Name: Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec lexpression et lactivité transcriptionnelle des astrocytes KCNJ10 (Kir4.1) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez comment évaluer la méthylation de l'ADN du gène KCNJ10 dans les astrocytes et corréler ces changements épigénétiques avec l'activité transcriptionnelle. Cette méthode combine MS.HRMA et essai luciférase.

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Ce travail a été soutenu par R01NS075062-01A1. Tri FACS effectué dans l’installation UAB Comprehensive Flow Cytometry Core (P30 AR048311, P30 A1027767). Le Dr Scott Philips de la plateforme de neurobiologie de l’UAB et la Dre Susan Nozell de l’UAB CDIB ont aidé avec les aspects techniques du test de la luciférase.

Tous les animaux ont été traités en conformité avec les Instituts nationaux de la santé des lignes directrices. Le soin et l&#39;utilisation Comité animale de l&#39;Université de l&#39;Alabama à Birmingham a approuvé l&#39;utilisation des animaux. 1. Obtenir l&#39;ARN et l&#39;ADN à partir d&#39;une population enrichie en utilisant astrocytique cellulaire activé par fluorescence (FACS) des astrocytes Whole Brain Tissue <ol><li> Animaux Sedate avec le CO 2 pendant 1 min, puis décapiter rapidement. Disséquer cortex comme décrit dans Albuquerque et al, 26.; il est pas nécessaire de retirer les méninges. Remarque: les rats transgéniques exprimant eGFP sous la S100β (un marqueur des astrocytes) promoteur ont été générés par Itakura et al 27 et utilisés pour FACS tri des astrocytes.. </li><li> Préparer homogénat de cerveau entier en utilisant un kit de dissociation de la papaïne dans des conditions non stériles selon le protocole du fabricant. Heat-activer la papaïne à 37 ° C au bain-marie pendant 10 min. Note:Solution de papaïne est fourni par le fabricant et qui contient la L-cystéine et de l&#39;EDTA (voir le tableau des matériaux). <ol><li> Couper ou dremel un trou dans la partie supérieure d&#39;un tube conique de 50 ml pour permettre à un tube de transport 95% O 2: 5% de CO 2 pour être introduit dans un tube conique fermée (figure 1A). Placez cortex disséqués en 10mm boîte de culture contenant un milieu de dissociation (MEM complété avec 20 mM de glucose et de la pénicilline / streptomycine (500 U / ml) et équilibrée à 95% O 2: 5% de CO 2) et d&#39;utiliser une lame de rasoir propre pour hacher tissu dans 1 x 1 mm 2 pièces. </li></ol></li><li> Tissus de transfert en utilisant 10 ml de Pipteman manuel à 50 ml tube conique de solution contenant de la papaïne. Permettre au tissu de se déposer au fond de pipette de transfert avant de décharger de minimiser la quantité de support de dissociation reportés. Conserver la solution de papaïne équilibrée à 95% d&#39;O 2: 5% de CO 2 par l&#39;intermédiaire d&#39;un échange de gaz de la surface de la durée de l&#39;incubation. Ne bulle papaïne solutisur. Incuber les tissus pendant 20 min dans 37 ° C bain d&#39;eau. </li><li> Après incubation dans une solution de papaïne, la trituration tissu 10 fois avec une pipette 10 ml de transfert à vitesse lente. Centrifugeuse suspension cellulaire nuageux à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. <ol><li> Equilibrer solution d&#39;inhibiteur de DNase / albumine (fourni par le fabricant) par l&#39;intermédiaire d&#39;un échange de gaz de surface et remettre en suspension les cellules rassemblées en un culot dans 3 ml de solution d&#39;inhibiteur / albumine de DNase. Préparer gradient de densité commerciale discontinue suivant les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Spin gradient de densité discontinu à 1000 g pendant 6 min. Isoler les cellules dissociées du fond du tube en suçant culot fond à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Re-suspendre cellules dissociées dans 3.2 ml de DPBS avec 0,02% d&#39;albumine de sérum bovin et 1 mg / ml de DNase ou mises en mémoire tampon HEPES préférés milieux de culture. Passez à travers 40 um filtre avant FACS (figure 2A). Gardez cellules sur la glace jusqu&#39;à ce que le tri. <ol><li> Effectuer FACS 28. &lt;/ li&gt; <li> Cellules de culot dans 1,5 ml tubes de centrifugation à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C. Remarque: