Name: Analyse des modifications dexpression génique dans lhippocampe de rat après stimulation cérébrale profonde de lantérieur thalamique Nucleus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Découvrez la stimulation cérébrale profonde du noyau thalamique antérieur chez le rat Wistar pour analyser les changements d'expression génique dans l'hippocampe. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets thérapeutiques de la SCP.

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NOTE: Éthique Déclaration: Tous les procédures décrites dans ce manuscrit sont conformes aux directives du NIH pour la recherche animale (Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire) et sont approuvés par l&#39;École de médecine de Harvard Comité IACUC. Préparation 1. Pré-chirurgicale <ol><li> Assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés par autoclavage soit ou en nettoyant avec une solution et / ou de l&#39;éthanol antiseptique si nécessaire. Lorsque cela est possible, utiliser de l&#39;équipement jetable stérile comme des scalpels, aiguilles et seringues. </li><li> Couvrir la table de travail avec draps chirurgicaux et se assurer qu&#39;il ya une élimination des déchets à risque biologique disponible. </li><li> Peser le rat et calculer la dose d&#39;anesthésie. Utiliser un kétamine / xylazine mélange (kétamine à 75 mg / kg de xylazine et 10 mg / kg) à des rats anesthésier. REMARQUE: Entre 200-250 g est le poids optimal pour la fixation correcte de l&#39;animal dans le cadre stéréotaxique ainsi que pour un ciblage précis de l&#39;ATN. Isoflurane peut également être utilisé comme agent anesthésiant. </li><li> Monter et fixer deux électrodes stériles (stérilisés par autoclave ou à l&#39;oxyde d&#39;éthylène) sur le porte-électrode (Figure 2) d&#39;un cadre stéréotaxique chirurgicale et avec l&#39;aide d&#39;un microscope (10-40X agrandissement), inspecter les extrémités de l&#39;électrode pour le bon alignement. Fixer les deux électrodes 3,0 mm. REMARQUE: Prenez soin de ne pas endommager la pointe de l&#39;électrode en touchant sur des surfaces dures. </li></ol> 2. chirurgie DBS <ol><li> Injecter la kétamine / xylazine mélanger par voie intrapéritonéale à l&#39;animal et de confirmer que l&#39;animal a atteint un plan chirurgical d&#39;anesthésie (en vérifiant le réflexe toe-pincement, la fréquence respiratoire et de la profondeur et de la régularité de la respiration). Enlever les poils de la région du cuir chevelu qui sera incisé et désinfecter le cuir chevelu avec trois gommages chaque alternance de la bétadine et de l&#39;alcool ou une solution saline stérile. Fixer et positionner l&#39;animal sur le Fram stéréotaxiquee. </li><li> Utilisation plaquettes circulantes d&#39;eau chaude pour maintenir la température du corps de l&#39;animal à un niveau optimal. Appliquer du lubrifiant des yeux aux yeux de l&#39;animal à l&#39;abri de surséchage. </li><li> Utilisez les coordonnées stéréotaxiques suivantes pour cibler l&#39;ATN (antérieure du noyau thalamique): anterioposterior -1,6 mm, 1,5 mm et médio-latérale dorsoventral 5,2 mm 1. REMARQUE: Les coordonnées stéréotaxiques sont basés sur le Paxinos et Watson (6 ème édition) atlas de cerveau de rat 36. </li><li> Faire une incision dans le cuir chevelu sagittalement de révéler le crâne. En utilisant une paire d&#39;écarteurs sécuriser le cuir chevelu incisée pour exposer le crâne. Utilisez une solution saline stérile pour rincer l&#39;incision. Si l&#39;incision est trop humide, utiliser des cotons-tiges stériles à sécher. Localisez le bregma et marquer avec un marqueur noir. Pour guider la position des trous de bavures, faire deux points de plus d&#39;environ 1,5 mm sur les deux côtés mediolaterally de la suture sagittale et 1,6 mm