Name: Analyse de la méthylation de lADN Optimisé et dexpression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Découvrez une méthode optimisée pour analyser la méthylation de l'ADN et l'expression génique dans des zones cérébrales spécifiques chez la souris. Ce protocole permet d'étudier les effets du stress précoce sur la programmation épigénétique.

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Ce travail a été financé par l&#39;Institut Max Planck de psychiatrie et de l&#39;Union européenne Marie Curie Réseau de formation initiale (contrat NINA 238 665).

<ol><li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li>
<li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis%3A+Early+life+decides%5BTitle%5D)+AND+%22Stress+%28Amsterdam%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li>
<li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li>
<li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li>
<li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockmühl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+learn+from+stress%3A+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%2C+Compact%3A+The+Coronal+Plates+and+Diagrams%3A+Compact.+The+Coronal+Plates+and+Diagrams%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams</a>. , Elsevier Science Publishing Co Inc. (2008).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+research+notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Programmation épigénétique est de plus en plus reconnue comme un mécanisme important qui sous-tend la santé et la maladie. Nous présentons ici une méthode plus perfectionnée pour l&#39;isolement simultané de l&#39;ADN et d&#39;ARN à partir micropunches et les étapes ultérieures d&#39;obtenir des profils de méthylation d&#39;ADN par séquençage au bisulfite. Le flux de travail optimisé permet une analyse pratique de la programmation épigénétique dans le cerveau en réponse à des stimuli environnementaux. En outre, cette approche facilite l&#39;enquête de la relation fonctionnelle entre la méthylation de l&#39;ADN et l&#39;expression des gènes à la fois comme sont analysés à partir du même échantillon. Enfin, le nombre d&#39;animaux nécessaires pour l&#39;expérience peut être considérablement réduit. Certaines précautions et les directives doivent être suivies lors de l&#39;exécution du flux de travail présenté. Considérant l&#39;extraordinaire complexité et l&#39;hétérogénéité du cerveau et, depuis motif de méthylation et d&#39;expression peut varier d&#39;une manière cellules et des tissus spécifiques, il est de la plus hauteimportance que micropunching est effectuée de manière standardisée. Comme un cas au point, la programmation épigénétique de AVP est détecté dans le paravaventriuclar, mais pas dans le noyau supraoptique (figure 4b-d), deux Avp exprimer régions de l&#39;hypothalamus 4. À cet égard, la disponibilité de l&#39;ADN et l&#39;ARN du poinçon même tissu est avantageux que l&#39;expression d&#39;ARN de gènes marqueurs tissulaires certaines spécifiques peuvent être utilisés dans certains cas, pour certifier que la zone voulue a été frappé. Bien que micropunching peut réduire l&#39;hétérogénéité cellulaire, il ne faut pas oublier que cette approche ne conduise pas à l&#39;isolement de types de cellules simples ou des populations. Étapes de purification supplémentaires pourraient être envisagées pour traiter ce sujet. Pour le bisulfite de séquençage de conception d&#39;amorce optimale pour l&#39;amplification par PCR de bisulfite de traitement suivant est essentiel. Les produits de PCR de plus de 400 pb de longueur peut être problématique en raison de la dégradation de l&#39;ADN par le btraitement isulfite. Il convient également de noter que la PCR nichée peut donner des résultats biaisés si seulement quelques modèles intacts contribuer au processus d&#39;amplification. Paires d&#39;amorces qui sont spécifiques pour l&#39;amplicon modification doit être conçue; leurs séquences ne doivent pas contenir des dinucléotides CpG, afin d&#39;éviter la méthylation polarisée d&#39;amplification. En outre, des amorces doit contenir non-CpG cytosines pour éviter l&#39;amplification de l&#39;ADN non modifié ou incomplètement convertie. L&#39;amplification de certains modèles peuvent bénéficier de la conduite de démarrage à chaud PCR. Dans tous les cas, la pertinence de paires d&#39;amorces doivent être vérifiées dans des expériences pilotes de manière à empêcher la détérioration de la valeur des spécimens expérimentaux. Séquençage bisulfite représente une méthode standard pour l&#39;analyse de méthylation spécifique de site tel qu&#39;il est capable de détecter de manière fiable et précise de la méthylation de CpG