Les astrocytes peuvent être utilisées sous forme de culot immédiatement ou conservés à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;extraction de l&#39;ADN. </li></ol></li><li> Extrait ARN et l&#39;ADN en utilisant la méthode d&#39;isolement préféré 29 30. Évaluer l&#39;ARN et de l&#39;ADN et la concentration qualité via spectrophotomètre et bioanalyseur 31. Remarque: Utilisez uniquement l&#39;ARN de haute qualité et de l&#39;ADN dans des étapes ultérieures, 260/280 = 2,0-2,2 et 1,8-1,9, respectivement. Bioanalyzer analyse est essentielle pour évaluer la dégradation des ARN ou fragmentation de l&#39;ADN. ARN ou d&#39;ADN peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à -80 ° C ou -20 ° C, respectivement pour des études ultérieures. </li></ol> 2. Évaluer méthylation de l&#39;ADN Statut d&#39;un gène à l&#39;aide sensible à la méthylation haute résolution Melt analyse (MS-AGRH) <ol><li> Entrez séquence de gène d&#39;intérêt dans le logiciel de cartographie de méthylation en ligne préféré pour identifier les îlots CpG dans le gèned&#39;intérêt 32. <ol><li> Conception des amorces contre converties au bisulfite de l&#39;ADN 33 séquence et amplifient l&#39;aide d&#39;ADN polymerase préférée selon le protocole du fabricant. Vérifier la taille du produit amplifié par l&#39;exécution d&#39;un gel d&#39;ADN agarose à 1% à 100 V pendant 45 min. Amorces de magasins à concentration stock de 20 pm à -20 ° C. </li></ol></li><li> Bisulfite convertir 500-1000 ng d&#39;ADN de chaque échantillon et de l&#39;ADN méthylé normes allant de 0-100% de ces mêmes espèces animales 34. Éluées des échantillons pour fournir une concentration de 20 ng / ul. Vérifiez la concentration de l&#39;ADN converti au bisulfite via spectrophotomètre 31. </li><li> Configuration 20 réactions pi pour l&#39;amplification MS-GRH utilisant polymérase et des amorces d&#39;ADN préférée à une concentration de 5 uM selon le Tableau 1 et 2. Exécuter tous les échantillons, y compris l&#39;ADN et méthylés normes FACS, en trois exemplaires. </li><li> Selon le logiciel d&#39;analyse, définissez pré- et post démarrer et arrêter les paramètresautour des transitions de la courbe de fusion. Régler le début de pré-fusion et paramètres d&#39;arrêt pré-fusion de sorte que la différence entre les deux est de 0,2 à 0,5 ° C. Set Start post-fusion et post-fusion arrêter similaire. Extraire des données de différence de température de pointe pour chaque échantillon. </li><li> Utilisation de normes pour cent méthylés (valeur Y) et de leurs différences de température moyenne de crête correspondantes (x-valeur) générer une équation de régression linéaire (figure 3A-B, tableau 4.3). Utiliser cette équation de régression linéaire pour estimer l&#39;état de méthylation des 35 échantillons inconnus. </li></ol> 3. Evaluation Hyper-méthylé activité promotrice par utilisation de Luciferase Assay <ol><li> Identifier les îlots CpG de gène cible (étape 2.1). Amplifier par PCR des régions d&#39;intérêt 36 et clone en amont du Firefly gène rapporteur luciférase pour produire de luc2 plasmides CpG-île-luc2 37. </li><li> Linéariser 30 ug de plasmide CpG-île-luc2 via restriction38 digestion enzymatique. Vérifiez les sites de digestion de restriction et éviter les coupures doubles en utilisant le logiciel de coupe préféré 38. Inactiver les enzymes à la chaleur à la température et la durée appropriée après digestion selon le protocole du fabricant. Une perte minimale de l&#39;ADN se produit au cours de l&#39;étape de linéarisation. </li><li> Méthylations plasmides linéarisés en utilisant CpG méthylase (M.Sssl) O / N à 30 ° C non traitée ou laisser le protocole du fabricant de suite, sauf pour les ajustements suivants. </li><li> Effectuer des réactions de 50 pi. </li><li> Utilisez 5 unités de CpG méthylase de méthyler 700 ng de plasmide linéarisé. </li><li> Exécutez réactions O / N pour 13-19 h. </li><li> Après CpG réaction de méthylase, effectuer le nettoyage à l&#39;aide d&#39;ADN standard, disponibles dans le commerce membrane de gel de silice nettoyer kit selon le protocole du fabricant. Des pertes importantes de l&#39;ADN se produisent suite à CpG réaction de