en arrière du Coronsuture al. </li><li> Utilisez une perceuse à main pour faire les trous de bavures. Assurez-vous que la pointe de l&#39;trou de trépan est stérile en stérilisant avec de l&#39;éthanol. Tenir la perceuse à environ un angle de 45 ° à la surface du crâne lors du forage. Foire basculer entre les deux trous de bavures pour éviter la chaleur excessive à l&#39;endroit de tout trou de trépan. </li><li> Continuer à forer jusqu&#39;à la dure est exposé. En utilisant une aiguille avec sa pointe courbée ressemblant à la forme d&#39;un «L», retirez les morceaux d&#39;os qui pourraient obstruer l&#39;insertion de l&#39;électrode. Prenez soin de ne pas endommager le tissu de la dure-mère et / ou du cerveau qui sous-tend tout en enlevant les fragments d&#39;os en utilisant l&#39;aiguille tordue. NOTE: En utilisant une aiguille émoussée ou pince fine Blunt est également une option. </li><li> Fixer l&#39;ensemble d&#39;électrode double de la poignée tournante du cadre stéréotaxique et fixer la poignée à un angle de 90 °. Utilisation des ajustements dans le cadre stéréotaxique, positionner l&#39;électrode gauche exactement au dessus du bregma. </li><li> Utilisation de la stéréoajustements tactiques pour le positionnement médio-latérale, se déplacer précisément l&#39;électrode de 1,5 mm à gauche sur le côté gauche du bregma de telle sorte que maintenant il ya deux électrodes parfaitement alignées le long de la suture coronale mais espacés à 1,5 mm à partir de la mediolaterally bregma. </li><li> En utilisant les ajustements stéréotaxiques anterioposterior, déplacer les électrodes 1,6 mm en arrière de la suture coronale. </li><li> Utilisez les ajustements dorsoventraux d&#39;abaisser les électrodes d&#39;abord vérifier si les trous de bavures ont été faites au bon endroit de sorte que les électrodes peuvent être insérés avec facilité, sans toucher les bords rugueux des trous de bavures. Dans l&#39;affirmative, insérer les électrodes à une profondeur de 5,2 mm de la surface du crâne. </li><li> Connectez les électrodes par l&#39;intermédiaire conduit à un stimulateur fixé à 130 Hz, 2,5 V et 90 microsecondes de largeur d&#39;impulsion 1. </li><li> Délivrer une stimulation à haute fréquence pendant une heure (ou pendant une période de temps souhaitée comme pour montage expérimental). Au cours de la stimulation, ne oubliez pas d&#39;assurer pRoper profondeur de l&#39;anesthésie régulièrement par vérification de l&#39;absence de retrait de la patte en réponse à un pincement de l&#39;orteil. Compléter l&#39;anesthésie avec environ la moitié de la dose initiale utilisée pour induire une anesthésie. Éviter la contamination de vos gants stériles lors de la vérification profondeur de l&#39;anesthésie et les modifier si nécessaire. Effectuer une stimulation unilatérale ou bilatérale fondée sur les besoins expérimentaux de une. Contrôles tels que la stimulation de basse fréquence (par ex., 10 Hz) et les animaux non stimulés (insertion électrodes sans stimulation ultérieure) Inclure. </li><li> Après stimulation est terminée, retirez les électrodes avec soin et suturer l&#39;incision avec des sutures 3-0 ou avec des agrafes chirurgicales stériles. </li><li> Administrer la buprénorphine (0,05 mg / kg) par voie sous- cutanée comme analgésique. Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à ce qu&#39;il revienne à une activité normale, puis le retourner à l&#39;établissement d&#39;hébergement. </li><li> Après une période de temps basée sur la conception expérimentale (par exemple, 0, 3, après la chirurgie DBS 6 ou 12 h), Euthanasier l&#39;animal à un surdosage d&#39;anesthésie. Après confirmation de l&#39;absence de signes vitaux, de décapiter l&#39;animal. </li><li> Disséquer le cerveau en enlevant d&#39;abord la peau avec des ciseaux. Coupez à travers l&#39;os le long de la suture sagittale aide de ciseaux de dissection. Faire deux incisions plus (environ un pouce chacun) à travers l&#39;os sur les deux côtés latéraux. En utilisant des pinces, soulever la pièce partiellement coupé de l&#39;os du haut du crâne afin d&#39;exposer le cerveau. </li><li> Avec des ciseaux fins ou forceps, déloger le cerveau du crâne et de transférer à une boîte de Pétri avec du PBS froid sur la glace. REMARQUE: Prenez soin de ne pas endommager le cerveau en faisant les incisions à travers l&#39;os. </li></ol> 3. Isolation Hippocampus REMARQUE: Effectuez toutes les étapes ultérieures de cette section sur la glace. <ol><li> Placer le cerveau sur une matrice de cerveau acrylique pré-refroidi sur de la glace. En utilisant une lame de rasoir, couper le cerveau coronaire à environ 7-8 mm à partir de la partie antérieure la plus edge du cerveau. Faire une deuxième coupe coronaire et postérieure à la première coupe de telle sorte qu&#39;une tranche de cerveau d&#39;environ 5 mm d&#39;épaisseur pourrait être retiré. </li><li> Transférer la tranche de cerveau à une boîte de Pétri avec PBS glacé. Aide de la lame de rasoir, couper les deux sections hémisphériques et de prendre soin de noter quel hémisphère correspond aux côtés gauche et droit respectivement. Ceci est particulièrement important lors de l&#39;exécution unilatérales stimulations. </li><li> En utilisant des pinces fines et ciseaux supprimer l&#39;hippocampe attentivement. </li><li> Flash geler le tissu hippocampique sur glace sèche et le ranger dans -20 ° C au congélateur jusqu&#39;au moment pour les étapes ultérieures d&#39;extraction d&#39;ARN. NOTE: Pour le stockage à long terme, il est souhaitable de stocker les tissus dans un congélateur à -80 ° C. </li></ol> 4. Extraction de l&#39;ARN et PCR quantitative <ol><li> Assurez-vous que le tissu reste figé sur glace sèche avant d&#39;être prêt pour l&#39;homogénéisation. </li><li> REMARQUE: Effectuez cette étape dans la hotte. <ol><li> Ajouter 1 ml de réactif Tri à hippocampal tissu dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et on homogénéise d&#39;abord pipetage plusieurs fois jusqu&#39;à ce que le tissu est divisé en plus petits morceaux. En outre homogénéiser le tissu par passage dans une seringue avec une aiguille de 25 G jusqu&#39;à ce que il n&#39;y a pas de tissu ininterrompue visible. Suivez les étapes d&#39;homogénéisation sur la glace. </li><li> Après homogénéisation du tissu, laisser la suspension de cellules au repos à température ambiante pendant 5 min pour permettre la lyse cellulaire. NOTE: Après ce point la suspension cellulaire peut être rapide congelé et stocké dans -70 ° C jusqu&#39;à leur traitement ultérieur. </li></ol></li><li> Ajouter 0,2 ml de chloroforme et mélanger au vortex pendant 20 secondes et laisser la solution reposer à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Après centrifugation, retirer soigneusement les tubes sans déranger les trois couches distinctes qui seront visibles. REMARQUE: Le fond (rouge) de phase contient des protéines, la phase trouble milieu contient de l&#39;ADN et le haut phase limpide contient RN / A. </li><li> Transférer la phase supérieure claire (ARN) dans un nouveau tube de 1,5 ml de centrifugeuse (typiquement 500 ul de l&#39;ARN contenant phase est obtenue). A cela se ajoute 0,5 ml d&#39;isopropanol et mélanger au vortex. A cela se ajoute 2-3 pi de glycogène (20 mg / ml) en tant que support pour l&#39;ARN. Laisser l&#39;échantillon reposer sur la table à la température ambiante pendant 10 min. