Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l'expression et l'activité transcriptionnelle des astrocytes KCNJ10 (Kir4.1)

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer l’état de méthylation de l’ADN de KCNJ 10 dans une population enrichie d’astrocytes et de corréler les changements de méthylation de l’ADN du promoteur avec l’activité transcriptionnelle facultative. Ceci est accompli en isolant d’abord une population enrichie d’astrocytes corticaux du cerveau entier de rongeurs via le tri des faits, puis l’ADN est isolé de la population enrichie d’astrocytes. Ensuite, l’état de méthylation de l’ADN de KC J 10 est évalué à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution sensible à la méthylation ou MS. HRMA.

Enfin, le promoteur KC J 10 est hyperméthylé et le test de luciféra est utilisé pour corréler les changements dans la méthylation de l’ADN du promoteur avec l’activité transcriptionnelle. En fin de compte, MS. L’HRMA et le test de la luciférase sont utilisés pour mesurer l’état de méthylation de l’ADN de KCNJ 10 et corréler les changements dans la méthylation du promoteur et l’activité transcriptionnelle du gène. Tous les animaux ont été manipulés conformément aux directives des National Institutes of Health, le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Alabama à Birmingham a approuvé l’utilisation des animaux.

Tous les tampons et réactifs ont été préparés selon le protocole texte. Après avoir disséqué les cortex de la tête d’un animal euthanasié, selon le protocole de texte, découpez ou dremel un trou dans le haut d’un tube conique de 50 millilitres pour permettre l’introduction du tube dans le tube. Ajoutez ensuite la solution de papin dans le tube.

Placez les cortex disséqués dans une boîte de culture de 10 millimètres contenant un milieu de dissociation équilibré à 95 % O2 à 5 % de CO2, et utilisez une lame de rasoir propre pour hacher le tissu en morceaux de millimètres carrés un par un. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, les hommes transfèrent le tissu dans le tube de 50 millilitres contenant la solution de pepane. Laissez le tissu se déposer au fond de la pipette de transfert avant de la décharger.

Pour minimiser la quantité de milieu de dissociation transportée sans faire bouillonner la solution de pepane, appliquez un débit constant de 95 % d’O2 à 5 % de CO2 par échange gazeux de surface pendant l’incubation dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, à l’aide d’une pipette de transfert de 10 millilitres, tamiser lentement le tissu 10 fois, centrifuger la suspension de cellules troubles à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante. Équilibrez la solution inhibitrice d’albumine de l’ADN par échange gazeux de surface et remettez en suspension les cellules granulées dans trois millilitres de solution.

Préparez ensuite un gradient de densité discontinu commercial en suivant les instructions du fabricant. Faites tourner le gradient de densité discontinu à 70 G pendant six minutes. Ensuite, isolez les cellules dissociées du fond du tube à l’aide d’une pipette pour aspirer le support.

Utilisez deux à trois millilitres de DPBS avec 0,02 % d’albumine sérique bovine et un milligramme par millilitre d’ADN ou de milieu préféré. Pour réuser, suspendez les cellules dissociées. Passez les cellules à travers un filtre de 40 microgrammes avant d’effectuer le tri des faits et l’extraction de l’ADN ou de l’ARN selon le protocole textuel.

Après avoir conçu des amorces contre une séquence d’ADN convertie au bisulfite et amplifié l’ADN selon le protocole textuel par sulfite, convertir 500 à 1000 nanogrammes d’ADN de chaque échantillon et des étalons d’ADN méthylés allant de zéro à 100 % de la même espèce animale en utilisant une ADN polymérase préférée et cinq amorces micromolaires. Configurez des réactions de 20 microlitres pour l’amplification de la MRH. Selon ce tableau, analysez tous les échantillons, y compris le fax, l’ADN et les étalons méthylés en trois exemplaires en fonction de l’ensemble du logiciel d’analyse, des paramètres de pré et post-démarrage et d’arrêt autour des transitions de la courbe de fusion.

Définissez les paramètres prem melt, start et prem melt stop. La différence entre les deux est donc de 0,2 à 0,5 degré Celsius. Réglez de la même manière le post-fusion, le démarrage et l’arrêt et extrayez les données de différence de température maximale pour chaque échantillon à l’aide d’étalons méthylés en pourcentage et de leurs différences de température maximales correspondantes.

Générez une équation de régression linéaire. Utilisez cette équation de régression linéaire pour estimer l’état de méthylation d’échantillons inconnus après avoir identifié les îlots CPG d’intérêt et amplifié et cloné le plasmide Luke island CPG deux selon le protocole textuel. Utilisez le logiciel de coupe de votre choix pour vérifier les sites de digestion de restriction afin d’éviter les doubles coupures et linéarisez 30 microgrammes de plasmide une fois que l’échantillon a été digéré avec les enzymes appropriées.