méthylase, 30-60% de perte. </li><li> Vérifiez la méthylation de plasmides via une restriction Hpa II Digest. </li&gt; <li> Prendre 1 ug d&#39;ADN méthylé ou non méthylé et digestion de restriction avec Hpa II pendant 1 heure à 37 ° C. Utilisez 5-10 unités de Hpa II pour chaque pg d&#39;ADN. Après la digestion Hpa II, effectuer le nettoyage de l&#39;ADN en utilisant une membrane disponible dans le commerce de gel de silice nettoyer kit préféré,. Exécuter deux plasmides méthylés et non méthylés CpG sur un gel d&#39;agarose de l&#39;ADN de 1% dans du tampon TAE ou TBE à 100 V pendant 45 min pour la visualisation (figure 4B). </li><li> Plasmides Sujet fois méthylés et non méthylés à double digestion avec des enzymes de restriction appropriées pour libérer toute la longueur luc 2 (vecteur) et l&#39;île de CpG (insert) 38 fragments. Effectuez double digestion O / N à la température appropriée et enzymes de chaleur inactiver après digestion selon le protocole du fabricant. Une perte minimale de la concentration de l&#39;ADN se produit pendant deux digestion de restriction. </li><li> Exécutez plasmides double digestion sur gel ADN agarose à 1% à 100 V pendant 1 heure pour permettre la séparation of vecteur et insérez (figure 4C). Attention. Le port de protection UV écran facial, placer le gel de l&#39;ADN sur une lumière noire de table à visualiser les bandes. Basé sur la taille, l&#39;accise insert méthylé et non méthylé et non méthylé vecteur en utilisant une lame chirurgicale propre. </li><li> ADN extrait sur gel en utilisant du phénol saturé, pH 6,6. Brièvement, peser gel d&#39;ADN contenant le vecteur ou insert. Utilisez 100 pi de phénol par 0,1 gramme de gel d&#39;ADN. Homogénéiser gel de l&#39;ADN dans le phénol utilisant dounce de verre homogénéisateur. </li><li> Ajouter chloroforme (en utilisant 1/5 du volume de phénol) et agiter les échantillons pendant 20 sec. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 2-3 min. Centrifugeuse pendant 15 min à la vitesse max (16,1 x 1000 XG) à 4 ° C. </li><li> Retirer solution aqueuse et ajouter le volume de 0,1X de 3 M d&#39;acétate de sodium et le volume d&#39;éthanol 2.5X. Incuber les échantillons pendant 1 heure à -80 ° C. Après l&#39;incubation, éliminer l&#39;éthanol et remettre en suspension l&#39;ADN dans 30 ul de tampon préféré. Perte significative de l&#39;ADN se produit l&#39;isolement suivant des inserts et des vecteurs, 30-50% loss. </li><li> Re-ligaturer inserts méthylés et non méthylés à vecteur non-méthylé en utilisant l&#39;ADN ligase T4 38. Utiliser un rapport de 1: 4 de vecteur à insérer pour des réactions de ligature. Réaction de configuration selon les instructions du fabricant. Utiliser un volume total de 50 pi pour les réactions et incuber O / N à -20 ° C ou sur de la glace avec couvercle sur le seau à glace. </li><li> Après la ligature, effectuez l&#39;ADN en utilisant une membrane nettoyage disponible dans le commerce de gel de silice nettoyer kit préféré,. Perte significative de l&#39;ADN se produisent après la réaction de ligature, environ une perte de l&#39;ADN de 30-50%. Vérifier re-ligature en exécutant sur ​​gel à 1% d&#39;agarose de l&#39;ADN à 100 V pendant 45 min et à évaluer la concentration de plasmides re-ligaturé (figure 4D). </li><li> Transfecter des plasmides méthylés ou non méthylés dans des cellules D54 en utilisant un réactif de transfection du commerce, selon le protocole du fabricant. Cellules D54 de semences sur la plaque de 12 puits à 0,14 x 10 6 cellules / puits. </li><li> Après 24 h, les cellules transfecter wides concentrations égales e de soit (1) plasmide non methyated CpG luc2 + Renilla ou un autre vecteur de contrôle de la luciférase ou (2) méthylé plasmide CpG luc2 + Renilla ou un autre vecteur de contrôle de la luciférase. </li><li> Laisser les cellules pour la transfection pendant 24 heures avant d&#39;effectuer des dosages de la luciférase double. Effectuer dosage selon les instructions du fabricant. Effectuer des relevés au moyen d&#39;un luminomètre. Lire chaque puits en triple. </li><li> Calculer le rapport de l&#39;activité de la luciférase de luciole de Renilla ou une autre activité de la luciférase de