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 x g pendant 1 heure à 4 ° C. Assurez-vous que le culot d&#39;ARN est visible au fond du tube. </li><li> Jeter le surnageant et laver le culot d&#39;ARN par addition de 1 ml d&#39;éthanol à 75% (à base d&#39;eau exempte de nuclease). Inverser les échantillons plusieurs fois jusqu&#39;à ce que le culot déloge du fond du tube et flotte dans la solution. Centrifuger à 12 000 xg pendant 10 min à 4 ° C. REMARQUE: le culot dans 75% d&#39;éthanol peut être conservé à -20 ° C jusqu&#39;à ce que de nouvelles mesures. </li><li> Laisser le culot d&#39;ARN sécher à l&#39;air en laissant les tubes ouverte pendant 5 min à température ambiante. Prenez des précautions pour éviter over sécher le culot car cela pourrait affecter sa dissolution dans l&#39;eau dans l&#39;étape suivante. </li></ol> 5. Retrait de l&#39;ADN de la Préparation ARN <ol><li> Ajouter 9 ul d&#39;eau sans nucléase au culot d&#39;ARN et assurez-vous le culot est dissous avant de procéder au vortex doucement le tube. Pour cela, ajoutez 1 pl de 10x Dnase Je tampon et 1 ul DNase recombinante (de la trousse DNase I), mélanger en tapotant doucement les tubes, brièvement tourner les tubes et incuber à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 30 min. </li><li> Ajouter 2 ul réactif DNase d&#39;inactivation (de la trousse DNase I) à l&#39;échantillon et incuber à température ambiante pendant 2 min et mélanger souvent en tapotant doucement le tube. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min et le transfert d&#39;environ 10 pi du surnageant clair à un nouveau tube de 1,5 ml de la centrifugeuse. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ARN en utilisant un spectrophotomètre ou NanoDrop. </li></ol> 6. Faire ADNc à partir d&#39;ARN <ol><li> Ajouter ème volume nécessairecontient à 1 pg de l&#39;ARN et de porter le volume total à 8 ul par addition d&#39;eau exempte de nuclease. Pour cela ajouter mM dNTP 1 pi 10 mélanger et 1 pl de hexamères aléatoires du Kit Exposant First Strand Synthesis. Mélanger doucement et incuber à 65 ° C pendant 5 min dans une baignoire d&#39;eau ou sur un thermocycleur pré-programmé. </li><li> Ajouter un prémélange contenant les réactifs suivants: 2 ul de 10 x tampon RT, 4 pi de 25 M de MgCl2, 2 ul de DTT 0,1 M et 1 ul de RNase OUT (40 U / ul). NOTE: Les volumes sont donnés par réaction, l&#39;utilisateur aurait besoin de faire évoluer en fonction des besoins expérimentaux de une. </li><li> Après avoir retiré l&#39;ARN contenant l&#39;échantillon à partir de 65 ° C, mettre le tube à la température ambiante pendant une minute. Ajouter la solution de prémélange 9 pi et incuber à température ambiante pendant 2 min. Ajouter 1 pi d&#39;enzyme Superscript II de la transcriptase inverse (50 U / ul), puis incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 50min pour la transcription inverse de se produire. </li><li> Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 15 min pour achever la réaction. </li><li> Placer les échantillons sur la glace brièvement et ajouter 1 pl RNAseH (2 U / pl) et incuber à 37 ° C pendant 20 min. </li><li> Centrifuger brièvement les tubes à 3000 xg à centrifuger le liquide de condensation. REMARQUE: ce est l&#39;ADNc qui sera utilisé pour la PCR quantitative. ADNc peut être stocké dans le congélateur à -20 ° C jusqu&#39;à ce que la configuration PCR. ADNc peut également être dilué avec de l&#39;eau sans nucléase avant de procéder à la PCR. </li></ol> 7. PCR quantitative <ol><li> Faites un mélange maître contenant les réactifs suivants (les volumes sont donnés par réaction): 6,3 ul de 2x Sybr Green Mix, 0,6 pi de Forward Primer (10 de M), 0,6 pi de amorce inverse (10 M) et 0,5 pi de nucléase eau libre . REMARQUE: conception d&#39;amorce a été effectuée en utilisant le choix dans la page de la séquence nucléotidique du NCBI &#39;amorces de prise en charge pour