Analyse de la méthylation de l'ADN Optimisé et d'expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

L’objectif global de cette procédure est d’étudier l’ADN. La méthylation et l’expression des gènes changent en cas de stress au début de la vie. Ceci est accompli en soumettant d’abord les bébés souris nouveau-nés à la séparation maternelle pour induire un stress au début de la vie comme deuxième étape des zones cérébrales d’intérêt ici, les PVN sont obtenus par micro dissection in loco et l’ADN et l’ARN sont isolés simultanément à partir d’un seul poinçon tissulaire.

Ensuite, l’ADN obtenu est traité au sulfite, et la région d’intérêt est amplifiée par PCR au bi-sulfite. Celui-ci est ensuite ligaturé en vecteur et transformé en bactérie. Les transformations réussies sont identifiées par l’expression du marqueur et la taille du fragment de PCR.

Enfin, le séquençage du bisulfure est utilisé pour évaluer l’état de méthylation. Le principal avantage de ce flux de travail est qu’il permet une analyse pratique de la programmation épigénétique en réponse à des stimuli environnementaux. Cette méthode peut donner un aperçu de la programmation épigénétique par adversité au début de la vie.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes. Partout où la méthylation et l’expression des gènes sont analysées dans un environnement hautement spécifique aux tissus et partout où la disponibilité des tissus est limitée pour induire un stress au début de la vie. La séparation maternelle est effectuée sur les petits des mères gestantes C 57 noires six N pour affecter la séparation maternelle.

Transférez chaque portée dans une cage propre et chauffée pendant trois heures par jour, de la première à la fin de la période postnatale, et laissez les petits témoins non stressés et non dérangés. À l’exception de la séparation de trois heures, toutes les portées sont laissées avec leur mère jusqu’au sevrage le 21e jour postnatal. Ensuite, les chiots sont logés dans des groupes de sexe apparié, trois à cinq souris par cage dans des conditions de logement standard pour initier la collecte de tissu cérébral, les cerveaux de souris sont retirés des crânes et immédiatement congelés dans de la glace carbonique isop et stockés à moins 80 degrés Celsius.

Lorsque vous êtes prêt à collecter les poinçons de tissu, retirez les cerveaux du congélateur à moins 80 degrés et mettez-les sur de la glace sèche. Commencez par cryosectionner les cerveaux en sections coronales de 10 microns du rostral au dorlot. Montez les sections sur des lames de verre super frosts et séchez-les pour les taches violettes de crête.

Des lames supplémentaires peuvent être prises et stockées à moins 20 degrés pour des analyses plus approfondies, telles que l’hybridation in situ deux. Lorsque vous êtes prêt à prendre des coups de poing, colorez les lames avec du violet crestal pour identifier les structures cérébrales d’intérêt. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de poinçonnage, prélever des poinçons de 0,8 millimètre des régions d’intérêt en utilisant la microdissection in loco.

Les poinçons doivent être stockés à moins 80 degrés Celsius. Il est d’une importance cruciale que le micro-poinçonnage soit effectué de manière standardisée, car l’expression des gènes et la méthylation sont très spécifiques aux tissus. Homogénéiser les poinçons dans 400 microlitres de tampon de thiocyanate de qadium à l’aide d’une pipette puis vortex à température ambiante.

Ensuite, passez le lysat résultant dans une seringue de calibre 29. Plusieurs fois, le poinçon ne doit plus être visible. Divisez le lysat en parties égales.

L’un pour traiter l’ARN, ce qui doit être fait en premier, et l’autre pour traiter l’ADN, qui peut être stocké à température ambiante jusqu’à ce que l’ARN soit traité pour la purification de l’ARN à un dixième volume d’acétate de sodium, un volume d’aquaphénol et un demi-volume de 24 à un vortex de chloroforme à ISOAMYL AML. Le mélange vigoureusement après chaque ajout et incuber la concoction finale sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez le mélange.

Récupérez la phase aqueuse et ajoutez-y un volume égal de 70 % d’éthanol. À l’aide d’un kit de colonne de spin d’ARN. Effectuez une digestion de l’ADN sur colonne et lavez-le élué dans 25 microlitres d’eau.

Purifiez maintenant l’ADN à l’aide d’un protocole de kit modifié pour inclure l’ajout de la digestion d’un RN a, et pour réchauffer le tampon elucien et la colonne elucian à 70 degrés Celsius avant de les utiliser. 10 minutes à 70 degrés Celsius suffisent pour les colonnes. Enfin, utilisez un spectrophotomètre pour déterminer les concentrations d’ADN et d’ARN.

Un poinçon PVN typique produit environ 600 nanogrammes d’ADN et environ 400 nanogrammes de RA mis de côté, environ 100 nanogrammes d’ARN pour l’analyse de l’expression génique par PCR quantitative avant l’amplification par sulfite. Traitez 200 nanogrammes d’ADN isolé avec un kit disponible dans le commerce pour amplifier l’ADN des régions méthylées. Une conception optimale de l’amorce dans la bi PCR est essentielle car la qualité et la spécificité de l’amplicon PCR déterminent le succès des étapes suivantes.