contrôle. Normaliser Firefly méthylé: activité de la luciférase de commande Firefly non méthylé: activité de la luciférase de contrôle en divisant l&#39;activité de la luciférase méthylé par l&#39;activité de la luciférase non-méthylé </li></ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Ce protocole décrit l’isolement d’une population enrichie d’astrocytes via FACS ainsi qu’une variété de techniques qui permettent des études à la fois corrélatives et causales entre la méthylation de l’ADN et l’expression génique. Ces techniques, utilisées isolément ou en combinaison, sont particulièrement utiles pour les laboratoires qui travaillent avec des tissus de haute hétérogénéité cellulaire ou qui s’intéressent à l’état de méthylation de l’ADN d’un gène ou d’une région génique particulière par rapport aux change...

L’épigénétique est l’étude des modifications chimiques qui peuvent affecter l’activité transcriptionnelle du génome. Essentiellement, sans changement dans la séquence d’ADN, les modifications épigénétiques telles que la méthylation de l’ADN, l’acétylation des histones et la méthylation des histones sont suffisantes pour modifier de manière réversible les modèles d’expression génique 1. La méthylation de l’ADN, un puissant régulateur de l’expression des gènes, est la modification épigénétique la mieux caractérisée. La méthylation de l’ADN est la fixation covalente des groupes méthyles sur la position C5 d’une cytosine, généralement la cytosine d’une cytosine-guanine dinucléotide, également connue sous le nom de site CpG. Les zones qui contiennent une forte densité de sites CpG sont appelées îlots CpG (CGI). Les CGI sont fréquemment associés aux sites de départ transcriptionnel (TSS) et aux promoteurs de gènes 1 à 3. Ainsi, alors que les changements dans la méthylation de l’ADN aux CGI ne sont pas toujours concomitants avec des changements dans l’expression ou la fonction cellulaire, les changements dans la méthylation de l’ADN aux CGI peuvent exercer une puissante régulation sur l’activité transcriptionnelle 2. 
Historiquement, la méthylation de l’ADN a été observée comme essentielle dans l’embryogenèse, l’empreinte et le développement, avec de petits changements dans les niveaux de méthylation de l’ADN se produisant dans les cellules post-mitotiques (à l’exception des altérations dans les gènes liés au cancer) 4,5. Cependant, le domaine de la neuroépigénétique a mis en évidence un rôle non développemental important pour la méthylation de l’ADN. Plus précisément, l’épigénétique cognitive a redéfini la méthylation de l’ADN comme un mécanisme hautement plastique faisant partie intégrante de la médiation de l’activation transcriptionnelle et de la répression des gènes essentiels au processus d’apprentissage et de mémoire 6. Outre l’épigénétique cognitive, les études modélisant les lésions ischémiques et la douleur neuropathique caractérisent la méthylation de l’ADN comme un mécanisme labile qui répond rapidement à une variété d’agressions du SNC 7-9. En ce qui concerne les astrocytes, plusieurs sources de preuves suggèrent que la méthylation de l’ADN joue un rôle important dans l’astrogliogenèse. Fan et al., ont constaté que la KO conditionnelle de DNMT1 dans les cellules progénitrices neurales (NPC) entraînait un développement précoce d’astrocytes concordant avec un état global d’hypométhylation 10. De plus, Perisic et al. ont conclu que les niveaux différentiels de méthylation de l’ADN du promoteur GLT-1 médiaient les niveaux différentiels d’expression du transporteur de glutamate dans le cortex et le cervelet, mettant l’accent sur un rôle dans la méthylation de l’ADN dans l’établissement de modèles spécifiques à la région cérébrale de l’expression des gènes astrocytaires 11. Dans l’ensemble, de nombreuses études soulignent la nature dynamique et labile de la méthylation de l’ADN dans le SNC, car il a été démontré que l’environnement, les médicaments et les lésions modifient la méthylation de l’ADN et, souvent, l’expression des gènes 4,9. Ensemble, ces études neuroépigénétiques indiquent que la méthylation de l’ADN est une cible thérapeutique réalisable ayant le potentiel d’atténuer une variété de pathologies du SNC.