le gène d&#39;intérêt. </li><li> Ajouter 10 ul mastermix à chaque puits d&#39;une plaque PCR 96 bien. Ajouter 2,5 ul d&#39;ADNc faites plus tôt pour le puits contenant l&#39;mastermix. Assurez-vous de mettre en place des réactions de PCR en triple pour chaque échantillon. </li><li> Après avoir terminé l&#39;addition du mélange maître et l&#39;ADNc, couvrir la plaque PCR en utilisant une feuille adhésive optique pour sceller les puits. Faites tourner la plaque brièvement pendant 5 min à 500 g dans une centrifugeuse de table pour régler tout le liquide au fond du puits. </li><li> Charger la plaque sur une machine PCR RT-PCR pré-programmé. Utilisez les paramètres de la PCR fournis dans le tableau 1. </li><li> L&#39;analyse des données: Utilisez les valeurs C t de la sortie qPCR pour d&#39;autres calculs. Avec le gène de test, mettre en place des réactions de PCR pour les gènes de contrôle interne, 18S (pour assurer entrée égale) et β-actine (contrôle négatif). Calculer fold changes basés sur la méthode ΔΔCt 37. </li></ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Suite à l&#39;ouvrage de référence par Benabid et al. Dans l&#39;utilisation de la stimulation cérébrale profonde pour traiter la maladie de Parkinson et le tremblement essentiel, la technique chirurgicale DBS a été étudié avec beaucoup d&#39;intérêt au cours de la dernière décennie pour traiter de nombreux troubles neurologiques 6,10,43. DBS études ciblant différentes régions neuro-anatomique du circuit du cerveau sont actuellement effectuées par de nombreux groupes pour traiter les principales mala...

L&#39;histoire derrière le développement de la stimulation cérébrale profonde comme une technique neurochirurgicale remonte aux années 1870 lorsque la possibilité de stimuler électriquement les circuits du cerveau a été explorée 2. L&#39;utilisation de la stimulation chronique à haute fréquence pour le traitement de troubles neuronaux a commencé dans les années 1960 3. Plus tard dans les années 1990 avec l&#39;avènement de l&#39;implantation chronique DBS électrodes 4-6, le nombre de troubles neuronaux qui ont été traités par DBS a continué d&#39;augmenter. La stimulation cérébrale profonde a été utilisé pour la première aux États-Unis comme traitement pour le tremblement essentiel 6. Aujourd&#39;hui, la chirurgie est largement utilisé pour traiter les troubles neuronaux qui sont actuellement incurable par une intervention pharmacologique. DBS est actuellement utilisé pour traiter les troubles du mouvement de la maladie de Parkinson et la dystonie 7-9. La démence de type Alzheimer, la maladie, l&#39;épilepsie, la douleur et les maladies neuropsychiatriques tels dépression de Huntington, OCD, Tourette7; le syndrome et la dépendance de quelques-unes des conditions qui se prêtent à un traitement par DBS 10-12. Alors que la chirurgie DBS est approuvé par la FDA pour le traitement de la maladie de Parkinson, la dystonie et le tremblement essentiel, l&#39;utilisation de la SCP pour traiter d&#39;autres conditions mentionnées ci-dessus sont à divers stades de laboratoire et des études cliniques qui offrent beaucoup de promesses aux patients 13,14. Cliniquement, la chirurgie DBS est effectuée en deux étapes. La première étape consiste à positionner les électrodes chirurgicalement DBS à la localisation anatomique ciblée utilisant une combinaison de positionnement radiologique, CT, IRM ainsi que des lectures de microélectrodes pour une précision accrue. La deuxième étape consiste à implanter un générateur d&#39;impulsions en haut de la poitrine du patient et l&#39;extension de l&#39;installation conduit à partir du cuir chevelu du générateur d&#39;impulsions. Sur la base de l&#39;état neurologique, plusieurs régimes de programmation pour