr><td>FACS dispositif</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis BD</td><td></td><td>FACS Canto II</td></tr><tr><td>FACS tubes&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Falcon&reg ;</td><td>Becton Dickenson Labware, NY, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Rubis, Stabio, Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gants</td><td>R&ouml ; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante&nbsp ;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml ; ttingen, Allemagne&nbsp ;</td><td></td><td>Hot Plate 062</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Allemagne</td><td></td><td>Incu safe</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig ; heim, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Allemagne</td><td></td><td>Axiovert 40 &deg ; c</td></tr><tr><td>Facteur de stimulation des colonies de macrophages</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp ; region=DE">SRP3110&nbsp ; </a></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur mécanique</td><td>IKA, Staufen, Allemagne</td><td></td><td>ms2 minishaker</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Microtubes à essai</td><td>Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banc de travail microbiologique</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Allemagne</td><td></td><td>Hera</td></tr><tr><td>safe Monocyte wash buffer&nbsp ;</td><td>Fabriqué par notre groupe avec des composants</td><td></td> uniques <td>PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Souris restrainer</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG, Berlin, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (sodium acide)</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml ; nigshofen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon cellsieve</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis</td><td></td><td>Passoire à cellules, 70 &micro ; m maille</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td>pH 7,4,</td></tr><tr><td>stériles Pipettes</td><td>Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td>10&micro ; L/100&micro ; L / 200 et micro ; l/1 000&micro ; l</td></tr><tr><td>Têtes de pipetage</td><td>Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td>Cellstar 5 ml, 10 ml</td></tr><tr><td>Unité d’aspiration</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Allemagne</td><td></td><td>Vacusafe</td></tr><tr><td>comfort Ciseaux chirurgicaux</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Allemagne</td><td></td><td>1 ml Omnifix&reg ; Seringue insuline -F</td></tr><tr><td>Tubes avec capuchon</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td>15 ml/50 ml Tubes Cellstar</td></tr><tr><td>Bain d’eau chaude</td><td>Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Allemagne</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

En tant que sous-type de leucocytes et progéniteurs de macrophages, les monocytes sont impliqués dans de nombreux processus importants des organismes et font souvent l’objet de divers domaines de la science biomédicale. La méthode décrite ci-dessous est un moyen simple et efficace d’isoler des monocytes murins de la moelle osseuse hétérogène.
La moelle osseuse du fémur et du tibia des souris Balb/c est prélevée par rinçage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La suspension cellulaire est complétée par du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et cultivée sur des surfaces d’attache ultra-faibles pour éviter la différenciation des monocytes déclenchée par l’adhésion. Les propriétés et la différenciation des monocytes sont caractérisées à divers intervalles. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), avec des marqueurs tels que CD11b, CD115 et F4/80, est utilisé pour le phénotypage. À la fin de la culture, la suspension est constituée de 45 %± 12 % de monocytes. En éliminant les macrophages adhésifs, la pureté peut être augmentée jusqu’à 86 %± 6 %. Après l’isolement, les monocytes peuvent être utilisés de différentes manières, et l’une des méthodes les plus efficaces et les plus courantes pour l’administration in vivo est l’injection intraveineuse de la veine de la queue. 
Cette technique d’isolement et d’application est importante pour les études de modèles murins, en particulier dans les domaines de l’inflammation ou de l’immunologie. Les monocytes peuvent également être utilisés à des fins thérapeutiques dans des modèles de maladies chez la souris.

La solution d&#39;extrait cellulaire de la moelle osseuse murine est constituée de divers types de cellules. Les principaux types de cellules sont des lymphocytes, les granulocytes et les monocytes. Les types de cellules peuvent être estimées par la taille et la granularité, qui est représentée sur la figure 1 pour les deux suspensions indigènes et les cellules récoltées après 5 jours de différenciation. Notez la composition cellulaire pendant la culture itinérante. Cependant, la classification exacte d...

Nous présentons ici un protocole qui génère de grandes quantités de monocytes murins à partir de moelle osseuse hétérogène pour des applications translationnelles. Par rapport à d’autres, cette nouvelle méthode permet de réduire le nombre d’animaux sacrifiés et de réduire les coûts en évitant des méthodes coûteuses telles que la séparation magnétique de cellules à gradient élevé (MACS).

Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Bonjour, je m'appelle Helen Kuster et je travaille au sein du groupe de recherche cardiovasculaire du Dr Harold et professeur à l'Université Auto Vica à MacBook. Nous nous intéressons à l'isolement et à la caractérisation des monocytes marins afin de les utiliser comme vecteurs dans la croissance des vaisseaux collatéraux. Les principales étapes suivantes sont nécessaires à la culture des monocytes dérivés de la moelle osseuse : premièrement, l'anesthésie du souris et la dislocation cervicale ; deuxièmement, l'extraction et le rinçage du fémur.Troisième filtration de la moelle osseuse. Quatrième à cinquième étape de lavage avec le milieu, puis culture des cellules dans des plaques à adhérence ultrabasse. Sixième étape : cytométrie en flux.Afin d'extraire les monocytes de la moelle osseuse, la souris sera anesthésiée à l'aide de fluorure d'isoflurane et euthanasiée par dislocation cervicale. La souris sera fixée et les deux membres inférieurs seront séparés à l’aide d’un scalpel stérile. Les fémurs et tibias seront prélevés puis lavés avec de l’éthanol à 96 % pendant au moins 90 secondes.À partir de cette étape, toutes les manipulations doivent être strictement stériles afin d'éviter toute contamination. Les muscles ou les tendons seront retirés de l'os. Le fémur et le tibia sont rincés plusieurs fois avec du PBS tiède.Pour la récolte de la moelle osseuse, les extrémités proximale et distale de chaque os sont coupées à l’aide d’une paire de ciseaux fins. Afin de rincer l’os, nous avons besoin d’une aiguille stéroïde de 28 G, d’une seringue de un millilitre et de 10 à 15 millilitres de milieu par os. Ensuite, la moelle osseuse est filtrée à travers un tamis de 70 micromètres S tout en maintenant l’os avec une pince fine.Rincez les os un par un jusqu'à ce qu'ils deviennent translucides. Afin de minimiser le stress cellulaire, appliquez soigneusement une pression sur le piston de la seringue. Rincez le filtre avec du PBS.Ensuite, les cellules sont centrifugées à 250 G pendant 10 minutes à température ambiante. Et sont resuspendues dans du milieu ? Après cette étape, répétez l'étape une fois de plus.Pour les monocytes dérivés de la moelle osseuse provenant de moelle osseuse native, nous utilisons le milieu M 199 contenant 1 % de pénicilline et de streptomycine ainsi que 10 % de sérum de veau fœtal. En outre, nous ajoutons 20 nanogrammes par millilitre de M-CSF le premier jour. Huit nanogrammes par millilitre d'interféron gamma sont ajoutés le dernier jour de culture au milieu.Si l'on souhaite une surexpression des CMH de classe II, les cellules sont ensemencées dans des plaques à adhérence ultra-faible dotées de puits profonds afin d'empêcher leur adhérence permanente au fond. Nous utilisons une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre, avec jusqu'à six millilitres par puits. La période de culture est de cinq jours à une température de 37 °C et sous 5 % de dioxyde de carbone.Les cellules sont examinées quotidiennement après cinq jours, entre 60 et 80 % des cellules étant des monocytes. Je m'appelle Martin Bachner et je suis étudiant en médecine à l'Université Auto Fungi, au Département de cardiologie, d'anologie et de chronologie. Lorsque vous effectuez une injection intraveineuse, il est important de beaucoup vous entraîner auparavant, car sinon vous ne serez pas en mesure d'appliquer les monocytes de manière adéquate.Des expériences ont montré que les monocytes sont plus efficaces pour améliorer l'agénésie artérielle lorsqu'ils sont administrés par voie systémique. Une méthode courante d'administration systémique de médicament est l'injection intraveineuse par la queue. Dans notre cas, nous injectons 2,5 millions de monocytes, qui sont mis en suspension dans du chlorure de sodium.Il y a quatre vaisseaux dans la queue des artères murines situés sur les côtés ventral et dorsal, et deux veines sur le côté latéral. Ainsi, pour une injection dans la veine de la queue (WA), il faut tourner la queue d'environ 90 degrés. Pour faciliter la procédure, la souris doit être réchauffée à l’aide d’un tapis chauffant pendant environ 10 minutes.Les animaux doivent être observés en les réchauffant. Cela est important pour reconnaître les signes de surchauffe. De plus, nous avons besoin de