À mesure que le domaine de l’épigénétique élargit sa compréhension du rôle de la méthylation de l’ADN dans le développement neurologique et la maladie, le défi de déplacer la méthylation de l’ADN vers une cible thérapeutique consiste à réaliser des études non seulement corrélatives, mais aussi causales qui définissent des cibles et des sites génétiques spécifiques. De plus, l’étude des changements dans la méthylation de l’ADN spécifiques à la région du cerveau et au type de cellule reste un défi continu et digne d’intérêt unique au domaine de la neuroépigénétique. Ce protocole utilise une variété de techniques, notamment le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des astrocytes, l’analyse à haute résolution de la fusion sensible à la méthylation (MS-HRM) et un test de méthylation luciférase pour étudier l’état de méthylation de l’ADN de KCNJ10, un gène qui code pour Kir4.1. Kir4.1 est un canal potassique glial spécifique qui démontre à la fois des modèles d’expression spécifiques à la région du cerveau et aux cellules dans le SNC 12-16. L’expression de Kir4.1 augmente en se déplaçant des régions rostrale vers les régions caudales du SNC, l’expression la plus élevée se produisant dans la moelle épinière 15. Bien que le canal soit exprimé dans les cellules épendymaires, les oligodendrocytes et leurs cellules précurseurs, Kir4.1 est principalement exprimé dans les astrocytes et est considéré comme essentiel pour maintenir les niveaux homéostatiques de potassium ainsi que pour soutenir l’absorption du glutamate en fixant le potentiel de membrane de repos astrocytaire à un -80mV hyperpolarisé 12,16-19. Il est important de noter que l’expression de Kir4.1 est non statique à la fois pendant le développement et après plusieurs formes de lésions du SNC 20-25. Nous avons souhaité examiner la régulation épigénétique de ce canal, en particulier dans les astrocytes au cours du développement. Les techniques utilisées offrent des analyses de sites CpG spécifiques et ciblées qui fournissent des preuves causales d’un rôle de la méthylation de l’ADN dans la régulation de l’expression du gène KCNJ10. Ces techniques peuvent être appliquées à d’autres gènes.

