Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

Bonjour, je m’appelle Helen Kuster et je travaille au groupe de recherche cardiovasculaire du Dr Harold et professeur à l’Université Auto Vica en MacBook. Nous nous intéressons à la caractérisation de l’isolement des monocytes marins afin de les utiliser pour les véhicules dans la croissance collatérale des navires. Les principales étapes suivantes sont nécessaires pour la culture des monocytes dérivés de la moelle osseuse, la première anesthésie de souris et la luxation cervicale, la deuxième extraction et le rinçage du fémur.

Troisième filtrage de la moelle osseuse. Quatrièmement aux étapes de lavage avec un cinquième moyen, culture des cellules sur des plaques de fixation ultra-basses. Sixième cytométrie en flux.

Afin d’extraire les monocytes de la moelle osseuse, la souris sera anesthésiée à l’aide de fluor ISO et euthanasiée par luxation cervicale. La souris sera réparée et les deux membres inférieurs seront séparés avec un scalpel stéroïdien. Le fémur et le tibia ont été prélevés et lavés avec de l’éthanol à 96 % d’Ethan pendant au moins 90 secondes.

Après cela, toutes les étapes doivent être strictement stériles pour éviter toute contamination. Les muscles ou les tendons seront retirés de l’os. Le fémur et le tibia sont rincés plusieurs fois avec du PBS chaud.

Pour prélever la moelle osseuse, les extrémités proximale et distale de chaque os sont coupées avec une paire de ciseaux fins. Pour rincer l’os, nous avons besoin d’une aiguille de stéroïde de 28 G, d’une seringue d’un millilitre et de 10 à 15 millilitres de milieu par os. Ensuite, la moelle osseuse est filtrée à travers un S de 70 micromètres tout en tenant l’os avec une pince fine.

Rincez les os un par un jusqu’à ce qu’ils deviennent illusionnés. Afin de minimiser le stress cellulaire, appliquez soigneusement une pression sur le tampon de la seringue. Rincez le siet avec du PBS.

Ensuite, les cellules sont centrifugées à 250 G pendant 10 minutes à température ambiante. Et les reus sont-ils suspendus avec du fluide ? Après cette étape, répétez l’étape une fois de plus.

Pour les monocytes dérivés de la moelle osseuse native, nous utilisons du M 199 avec 1 % de pénicilline et de streptomycine et 10 % de sérum contre la toux fœtale. De plus, nous ajoutons 20 nanogrammes par millilitre d’INE MCSF le premier jour. Huit nanogrammes par millilitre d’interférer gamma sont ajoutés au milieu le dernier jour de la culture.

Si l’on souhaite une régulation positive du CMH deux, les cellules sont ensemences dans des plaques de fixation ultra-basses avec des puits épais pour empêcher une adhérence permanente sur le fond. Nous utilisons une concentration d’une fois 10 à six cellules par millilitre avec jusqu’à six millilitres par puits. La période de culture est de cinq jours à une température de 37 degrés et 5 % de dioxyde de carbone.

Les cellules sont contrôlées quotidiennement après cinq jours entre 60 et 80 % des cellules sont des monocytes. Je m’appelle Martin Bachner et je suis étudiant en médecine ici à l’Université Auto Fungi au Département de cardiologie, d’anologie et de chronologie. Et lorsque vous faites l’injection intraveineuse, il est important de beaucoup pratiquer avant de le faire car sinon vous ne pourrez pas appliquer les monocytes de manière adéquate.

Des expériences ont montré que les monocytes sont plus efficaces pour améliorer l’agénésie artistique lorsqu’ils sont appliqués de manière systémique. Une méthode courante d’application systémique de médicament est une injection de queue WA. Dans notre cas, nous injectons 2,5 millions de monocytes, qui sont remis en suspension, et du chlorure de sodium.

Il y a quatre vaisseaux dans la queue des artères de la souris sur les côtés ventral et dorsal, et deux déclinaisons sur le côté latéral. Donc, pour l’injection WA, nous devons tourner la queue d’environ 90 degrés. Pour faciliter la procédure, la souris doit être réchauffée à l’aide d’un coussin chauffant pendant environ 10 minutes.

