Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l'expression et l'activité transcriptionnelle des astrocytes

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'état de méthylation de l'ADN du gène KCNJ10 dans une population enrichie d'astrocytes et de corréler les modifications de la méthylation de son promoteur avec l'activité transcriptionnelle. Pour ce faire, on isole d'abord une population enrichie d'astrocytes corticaux à partir du cerveau entier de rongeur par tri FACS, puis l'ADN est extrait de cette population enrichie d'astrocytes. Ensuite, l'état de méthylation de l'ADN du gène KCNJ10 est évalué par analyse de fusion haute résolution sensible à la méthylation, ou MS.HRMA.

Enfin, le promoteur KCNJ10 est hyperméthylé et un dosage de luciférase est utilisé pour corréler les modifications de la méthylation de l'ADN du promoteur avec l'activité transcriptionnelle. En définitive, la MS.HRMA et le dosage de la luciférase sont utilisés pour mesurer l'état de méthylation de l'ADN de KCNJ10 et corréler les modifications de la méthylation du promoteur et l'activité transcriptionnelle du gène. La procédure sera démontrée. Un chercheur postdoctoral de mon laboratoire, tous les animaux ont été manipulés conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health, et l'utilisation des animaux a été approuvée par le comité de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'Alabama à Birmingham.

Tous les tampons et réactifs ont été préparés conformément au protocole écrit. Après avoir disséqué les cortèges à partir de la tête d'un animal euthanasié, conformément au protocole écrit, découpez ou percez à l'aide d'une fraiseuse un orifice au sommet d'un tube conique de 50 millilitres afin de permettre le passage d'un tube. Ajoutez ensuite la solution de papaine dans le tube.

Placer les cortèges disséqués dans une boîte de culture de 10 millimètres contenant du milieu de dissociation équilibré à 95 % O₂ et 5 % CO₂, puis hacher le tissu en morceaux d'un millimètre carré à l'aide d'une lame de rasoir propre. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, transférer le tissu dans le tube de 50 millilitres contenant la solution de pepase. Laisser le tissu se déposer au fond de la pipette de transfert avant de l’éjecter.

Pour minimiser la quantité de milieu de dissociation transférée sans faire buller la solution de pepane, appliquez un débit constant de 95 % O₂ et 5 % CO₂ par échange gazeux en surface pendant l'incubation dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l'incubation, utilisez une pipette de transfert de 10 millilitres pour mélanger lentement le tissu 10 fois, puis centrifugez la suspension cellulaire trouble à 300 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Équilibrez la solution inhibitrice d'albumine de l'ADN par échange gazeux en surface et remettez en suspension les cellules en culot dans trois millilitres de cette solution.

Préparez ensuite un gradient de densité discontinu commercial en suivant les instructions du fabricant. Faites centrifuger le gradient de densité discontinu à 70 G pendant six minutes. Ensuite, isolez les cellules dissociées au fond du tube en utilisant une pipette pour aspirer le milieu.

Utilisez deux à trois millilitres de DPBS contenant 0,02 % d'albumine sérique bovine et un milligramme par millilitre d'ADN ou le milieu préféré. Pour réutiliser, mettez en suspension les cellules dissociées. Faites passer les cellules à travers un filtre de 40 microgrammes avant de procéder au tri cellulaire et à l'extraction d'ADN ou d'ARN selon le protocole indiqué.

Après avoir conçu des amorces ciblant une séquence d'ADN converti par le bisulfite et amplifié l'ADN selon le protocole décrit, convertir par le bisulfite 500 à 1000 nanogrammes d'ADN de chaque échantillon ainsi que des standards d'ADN méthylé allant de 0 à 100 % provenant de la même espèce animale, en utilisant une ADN polymérase choisie et des amorces à cinq micromoles. Préparer des réactions de 20 microlitres pour l'amplification Ms HRM. Selon ce tableau, analyser tous les échantillons, y compris l'ADN témoin et les standards méthylés, en triple exemplaire ; en fonction du logiciel d'analyse, définir les paramètres de début et de fin pré- et postérieurs autour des transitions de la courbe de fusion.

Configurez les paramètres de prémélange, de début de prémélange et d'arrêt de prémélange. La différence entre les deux doit être de 0,2 à 0,5 degré Celsius. Réglez de la même manière le post-mélange, le début et la fin, puis extrayez les données de différence de température de pic pour chaque échantillon à l'aide d'étalons de pourcentage de méthylation et de leurs différences de température de pic correspondantes.

Générez une équation de régression linéaire. Utilisez cette équation de régression linéaire pour estimer le statut de méthylation d'échantillons inconnus après avoir identifié les îlots CPG d'intérêt et amplifié et cloné l'îlot CPG Luke deux selon le protocole indiqué. Utilisez le logiciel Preferred Cutter pour vérifier les sites de digestion par restriction afin d'éviter les coupures doubles et linéarisez 30 microgrammes de plasmide une fois que l'échantillon a été digéré avec les enzymes appropriées.