<table><tbody><tr><td>Système de dissociation de la papaïne</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit d’ADN/ARN AllPrep</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Primer</td> Logiciel <td>en ligne</td> d’Applied <td>Biosystems</td><td>pour localiser les îles CpG Kit</td></tr> de <tr><td>méthylation de l’ADN EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Rat Premixed Calibration Standard</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG Méthylase (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction&nbsp ;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Utilisé pour l’extraction de gel et le nettoyage de l’ADN</td></tr><tr><td></td><td>Enzymes de restriction New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB cutter</td><td>New England BioLabs</td><td>vérification en ligne</td> des <td>sites de digestion</td></tr><tr><td>de restriction Dual Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2 vecteur, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>renilla vecteur, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminomètre</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX et Plus Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Phénol, pH saturé 6,6/6,9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophtomètre</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de fusion haute résolution (HRM) v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel AB SDS v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>en ligne</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting Guide de mise en route&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>en ligne</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Système rapide en temps réel</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

corréler spécifique du gène adn changements méthylation avec l&#39;expression et l&#39;activité transcriptionnelle des astrocytes<em&gt; kcnj10</em&gt; (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

La méthylation de l’ADN sert à réguler l’expression génique par la fixation covalente d’un groupe méthyle sur la position C5 d’une cytosine dans une cytosine-guanine dinucléotide. Alors que la méthylation de l’ADN fournit des changements durables et stables dans l’expression des gènes, les modèles et les niveaux de méthylation de l’ADN sont également sujets à des changements en fonction d’une variété de signaux et de stimuli. En tant que telle, la méthylation de l’ADN fonctionne comme un régulateur puissant et dynamique de l’expression des gènes. L’étude de la neuroépigénétique a révélé une variété d’états physiologiques et pathologiques associés à des changements globaux et spécifiques aux gènes dans la méthylation de l’ADN. Plus précisément, des corrélations frappantes entre les changements dans l’expression des gènes et la méthylation de l’ADN existent dans les troubles neuropsychiatriques et neurodégénératifs, pendant la plasticité synaptique et après une lésion du SNC. Cependant, alors que le domaine de la neuroépigénétique continue d’élargir sa compréhension du rôle de la méthylation de l’ADN dans la physiologie du SNC, il est essentiel de délimiter les relations causales en ce qui concerne les changements dans l’expression des gènes et la méthylation de l’ADN. De plus, en ce qui concerne le domaine plus large des neurosciences, la présence de vastes différences régionales et cellulaires nécessite des techniques qui tiennent compte de ces variances lors de l’étude du transcriptome, du protéome et de l’épigénome. Ici, nous décrivons le tri FACS des astrocytes corticaux qui permet l’examen ultérieur de la transcription de l’ARN et de la méthylation de l’ADN. De plus, nous détaillons une technique pour examiner la méthylation de l’ADN, l’analyse à haute résolution sensible à la méthylation (MS-HRMA) ainsi qu’un test de promoteur de la luciférase. Grâce à l’utilisation de ces techniques combinées, on est en mesure non seulement d’explorer les changements corrélatifs entre la méthylation de l’ADN et l’expression des gènes, mais aussi d’évaluer directement si les changements dans le statut de méthylation de l’ADN d’une région génique donnée sont suffisants pour affecter l’activité transcriptionnelle.

Une population enrichie de astrocytes a été acquis par l&#39;intermédiaire de tri FACS de eGFP-S100β animaux transgéniques 27. En raison de la diminution de la qualité cellules et des molécules moléculaires isolées chez les animaux âgés de plus de 50 jours après la naissance (p50), les animaux âgés de P0-P40 sont optimales pour de telles expériences. Tissu cortical a été utilisé pour ces expériences. Cortex de deux à six animaux ont été mis en commun. FACS a été effectuée à l&#39;installation complète UAB cyt...

La méthylation de l’ADN est capable de maintenir des niveaux stables d’expression génique et de permettre des changements dynamiques dans l’expression des gènes en réponse à une variété de stimuli. Nous détaillons les techniques qui permettent d’étudier les changements spécifiques aux gènes dans la méthylation de l’ADN et l’effet de ces changements sur l’expression des gènes.

Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l&#39;expression et l&#39;activité transcriptionnelle des astrocytes<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'état de méthylation de l'ADN du gène KCNJ10 dans une population enrichie d'astrocytes et de corréler les modifications de la méthylation de son promoteur avec l'activité transcriptionnelle. Pour ce faire, on isole d'abord une population enrichie d'astrocytes corticaux à partir du cerveau entier de rongeur par tri FACS, puis l'ADN est extrait de cette population enrichie d'astrocytes. Ensuite, l'état de méthylation de l'ADN du gène KCNJ10 est évalué par analyse de fusion haute résolution sensible à la méthylation, ou MS.HRMA.Enfin, le promoteur KCNJ10 est hyperméthylé et un dosage de luciférase est utilisé pour corréler les modifications de la méthylation de l'ADN du promoteur avec l'activité transcriptionnelle. En définitive, la MS.HRMA et le dosage de la luciférase sont utilisés pour mesurer l'état de méthylation de l'ADN de KCNJ10 et corréler les modifications de la méthylation du promoteur et l'activité transcriptionnelle du gène. La procédure sera démontrée. Un chercheur postdoctoral de mon laboratoire, tous les animaux ont été manipulés conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health, et l'utilisation des animaux a été approuvée par le comité de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'Alabama à Birmingham.Tous les tampons et réactifs ont été préparés conformément au protocole écrit. Après avoir disséqué les cortèges à partir de la tête d'un animal euthanasié, conformément au protocole écrit, découpez ou percez à l'aide d'une fraiseuse un orifice au sommet d'un tube conique de 50 millilitres afin de permettre le passage d'un tube. Ajoutez ensuite la solution de papaine dans le tube.Placer les cortèges disséqués dans une boîte de culture de 10 millimètres contenant du milieu de dissociation équilibré à 95 % O₂ et 5 % CO₂, puis hacher le tissu en morceaux d'un millimètre carré à l'aide d'une lame de rasoir propre. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, transférer le tissu dans le tube de 50 millilitres contenant la solution de pepase. Laisser le tissu se déposer au fond de la pipette de transfert avant de l’éjecter.Pour minimiser la quantité de milieu de dissociation transférée sans faire buller la solution de pepane, appliquez un débit constant de 95 % O₂ et 5 % CO₂ par échange gazeux en surface pendant l'incubation dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l'incubation, utilisez une pipette de transfert de 10 millilitres pour mélanger lentement le tissu 10 fois, puis centrifugez la suspension cellulaire trouble à 300 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Équilibrez la solution inhibitrice d'albumine de l'ADN par échange gazeux en surface et remettez en suspension les cellules en culot dans trois millilitres de cette solution.Préparez ensuite un gradient de densité discontinu commercial en suivant les instructions du fabricant. Faites centrifuger le gradient de densité discontinu à 70 G pendant six minutes. Ensuite, isolez les cellules dissociées au fond du tube en utilisant une pipette pour aspirer le milieu.Utilisez deux à trois millilitres de DPBS contenant 0,02 % d'albumine sérique bovine et un milligramme par millilitre d'ADN ou le milieu préféré. Pour réutiliser, mettez en suspension les cellules dissociées. Faites passer les cellules à travers un filtre de 40 microgrammes avant de procéder au tri cellulaire et à l'extraction d'ADN ou d'ARN selon le protocole indiqué.Après avoir conçu des amorces ciblant une séquence d'ADN converti par le bisulfite et amplifié l'ADN selon le protocole décrit, convertir par le bisulfite 500 à 1000 nanogrammes d'ADN de chaque échantillon ainsi que des standards d'ADN méthylé allant de 0 à 100 % provenant de la même espèce animale, en utilisant une ADN polymérase choisie et des amorces à cinq micromoles. Préparer des réactions de 20 microlitres pour l'amplification Ms HRM. Selon ce tableau, analyser tous les échantillons, y compris l'ADN témoin et les standards méthylés, en triple exemplaire ; en fonction du logiciel d'analyse, définir les paramètres de début et de fin pré- et postérieurs autour des transitions de la courbe de fusion.Configurez les paramètres de prémélange, de début de prémélange et d'arrêt de prémélange. La différence entre les deux doit être de 0,2 à 0,5 degré Celsius. Réglez de la même manière le post-mélange, le début et la fin, puis extrayez les données de différence de température de pic pour chaque échantillon à l'aide d'étalons de pourcentage de méthylation et de leurs différences de température de pic correspondantes.Générez une équation de régression linéaire. Utilisez cette équation de régression linéaire pour estimer le statut de méthylation d'échantillons inconnus après avoir identifié les îlots CPG d'intérêt et amplifié et cloné l'îlot CPG Luke deux selon le protocole indiqué. Utilisez le