le générateur d&#39;impulsions ont été normalisés et seront utilisés pour fournir la tension souhaitée. Le vol finaletage est atteint de manière progressive afin de recevoir la meilleure réponse clinique avec une tension minimale 15. Cependant, dans nos études, contrairement aux implants DBS chroniques utilisé cliniquement, pour des raisons de simplicité, nous avons recours à l&#39;étude d&#39;une stimulation à haute fréquence unique (pendant 1 heure) dans nos modèles animaux. Une partie de la recherche de notre groupe se concentre sur l&#39;étude de l&#39;utilisation de la chirurgie DBS pour le traitement de l&#39;épilepsie réfractaire. Approches chirurgicales stéréotaxiques utilisant stimulation à haute fréquence a été exploré par beaucoup d&#39;autres comme une option efficace pour traiter l&#39;épilepsie médicalement réfractaire qui constitue environ 30% de tous les cas d&#39;épilepsie 10,16,17. Stimulation cérébelleuse ciblant la surface corticale ainsi que les noyaux cérébelleux profonds ont été utilisés dans le passé en tant que cibles pour traiter l&#39;épilepsie 10,18,19. En outre, la stimulation de l&#39;hippocampe a également été essayé, mais avec des résultats mitigés 20,21. Une partie de l&#39;autre objet d&#39;une enquêteDBS objectifs pour l&#39;épilepsie comprennent le cortex cérébral, le thalamus, noyau sous-thalamique et nerf vague 8. Cependant, les résultats suivants de plusieurs études au cours des dernières années, le noyau antérieur du thalamus (ATN) a émergé comme la cible la plus commune DBS pour le traitement de l&#39;épilepsie 10,22. Sur la base de connaissances sur les circuits et les résultats de modèles animaux neuroanatomiques, plusieurs études ont porté sur l&#39;effet thérapeutique de la stimulation cérébrale profonde de l&#39;ATN dans le traitement de l&#39;épilepsie 23-26. L&#39;ATN est une partie du circuit limbique et est situé dans la région du cerveau qui affecte la fréquence des crises. Des études menées par Hamani et al., Ont testé l&#39;efficacité de l&#39;ATN-DBS dans un modèle de l&#39;épilepsie de pilocarpine induit et constaté que la stimulation bilatérale ATN latences pour les convulsions induites par la pilocarpine et état ​​de mal épileptique 24 prolongée. En outre, la stimulation à haute fréquence de l&#39;ATN a été trouvé pour réduire la fréquence des crises dans un modèle pentylenetetrazol (PTZ) de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Ont rapporté une réduction moyenne de la fréquence des crises d&#39;environ 75% lors de la stimulation cérébrale profonde chronique de l&#39;ATN dans le traitement de l&#39;épilepsie partielle réfractaire 30. Une étude clinique récente sur le traitement de l&#39;épilepsie réfractaire a montré des résultats prometteurs après la chirurgie DBS ciblant le noyau antérieur du thalamus (ATN) 22. Un essai clinique randomisé multicentrique de 110 patients subissant DBS bilatérale de l&#39;ATN pour le traitement de l&#39;épilepsie réfractaire (essai SANTE) a indiqué une baisse de la fréquence des crises d&#39;environ 40% 31. Les résultats de cette étude a également laissé entendre sur un effet anti-épileptique optimale retard observé à la chirurgie de poste 2-3 mois. D&#39;autres études par Toda et al., Corroborés avec ces conclusions où ils ont démontré la neurogenèse se passe à un poste plus tard DBS (jours 3-5) dans des modèles animaux une. En outre, Encinas et al., Ont rapporté neurogène hippocampiquesis dans la souris adulte dentate gyrus après stimulation à haute fréquence de l&#39;ATN 32. Des études antérieures ont signalé la baisse de 33 à 35 neurogenèse hippocampique dans certains cas d&#39;épilepsie comme l&#39;épilepsie du lobe temporal chronique et une association avec des déficits