La chaleur inactive les enzymes à la température et à la durée appropriées dans des réactions de 50 microlitres. Utilisez cinq unités de méthylate de CPG pour méthyler. 700 microgrammes de plasmides linéarisés à 30 degrés Celsius pendant 13 à 19 heures.

Après avoir nettoyé l’ADN comme indiqué dans le protocole textuel, effectuez une digestion à deux restrictions HPA sur des échantillons d’un microgramme d’ADN méthylé en incubant à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après avoir nettoyé l’ADN, analysez les échantillons sur un gel d’ADN à 1 % agros à 100 volts pendant 45 minutes pour la visualisation. Sujet suivant, des plasmides méthylés et non méthylés à double digestion avec des enzymes de restriction appropriées pendant la nuit pour libérer les deux vecteurs de Luke sur toute leur longueur et les fragments d’îlot CPG.

La chaleur inactive les enzymes après la digestion. Analysez les échantillons double digérés sur un gel agros à 1 % d’ADN à 100 volts pendant une heure pour séparer le vecteur et l’insérez, puis tout en portant une protection contre la lumière UV, placez le gel sur une lumière noire et avec des lames chirurgicales propres, excisez les inserts méthylés et non méthylés après l’extraction de l’ADN par gel conformément au protocole de texte, utiliser T quatre ADN ligase et un rapport de un à quatre de vecteur à insérer pour reléguer les inserts méthylés et non méthylés dans un vecteur non méthylé. Incuber à moins 20 degrés Celsius ou sur glace pendant la nuit après la ligature.

Nettoyez l’ADN et vérifiez la reliure en analysant des échantillons sur un gel d’ADN à 1 % et évaluez la concentration du plasmide CD 54 sur une plaque à 12 puits à 140 000 cellules par puits. 24 heures plus tard. Utilisez un réactif de transfection commercial pour transfecter des cellules avec des concentrations égales de la boucle CPG non méthylée deux plasmide plus RAN vanille ou autre vecteur féreux de contrôle ou c pg Luke méthylé plasmide plus ELLA ou autre vecteur de lucifers de contrôle Laissez les cellules transfecter pendant 24 heures avant d’effectuer un test de lucifer.

Selon les instructions du fabricant, utilisez un luminomètre pour lire chaque puits en trois exemplaires. Calculez le rapport entre l’activité des lucifers de luciole et celle de la vanille exécutée ou d’un autre contrôle. L’activité de Lucifer.

Normaliser l’activité luciférase de contrôle des luciférases méthylées en activité luciférase de contrôle des lucioles non méthylées en divisant l’activité méthylée par l’activité luc méthylée. Comme démontré ici, une population enrichie d’astrocytes a été acquise par tri par fax d’animaux transgéniques bêta E-G-F-P-S 100. Une population fermée a été ciblée sur la base de la diffusion vers l’avant et sur les côtés, et une population de cellules vivantes a été déterminée à l’aide d’un indicateur de cellules mortes au bromure et le déclenchement montrent ici des images représentatives d’astrocytes positifs à l’EGFP après dissociation, mais avant et après le tri, cette figure montre une population de cellules positives à l’EGFP isolée qui a démontré une augmentation de 40 fois de l’ARNm pour le marqueur spécifique de l’astrocyte.

Une LDH une L une. De plus, malgré l’expression partagée de S 100 bêta et de COP et d’astrocytes positifs pour NG deux, une réduction de quatre fois de l’ARNm NG deux, un marqueur pour les cellules précurseurs d’oligodendrocytes, a été observée, indiquant l’isolement d’une population de cellules astrocytaires enrichies. Ce tableau répertorie l’ARN et l’ADN totaux, isolés à partir de différents âges et nombres d’animaux, et est répertorié comme référence pour le rendement attendu des molécules moléculaires selon les faits.

Enfin, un double test de lucifers a été utilisé pour évaluer l’activité transcriptionnelle des régions hyperméthylées du gène d’intérêt après avoir déplacé l’insert méthylé dans un vecteur non méthylé. HPA deux, qui digère uniquement l’ADN non méthylé, a été utilisé pour vérifier l’état de méthylation du plasmide. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une population enrichie d’astrocytes à l’aide de faits ainsi que de la façon de mesurer la méthylation de l’ADN d’un gène et de corréler les changements dans la méthylation de l’ADN du promoteur avec l’activité transcriptionnelle en utilisant respectivement l’analyse de fusion haute résolution sensible à la méthylation et le dosage de la luciférase.