logiciel Preferred Cutter pour vérifier les sites de digestion par restriction afin d'éviter les coupures doubles et linéarisez 30 microgrammes de plasmide une fois que l'échantillon a été digéré avec les enzymes appropriées.Inactiver les enzymes par chauffage à la température et pendant la durée appropriées dans des réactions de 50 microlitres. Utiliser cinq unités de CPG méthylase pour la méthylation de 700 microgrammes de plasmides linéarisés à 30 degrés Celsius pendant 13 à 19 heures.Après purification de l'ADN conformément au protocole décrit dans le texte, réalisez une double digestion HPA sur des échantillons d'un microgramme d'ADN méthylé en incubant à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après purification de l'ADN, faites migrer les échantillons sur un gel d'agarose à 1 % à 100 volts pendant 45 minutes afin de visualiser les fragments. Ensuite, soumettez les plasmides méthylés et non méthylés à une double digestion avec les enzymes de restriction appropriées, en incubant toute la nuit, afin de libérer le vecteur Luke deux en entier ainsi que les fragments d'îlots CPG.Inactiver les enzymes par chauffage après la digestion. Faire migrer les échantillons doublement digérés sur un gel d'agarose à 1 % à 100 volts pendant une heure afin de séparer le vecteur de l'insert, puis, en portant une protection contre la lumière UV, placer le gel sous lumière noire et, à l’aide de lames de scalpel propres, exciser les inserts méthylés et non méthylés. Après extraction de l’ADN selon le protocole décrit, utiliser la ligase ADN T4 et un ratio de un à quatre entre le vecteur et l’insert pour réinsérer les fragments méthylés et non méthylés dans un vecteur non méthylé. Incuber à moins 20 degrés Celsius ou sur de la glace toute la nuit après la ligation.Nettoyez l'ADN et vérifiez la recircularisation en analysant les échantillons sur un gel d'agarose à 1 %, puis évaluez la concentration du plasmide recircularisé. Semez des cellules CD54 dans une plaque de 12 puits à raison de 140 000 cellules par puits. Vingt-quatre heures plus tard, utilisez un réactif de transfection commercial pour transfecter les cellules avec des concentrations équivalentes soit d'un plasmide CPG non méthylé contenant la boucle 2 associé à RAN vanilla, soit d'un vecteur de contrôle ferreux, soit d'un plasmide CPG méthylé contenant la boucle 2 associé à ELLA, ou d'un autre vecteur de contrôle luciférase. Incubez les cellules 24 heures après transfection avant de réaliser un dosage luciférase.Suivant les instructions du fabricant, utiliser un luminomètre pour lire chaque puits en triple. Calculer le rapport de l'activité de la luciférase de luciole par rapport à la luciférase de vanille ou à un autre contrôle. Activité de la luciférase.Normalisez l'activité de la luciférase de contrôle feu follet méthylée par rapport à l'activité de la luciférase de contrôle feu follet non méthylée en divisant l'activité méthylée par l'activité de la luciférase méthylée. Comme illustré ici, une population enrichie d'astrocytes a été obtenue par tri FACS d'animaux transgéniques E-G-F-P-S 100 bêta. Une population sélectionnée a été ciblée en fonction de la diffusion avant et latérale, et une population de cellules vivantes a été déterminée à l'aide d'un indicateur de cellules mortes au bromure ; les régions de sélection présentées ici sont des images représentatives d'astrocytes positifs pour EGFP après dissociation, mais avant tri ainsi qu'après tri. Cette figure montre une population cellulaire isolée positive pour EGFP qui a démontré une augmentation de 40 fois du taux d'ARNm pour le marqueur spécifique des astrocytes.Une LDH par L et un. En outre, malgré l'expression partagée de la protéine S100 bêta et des OPC NG2-positifs et des astrocytes, une réduction de quatre fois du taux d'ARNm NG2, un marqueur des cellules précurseurs d'oligodendrocytes, a été observée, indiquant l'isolement d'une population cellulaire astrocytaire enrichie. Ce tableau répertorie les quantités totales d'ARN et d'ADN isolées à partir d'animaux d'âges et de nombres variables, et est fourni à titre de référence pour le rendement attendu en molécules biomoléculaires après extraction.Enfin, un test luciférase double a été utilisé pour évaluer l'activité transcriptionnelle des régions hyperméthylées du gène d'intérêt après le transfert de l'insert méthylé dans un vecteur non méthylé. HPAII, qui digère uniquement l'ADN non méthylé, a été utilisé pour vérifier l'état de méthylation du plasmide. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler une population enrichie d'astrocytes en utilisant la triage par cytométrie en flux, ainsi que de la façon de mesurer la méthylation de l'ADN d'un gène et de corréler les modifications de la méthylation de l'ADN du promoteur avec l'activité transcriptionnelle, respectivement à l'aide d'une analyse de fusion haute résolution sensible à la méthylation et d'un test luciférase.

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