uniques résidus de manière spécifique de l&#39;allèle 8. Le séquençage direct du produit de PCR n&#39;est pas conseillé que la méthylation mixte oFA CpG résidus apparaît comme un pic C / double T dans le électrophérogramme, ce qui peut empêcher la quantification de la méthylation du site concerné. Pour cette raison, une étape de clonage intermédiaire est effectuée et plusieurs clones sont séquencés (~ 20-30) pour déterminer l&#39;étendue de la méthylation. Pyroséquençage représente une méthode alternative pour quantifier méthylation de l&#39;ADN. Il utilise également la conversion au bisulfite et le bisulfite de PCR mais au lieu de clonage et le séquençage de l&#39;amplicon est soumis à une réaction directe pyroséquençage où le statut de méthylation d&#39;un résidu CpG est lu comme un C / T polymorphisme de nucléotide unique qui peut être facilement quantifiés. Les deux méthodes de détecter des niveaux similaires de méthylation 9, mais depuis le clonage étape peut être omise pyroséquençage prend plus de temps efficace. Toutefois, selon le modèle de seulement 40 à 100 nucléotides peuvent être séquencés à la fois de sorte que plusieurs séries de pyroséquençage avec amorce de séquençage différentes sont nécessaires. Il s&#39;agit d&#39;une limitation critique, étant donné thamontants plus élevés de l&#39;ADN t (environ 1 pg par réaction) sont nécessaires, ce qui prévisible dépasse les montants disponibles à partir de minuscules coups de tissus cérébraux. Ainsi la première analyse des régions dans la gamme de plusieurs kilobases par pyroséquençage semble moins adapté que la lecture seul clone. Néanmoins, à la suite de l&#39;identification d&#39;une petite région de pyroséquençage intérêt doit être pris en considération. Collectivement, le protocole décrit ci-dessus fournit une approche précise, efficace et rationalisé pour l&#39;analyse rapide et rentable de micropunches cerveau de modifications épigénétiques. Spécimens multiples peuvent être traitées en un seul passage et les méthodes sont adaptées lors de l&#39;exécution des échantillons provenant de taille intermédiaire expériences.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sang DNeasy &amp; Kit de tissus </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin II de l&#39;ARN </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740955,50 </td></tr><tr><td> EpiTect Kit bisulfite </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin Extrait </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector kit de clonage </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 séquençage Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar polymérase Taq </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq Polymérase </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

analyse de la méthylation de l&#39;adn optimisé et d&#39;expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

L&#39;exposition à l&#39;alimentation, les médicaments et l&#39;adversité au cours de la vie au début fenêtres sensibles de la vie 1,2 peut conduire à des changements durables dans l&#39;expression des gènes qui contribuent à l&#39;affichage des phénotypes physiologiques et comportementaux. Cette programmation de l&#39;environnement est susceptible d&#39;augmenter la susceptibilité à métaboliques, les maladies cardio-vasculaires et mentales 3,4. Méthylation de l&#39;ADN et des modifications des histones sont considérés comme des processus clés dans la médiation du dialogue gènes-environnement et semblent aussi sous-tendaient la programmation de l&#39;environnement 5. Chez les mammifères, méthylation de l&#39;ADN comprend typiquement l&#39;addition covalente par un groupe méthyle à la position 5 de la cytosine dans le contexte de dinucléotides CpG. Méthylation de CpG se produit de façon hautement tissu-spécifique de cellule et qui en fait un défi à étudier, des petites régions discrètes du cerveau, où l&#39;hétérogénéité cellulaire est haute et la quantité de tissu limitée. En outre, barce que l&#39;expression des gènes et de méthylation sont étroitement liés les événements, une valeur accrue peut être obtenue en comparant les deux paramètres dans le même échantillon. Ici, un protocole étape par étape (Figure 1) pour l&#39;enquête de la programmation épigénétique dans le cerveau est présenté en utilisant le paradigme du «séparation maternelle» de l&#39;adversité début de la vie à des fins d&#39;illustration. Le protocole décrit la préparation de micropunches de cerveaux de souris différentiellement d&#39;âge à partir duquel l&#39;ADN et l&#39;ARN peuvent être simultanément isolés, permettant ainsi méthylation de l&#39;ADN et les analyses d&#39;expression génique dans le même échantillon.