Lorsque les amorces arrivent, déterminez leur température optimale et à genoux à l’aide d’expériences pilotes. Utilisez deux microlitres d’ADN traité au bissulfite comme matrice pour chaque 25 microlitres. Mélange PCR.

Amplifiez le mélange en commençant par une dénaturation de six minutes à 95 degrés Celsius, suivie de 45 à 50 cycles d’amplification avant une élongation finale de cinq minutes à 72 degrés Celsius. Analyser sept microlitres du produit PCR par électrophorèse sur gel Agros pour vérifier la taille de l’amplicon. Purifiez le produit PCR restant pour une ligature ultérieure à l’aide d’un kit de nettoyage PCR disponible dans le commerce.

Si des produits PCR non désirés sont obtenus, utilisez la purification sur gel pour isoler le produit d’intérêt pour ce protocole. Un kit de clonage commercial est utilisé. L’efficacité du clonage dépend essentiellement de l’insert.

Donc, si un petit nombre de clones recombinants est obtenu à plusieurs reprises, essayez un autre vecteur de clonage. Mettez en place une réaction de ligature de 10 microlitres avec un microlitre de vecteur et trois microlitres de produit PCR nettoyé. Mélangez la réaction par pipetage et incubez-la pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.

Nettoyez la réaction de ligature par précipitation classique de l’éthanol et transformez les bactéries avec le produit. Ajoutez un millilitre de milieu SOB préchauffé directement après l’administration de l’impulsion et transférez les bactéries transformées dans un tube réactionnel. Après avoir récupéré les bactéries pendant une heure à 37 degrés Celsius, étalez 100 microlitres de chaque suspension sur une plaque d’ampicilline LB recouverte d’IPTG.

Xal incube les plaques pendant la nuit une fois que les colonies peuvent être cueillies. Mettez en place des réactions de PCR de colonie de 25 microlitres dans une plaque de 96 puits en utilisant trois microlitres de chlorure de magnésium de 2,5 millimolaires dans chaque réaction. Choisissez des clones blancs positifs à l’aide d’une pointe de pipette et transférez-les dans un mélange PCR avec un simple trempage.

Commencez la PCR par un cycle de fusion de quatre minutes. Poursuivez avec 10 cycles d’amplification avec une température de lingue de 56 degrés Celsius. Chaque étape de ces cycles dure 30 secondes.

Diminuez ensuite la température à 48 degrés Celsius pour 30 cycles d’amplification supplémentaires. Terminez par un cycle d’allongement de cinq minutes. Chargez maintenant cinq microlitres de chaque produit sur un gel aros et identifiez les réactions qui contiennent l’insert de la bonne taille.

Utilisez un kit disponible dans le commerce pour nettoyer les produits PCR d’intérêt afin qu’ils puissent être séquencés à l’aide du séquençage cyclique à grand colorant. Dans un puits de 96 puits, des plaques de chargement avec trois microlitres de grand mélange maître de réaction DI, suivis de deux microlitres de produit PCR de colonie nettoyé. Exécutez la réaction sur un thermocycleur en commençant par une minute à 96 degrés Celsius, suivie de 35 cycles de 10 secondes à 96 degrés Celsius, cinq secondes à 50 degrés Celsius et quatre minutes à 60 degrés Celsius.

Une fois la réaction de grande matrice terminée, nettoyez la réaction à l’aide d’une plaque de purification de grande matrice. Après avoir obtenu des séquences, analysez-les à l’aide du grand analyseur en ligne ou de l’outil B-I-S-M-A pour dériver le modèle de méthylation de la région d’ADN étudiée afin de mieux comprendre l’influence du stress en début de vie ou ELS sur l’expression d’un VP et le statut de méthylation. Des bâtonnets noirs de C 57 et des souris ont été traités selon le protocole décrit, le noyau paraventriculaire et le noyau supraoptique ont été perforés pour isoler l’ADN et le R-N-A-D-N-A a été traité au bisulfite, amplifié avec des amorces spécifiques à l’amplificateur a VP et les produits PCR ont été clonés et séquencés sur au moins 20 clones recombinants de chaque souris.

PCR ont été analysées pour déterminer les fréquences de méthylation des CPG contenus dans l’amplicon PCR dans les tissus du P-V-N-E-L-S induisant une hypométhylation significative à quatre endroits sur l’amplificateur A VP, suggérant un marquage épigénétique de cette région régulatrice à travers les premières expériences de vie. Contrairement à la méthylation PVN de l’amplificateur A VP n’était pas affectée par ELS dans le SON, illustrant la spécificité tissulaire de l’effet épigénétique chez les animaux témoins, l’état de méthylation de l’ADN à CPG 10 était corrélé négativement avec l’expression d’un gène VP, indiquant un rôle de la méthylation de l’ADN dans l’ajustement fin de l’expression d’un gène VP. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’UPCR peuvent être facilement mises en œuvre sur l’ARN isolé afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les changements d’expression génique dans le tissu analysé.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier les changements de méthylation de l’ADN en réponse à des stimuli environnementaux ou dépendants.