Inactiver les enzymes par chauffage à la température et pendant la durée appropriées dans des réactions de 50 microlitres. Utiliser cinq unités de CPG méthylase pour la méthylation de 700 microgrammes de plasmides linéarisés à 30 degrés Celsius pendant 13 à 19 heures.

Après purification de l'ADN conformément au protocole décrit dans le texte, réalisez une double digestion HPA sur des échantillons d'un microgramme d'ADN méthylé en incubant à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après purification de l'ADN, faites migrer les échantillons sur un gel d'agarose à 1 % à 100 volts pendant 45 minutes afin de visualiser les fragments. Ensuite, soumettez les plasmides méthylés et non méthylés à une double digestion avec les enzymes de restriction appropriées, en incubant toute la nuit, afin de libérer le vecteur Luke deux en entier ainsi que les fragments d'îlots CPG.

Inactiver les enzymes par chauffage après la digestion. Faire migrer les échantillons doublement digérés sur un gel d'agarose à 1 % à 100 volts pendant une heure afin de séparer le vecteur de l'insert, puis, en portant une protection contre la lumière UV, placer le gel sous lumière noire et, à l’aide de lames de scalpel propres, exciser les inserts méthylés et non méthylés. Après extraction de l’ADN selon le protocole décrit, utiliser la ligase ADN T4 et un ratio de un à quatre entre le vecteur et l’insert pour réinsérer les fragments méthylés et non méthylés dans un vecteur non méthylé. Incuber à moins 20 degrés Celsius ou sur de la glace toute la nuit après la ligation.

Nettoyez l'ADN et vérifiez la recircularisation en analysant les échantillons sur un gel d'agarose à 1 %, puis évaluez la concentration du plasmide recircularisé. Semez des cellules CD54 dans une plaque de 12 puits à raison de 140 000 cellules par puits. Vingt-quatre heures plus tard, utilisez un réactif de transfection commercial pour transfecter les cellules avec des concentrations équivalentes soit d'un plasmide CPG non méthylé contenant la boucle 2 associé à RAN vanilla, soit d'un vecteur de contrôle ferreux, soit d'un plasmide CPG méthylé contenant la boucle 2 associé à ELLA, ou d'un autre vecteur de contrôle luciférase. Incubez les cellules 24 heures après transfection avant de réaliser un dosage luciférase.

Suivant les instructions du fabricant, utiliser un luminomètre pour lire chaque puits en triple. Calculer le rapport de l'activité de la luciférase de luciole par rapport à la luciférase de vanille ou à un autre contrôle. Activité de la luciférase.

Normalisez l'activité de la luciférase de contrôle feu follet méthylée par rapport à l'activité de la luciférase de contrôle feu follet non méthylée en divisant l'activité méthylée par l'activité de la luciférase méthylée. Comme illustré ici, une population enrichie d'astrocytes a été obtenue par tri FACS d'animaux transgéniques E-G-F-P-S 100 bêta. Une population sélectionnée a été ciblée en fonction de la diffusion avant et latérale, et une population de cellules vivantes a été déterminée à l'aide d'un indicateur de cellules mortes au bromure ; les régions de sélection présentées ici sont des images représentatives d'astrocytes positifs pour EGFP après dissociation, mais avant tri ainsi qu'après tri. Cette figure montre une population cellulaire isolée positive pour EGFP qui a démontré une augmentation de 40 fois du taux d'ARNm pour le marqueur spécifique des astrocytes.

Une LDH par L et un. En outre, malgré l'expression partagée de la protéine S100 bêta et des OPC NG2-positifs et des astrocytes, une réduction de quatre fois du taux d'ARNm NG2, un marqueur des cellules précurseurs d'oligodendrocytes, a été observée, indiquant l'isolement d'une population cellulaire astrocytaire enrichie. Ce tableau répertorie les quantités totales d'ARN et d'ADN isolées à partir d'animaux d'âges et de nombres variables, et est fourni à titre de référence pour le rendement attendu en molécules biomoléculaires après extraction.

Enfin, un test luciférase double a été utilisé pour évaluer l'activité transcriptionnelle des régions hyperméthylées du gène d'intérêt après le transfert de l'insert méthylé dans un vecteur non méthylé. HPAII, qui digère uniquement l'ADN non méthylé, a été utilisé pour vérifier l'état de méthylation du plasmide. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler une population enrichie d'astrocytes en utilisant la triage par cytométrie en flux, ainsi que de la façon de mesurer la méthylation de l'ADN d'un gène et de corréler les modifications de la méthylation de l'ADN du promoteur avec l'activité transcriptionnelle, respectivement à l'aide d'une analyse de fusion haute résolution sensible à la méthylation et d'un test luciférase.