Un flux de travail simplifié pour étudier méthylation de l&#39;ADN et des modifications d&#39;expression des gènes lors de début de la vie de stress est montré. A partir de la séparation maternelle des souriceaux nouveau-nés et l&#39;isolement des tissus cérébraux distincts, nous représentons un protocole à la fois isoler l&#39;ADN et l&#39;ARN à partir de poinçons de tissus cérébraux pour le séquençage du bisulfite de suite et analyse RT-PCR.

Analyse de la méthylation de l&#39;ADN Optimisé et d&#39;expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

L'exposition au régime alimentaire, aux médicaments et à l'adversité précoce durant des périodes sensibles de la vie 1,2 peut entraîner des modifications durables de l'expression génique qui contribuent à ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la méthylation de l'ADN et les modifications de l'expression génique induites par le stress précoce de la vie. Cette étude est réalisée en soumettant d'abord des souriceaux nouveau-nés à une séparation maternelle afin d'induire un stress précoce de la vie, puis, dans une deuxième étape, en prélevant les régions cérébrales d'intérêt, ici l'APV, par microdissection in loco, et en isolant simultanément l'ADN et l'ARN à partir d'un seul punch de tissu.Ensuite, l'ADN obtenu est traité au sulfite, et la région d'intérêt est amplifiée par PCR au bisulfite. Ce produit est ensuite ligaturé dans un vecteur et transformé dans des bactéries. Les transformations réussies sont identifiées par l'expression du marqueur et la taille du fragment de PCR.Enfin, le séquençage au bisulfite est utilisé pour évaluer l'état de méthylation. Le principal avantage de ce protocole est qu'il permet une analyse pratique de la programmation épigénétique en réponse à des stimuli environnementaux. Cette méthode peut fournir des informations sur la programmation épigénétique induite par des adversités précoces.Il peut également être appliqué à d'autres systèmes. Partout où la méthylation et l'expression génique sont analysées dans un environnement fortement spécifique aux tissus, et partout où la disponibilité des tissus est limitée pour induire un stress précoce de la vie. La séparation maternelle est effectuée sur des souriceaux issus de mères C57BL/6N gestantes à gestation contrôlée afin de provoquer une séparation maternelle.Transférer chaque portée dans une cage propre chauffée pendant trois heures par jour, du premier au dixième jour après la naissance ; laisser les souriceaux témoins non stressés en paix. À l'exception de la séparation de trois heures, toutes les portées restent avec leur mère jusqu'au sevrage, le 21e jour après la naissance. Ensuite, les souriceaux sont logés par groupes de même sexe, trois à cinq souris par cage, dans des conditions d'élevage standard. Pour commencer la collecte de tissu cérébral, les cerveaux de souris sont extraits des crânes et immédiatement congelés dans de la glace sèche isopentane, puis stockés à moins 80 degrés Celsius.Lorsque vous êtes prêt à prélever les échantillons tissulaires, retirez les cerveaux du congélateur à moins 80 degrés et placez-les sur de la glace sèche. Commencez par découper les cerveaux en sections coronales de 10 micromètres à l'aide d'un cryostat, de l'avant vers l'arrière. Montez les sections sur des lames en verre super frosts et faites-les sécher pour la coloration au violet de crête.Des lames supplémentaires peuvent être prélevées et conservées à moins 20 degrés pour des analyses ultérieures, telles qu'une hybridation in situ. Lorsque vous êtes prêt à effectuer les prélèvements, coloriez les lames au violet de crête afin d'identifier les structures cérébrales d'intérêt. Ensuite, à l'aide d'une aiguille de prélèvement, effectuez des prélèvements de 0,8 millimètre des régions