Les animaux doivent être observés en se réchauffant. Ceci est important pour reconnaître les signes de surchauffe. De plus, nous avons besoin de cet agent infectieux et d’une aiguille de 30 gènes placée sur une seringue d’insuline d’un millilitre.

Fixez soigneusement l’animal dans une contention, ce qui le rend beaucoup plus facile à injecter dans la queue. Assurez-vous que la souris dispose de suffisamment d’espace pour respirer avant de charger la solution dans la seringue. Vortex, la solution de monocytes pour s’assurer que tous les monocytes peuvent être injectés.

Désinfecte le site d’injection pour éviter l’infection, prenez la queue entre votre battement et votre index. Au point le plus distal, l’aiguille est insérée dans un angle plat. S’il est placé dans la veine, il est très facile d’injecter la solution de monocytes.

S’il y a une ampoule, c’est le signe d’une mauvaise injection. Vous devriez vous arrêter immédiatement et essayer plus. Proximal, essayez toujours d’injecter lentement et pas plus de cinq microlitres par gramme.

Si l’injection a réussi, arrêtez le saignement au site d’injection en appliquant une légère pression pendant environ une minute. A la fin de la procédure, ouvrez l’écarteur et placez la souris dans sa cage pour caractériser les monocytes. Nous utilisons les effets avec une combinaison d’antigènes, à savoir CD 11 B, F quatre 80, CD 115 et GL un.

L’expression de ces antigènes est corrélée à un stade de développement de l’analyse des monocytes. Nous avons fait les faits les jours 0, 3, 5 et sept, la pureté des monocytes augmente jusqu’à 90 % le cinquième jour. Pour atteindre cette pureté, il est important d’épuiser les macrophages fortement terrinés.

Les cellules non terrines sont épuisées en utilisant un tampon de lavage sans EDTA. Pour épuiser les cellules terrines, nous utilisons de l’EDTA contenant du lavage, un tampon et des caresses douces. Ce schéma montre les principaux types de cellules pour leur culture à une extrémité.

Les différents types de cellules représentés sont un lymphocyte, deux monocytes, trois granulocytes, augmentant la pureté des monocytes après le cinquième jour. Et la culture. Notez que la composition cellulaire changeante au cours de la population cellulaire de culture comprend un monocytes et deux macrophages.

Figure deux, chronologie de l’expression de CD 115 au cours de la différenciation. Notez que plus de 95 % de toutes les cellules sont positives pour le CD 115 après cinq jours de différenciation, ce qui indique que la grande majorité des cellules sont soit des monocytes, soit des macrophages. La classification peut être basée sur la taille et la granularité des cellules, mais des marqueurs cellulaires spécifiques sont plus fiables.

Troisième figure, augmentation de l’expression de la maturité des macrophages monocytaires. Le marqueur F quatre 80, jour cinq, note l’apparition d’une population avec une expression intermédiaire de F quatre 80, ce qui est cohérent avec le phénotype monocytaire. Le septième jour, notez le décalage vers la droite de l’expression de F quatre 80 compatible avec la maturation des macrophages.

L’isolement des monocytes est important et essentiel pour de nombreuses études in vitro et in vivo. Ces cellules sont une cible intéressante, par exemple, en lien avec des maladies comme les maladies artérielles périphériques ou les maladies coronariennes, qui sont liées à l’ischémie. La moelle osseuse de la FEMA et du tibia des souris biopsiques est prélevée par rinçage des os avec une suspension cellulaire moyenne chaude, est complétée par du MCSF et cultivée sur des surfaces d’attache ultra basses pour éviter l’adhésion, la différenciation des propriétés des monocytes et la différenciation des monocytes est vérifiée à différents moments et les faits avec des marqueurs tels que CD 11 b, CD 115 et FO 80 sont utilisés pour phénotyper les cellules.

Si l’administration systémique de médicament est souhaitée, l’injection intraveineuse est un moyen facile et efficace de le faire. Nous avons décrit la méthode permettant d’isoler de grandes quantités de monocytes IM de la moelle osseuse de manière simple et rentable. Avec cette nouvelle méthode, nous sommes en mesure de générer environ 11 millions de monocytes par souris.