cet agent infectieux et d'un ensemble d'aiguilles de 30 géné sur une seringue d'insuline d'un millilitre.Fixez soigneusement l'animal dans un dispositif de contention, ce qui facilite grandement l'injection dans la queue. Assurez-vous que la souris dispose d'un espace suffisant pour respirer avant de charger la solution dans la seringue. Vortexez la solution de monocytes afin de garantir que tous les monocytes puissent être injectés.Effectue une désinfection du site d'injection afin d'éviter toute infection, prenez la queue entre votre pouce et votre index. Au point le plus distal, l'aiguille est insérée selon un angle plat. Si elle est correctement placée dans la veine, il est très facile d'injecter la solution de monocytes.S'il y a une cloque, c'est un signe d'injection incorrecte. Vous devez arrêter immédiatement et essayer à nouveau. Proximalement, essayez toujours d'injecter lentement et jamais plus de cinq microlitres par gramme.Si l'injection a réussi, arrêter le saignement au site d'injection en appliquant une pression douce pendant environ une minute. À la fin de la procédure, ouvrir le rétracteur et placer la souris dans sa cage afin de caractériser les monocytes. Nous utilisons les anticorps avec une combinaison d'antigènes, à savoir CD 11 B, F quatre 80, CD 115 et GL un.L'expression de ces antigènes est corrélée à un stade de développement permettant d'analyser les monocytes. Nous avons effectué les analyses aux jours 0, 3, 5 et 7 ; la pureté des monocytes augmente jusqu'à 90 % au jour 5. Pour atteindre cette pureté, il est important de fortement éliminer les macrophages résidents.Les cellules non terrines sont éliminées en utilisant un tampon de lavage sans EDTA. Pour éliminer les cellules terrines, nous utilisons un tampon de lavage contenant de l'EDTA et une pipettage douce. Ce diagramme montre les principaux types cellulaires destinés à leur culture monocouche.Les différents types cellulaires illustrés sont : un lymphocytes, deux monocytes, trois granulocytes, avec une augmentation de la pureté des monocytes après le cinquième jour. Et culture. Remarquez le changement de composition cellulaire au cours de la culture : la population cellulaire comprend un monocytes et deux macrophages.Figure deux, chronologie de l'expression de CD115 au cours de la différenciation. Remarquez que plus de 95 % de toutes les cellules sont positives pour CD115 après cinq jours de différenciation, indiquant que la grande majorité des cellules sont soit des monocytes, soit des macrophages. La classification peut être basée sur la taille et la granularité des cellules, mais les marqueurs cellulaires spécifiques sont plus fiables.Figure trois, augmentation de l'expression de la maturité des monocytes et des macrophages. Marqueur F quatre 80, jour cinq, noter l'apparition d'une population présentant une expression intermédiaire de F quatre 80, ce qui est compatible avec un phénotype de monocyte. Jour sept, noter le décalage vers la droite de l'expression de F quatre 80, en accord avec la maturation des macrophages.L'isolement des monocytes est essentiel pour de nombreuses études in vitro et in vivo. Ces cellules constituent une cible intéressante, par exemple dans le cadre de maladies telles que la maladie artérielle périphérique ou la maladie coronarienne, qui sont liées à l'ischémie. La moelle osseuse provenant du fémur et de la tibia de souris biopsiées est recueillie par lavage des os avec un milieu chaud ; la suspension cellulaire est complétée avec du M-CSF et cultivée sur des surfaces ultra-lisses ne favorisant pas l'attachement, afin d'éviter la différenciation induite par l'adhérence des monocytes. Les propriétés et la différenciation des monocytes sont vérifiées à différents moments et selon différents critères à l'aide de marqueurs tels que CD11b, CD115 et FO80, utilisés pour le phénotypage des cellules.Si l'on souhaite une administration systémique du médicament, l'injection intraveineuse constitue un moyen simple et efficace. Nous avons décrit une méthode permettant d'isoler de grandes quantités de monocytes MI à partir de moelle osseuse, de manière simple et économique. Grâce à cette nouvelle méthode, nous sommes capables de produire environ 11 millions de monocytes par souris.

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