d'intérêt par microdissection in loco.Les prélèvements doivent être conservés à moins 80 degrés Celsius. Il est d'une importance critique que le micro-ponçonnage soit effectué de manière standardisée, car l'expression génique et la méthylation sont fortement spécifiques aux tissus. Homogénéisez les prélèvements dans 400 microlitres de tampon au thiocyanate de guanidinium à l'aide d'une pipette, puis vortexez à température ambiante.Ensuite, passez le lysat obtenu à travers une seringue de calibre 29. Plusieurs passages doivent rendre le punch invisible. Répartissez le lysat en parts égales.Un pour traiter l'ARN, qui doit être effectué en premier, et un autre pour traiter l'ADN, qui peut être conservé à température ambiante jusqu'à ce que l'ARN soit traité pour la purification de l'ARN à un volume de dixième d'acétate de sodium, un volume de phénol aqua et un demi-volume de 24 à 1 de chloroforme sur isoamyl AML, en vortexant vigoureusement après chaque ajout. Incuber ensuite le mélange final sur de la glace pendant 10 minutes, puis centrifuger le mélange.Prélevez la phase aqueuse et ajoutez un volume égal d'éthanol à 70 %. À l'aide d'un kit de colonne de centrifugation pour ARN, effectuez une digestion de l'ADN sur colonne, puis lavez et éluéisez l'ARN dans 25 microlitres d'eau.À présent, purifiez l'ADN en utilisant un protocole de kit modifié pour inclure une étape de digestion par une RNase, et réchauffez le tampon d'élution et la colonne d'élution à 70 degrés Celsius avant utilisation. Une durée de 10 minutes à 70 degrés Celsius est suffisante pour les colonnes. Enfin, utilisez un spectrophotomètre pour déterminer les concentrations d'ADN et d'ARN.Un prélèvement typique du noyau paraventriculaire fournit environ 600 nanogrammes d'ADN et environ 400 nanogrammes de RA mis de côté, dont environ 100 nanogrammes d'ARN destinés à l'analyse d'expression génique par PCR quantitative avant amplification par sulfite. Traitez 200 nanogrammes de l'ADN isolé à l'aide d'un kit disponible commercialement afin d'amplifier l'ADN provenant des régions méthylées. Commandez des amorces spécifiquement conçues pour l'ADN converti au bisulfite. Une conception optimale des amorces en PCR bisulfite est essentielle, car la qualité et la spécificité de l'amplicon PCR déterminent la réussite des étapes suivantes.Lorsque les amorces arrivent, déterminez leur température optimale et de recuit à l'aide d'expériences pilotes. Utilisez deux microlitres d'ADN traité au bisulfite comme matrice pour chaque mélange de PCR de 25 microlitres.Amplifiez le mélange en commençant par une dénaturation de six minutes à 95 degrés Celsius, suivie de 45 à 50 cycles d'amplification, puis une élongation finale de cinq minutes à 72 degrés Celsius. Analysez sept microlitres du produit de PCR par électrophorèse sur gel Agros afin de vérifier la taille de l'amplicon. Purifiez le produit de PCR restant pour la ligature ultérieure à l'aide d'un kit de purification de PCR disponible dans le commerce.Si des produits PCR indésirables sont obtenus, utilisez une purification sur gel pour isoler le produit d'intérêt pour ce protocole. Un kit de clonage commercial est utilisé. L'efficacité du clonage dépend de manière critique du fragment inséré.Ainsi, si un faible nombre de clones recombinants est régulièrement obtenu, essayez un vecteur de clonage différent. Préparez une réaction de ligation de 10 microlitres avec un microlitre de vecteur et trois microlitres de produit PCR purifié. Mélangez la réaction à l’aide d’une pipette et incubez-la toute la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.Nettoyer la réaction de ligation par précipitation classique à l'éthanol et transformer les bactéries avec le produit. Ajouter un millilitre de milieu SOB préchauffé directement après l'application de l'impulsion et transférer les bactéries transformées dans un tube réaction. Après une heure de récupération à 37 degrés Celsius, étaler 100 microlitres de chaque suspension sur une boîte de gélose LB contenant de l'ampicilline et enrobée d'IPTG.Incuber les plaques toute la nuit une fois que les colonies peuvent être prélevées. Préparer des réactions de PCR sur colonie de 25 microlitres dans une plaque de 96 puits en utilisant trois microlitres de chlorure de magnésium 2,5 millimolaire par réaction. Prélever les clones blancs positifs à l’aide d’une pointe de pipette et les transférer dans le mélange de PCR par une simple immersion.Commencez la PCR par un cycle de fusion de quatre minutes. Suivez par 10 cycles d'amplification avec une température d'appariement de 56 degrés Celsius. Chaque étape de ces cycles dure 30 secondes.Ensuite, abaisser la température d'hybridation à 48 degrés Celsius pendant 30 cycles supplémentaires d'amplification. Terminer par un cycle d'élongation de cinq minutes. Charger maintenant cinq microlitres de chaque produit sur un gel d'agarose et identifier les réactions contenant l'insert de taille appropriée.Utilisez un kit disponible dans le commerce pour purifier les produits PCR d'intérêt afin qu'ils puissent être séquencés par séquençage cyclique avec terminateur Big Dye. Dans une plaque de 96 puits, chargez les puits avec trois microlitres de mélange maître de réaction Big Dye, suivis de deux microlitres de produit PCR de colonies purifié. Exécutez la réaction sur un thermocycleur en commençant par une minute à 96 degrés Celsius, suivie de 35 cycles de 10 secondes à 96 degrés Celsius, cinq secondes à 50 degrés Celsius et quatre minutes à 60 degrés Celsius.Une fois la réaction de bisulfite terminée, purifiez la réaction à l’aide d’une plaque de purification pour réaction de bisulfite. Après avoir obtenu les séquences, analysez-les à l’aide du logiciel en ligne d’analyse de bisulfite ou de l’outil B-I-S-M-A afin de déterminer le profil de méthylation de la région d’ADN étudiée et d’obtenir des informations sur l’influence du stress précoce de la vie ou ELS sur l’expression et l’état de méthylation de la VP. Des souris C57BL/6 ont été traitées selon le protocole décrit ; le noyau paraventriculaire et le noyau supraoptique ont été prélevés pour isoler l’ADN, l’A-D-N-A-R a été traité au bisulfite, amplifié à l’aide d’amorces spécifiques à l’élément enhanceur de la VP, puis les produits de PCR ont été clonés et séquencés, au moins 20 clones recombinants provenant de chaque souris.Les PCR ont été analysées afin de déterminer les fréquences de méthylation des îlots CpG contenus dans l'amplicon PCR à partir de tissus provenant du P-V-N-E-L-S, qui a induit une hypométhylation significative à quatre emplacements sur l'enhancer de l'AVP, suggérant un marquage épigénétique de cette région régulatrice par des expériences précoces de la vie. Contrairement au PVN, la méthylation de l'enhancer de l'AVP n'a pas été affectée par les ELS dans le SON, illustrant la spécificité tissulaire de l'effet épigénétique. Chez les animaux témoins, le statut de méthylation de l'ADN au niveau du CpG 10 était négativement corrélé à l'expression du gène VP, indiquant un rôle de la méthylation de l'ADN dans l'ajustement fin de l'expression du gène VP. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la UPCR peuvent être facilement réalisées sur l'ARN isolé afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les modifications de l'expression génique dans le tissu analysé.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier les modifications de la méthylation de l'ADN en réponse à des stimuli dépendants de l'environnement ou de l'expérience.

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