d&#39;apprentissage, troubles de la mémoire et des crises spontanées automobiles récurrentes. En outre, il y avait une réduction des facteurs de neurales progénitrices de cellules souches tels que le FGF2 et d&#39;IGF-1 dans l&#39;hippocampe épilepsie chronique chez des modèles animaux 33. Considérant cela, stratégies d&#39;intervention tels que DBS qui montrent une augmentation de la neurogenèse dans le gyrus denté sont des avenues intéressantes pour la recherche. Ces résultats nous ont encouragés à explorer plus profondément dans le mécanisme sous-jacent de traitement neurogenèse post-DBS pour l&#39;épilepsie. Nous avons ciblé l&#39;ATN tant de manière unilatérale (données non communiquées) ainsi que bilatéralement (des résultats représentatifs) et vu neurotrophine élevé (BDNF) expression dans le gyrus denté de rat. Notre cdusyst hypothèse est que l&#39;expression de BDNF initie une cascade expression génique qui culmine dans la neurogenèse qui se traduit par l&#39;effet anti-épileptique de chirurgie DBS. Dans cet article, nous présentons nos méthodes pour la chirurgie DBS ciblant l&#39;ATN chez les rats suivie d&#39;une analyse de l&#39;expression des gènes comme une approche intéressante pour étudier le mécanisme qui sous-tend les avantages de la DBS.

<table><tbody><tr><td>Stimulation cérébrale profonde Chirurgie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modèle 900</td><td></td></tr><tr><td>Drill&nbsp ;</td><td>Dremmel</td><td>7700, 7,2 V</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Patterson Vétérinaire</td><td>07-803-6637</td><td>Annexe III Substance contrôlée, obtention, utilisation et entreposage conformément aux règles institutionnelles</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson Vétérinaire</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Patterson Vétérinaire</td><td>07-850-2280</td><td>Annexe III Substance contrôlée, obtention, utilisation et entreposage conformément aux règles de l’établissement</td></tr><tr><td>Agrafes chirurgicales</td><td>ConMed Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr><tr><td>Sutures (3-0)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3333</td><td></td></tr><tr><td>Seringue (1 ml, 29 1/2 G)</td><td>BD</td><td>329464</td><td>Stérile, à utiliser pour l’administration d’anesthésie par voie intrapéritonéale</td></tr><tr><td>Seringue (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Stérile, à utiliser pour l’administration sous-cutanée d’analgésie</td></tr><tr><td>Aiguilles</td><td>BD</td><td>305761</td><td>Stérile, à utiliser pour dégager les morceaux d’os cassés des trous de bavure</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientifique</td><td>S25309B</td><td>Utilisation pour la stérilisation générale&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lubrifiant pour les yeux</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>Medtronic</td><td>Modèle 3628</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes DBS</td><td>Rhodes Medical Instruments, CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td> Les <td>électrodes sont en platine, concentriques et bipolaires</td></tr><tr><td>Bétadine (Povidone-Iode)&nbsp ;</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>Écouvillons à usage unique, à utiliser pour stériliser le cuir chevelu avant de faire une incision.</td></tr><tr><td>&nbsp ; Dissection cérébrale et isolement</td><td></td><td></td><td></td>du tissu de l’hippocampe</tr><tr><td>Acrylique Rongeur Matrice cérébrale</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>175-300</td><td>www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>V W R</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à guillotine</td><td>Clauss</td><td>18039</td><td>Pour la décapitation, assurez-vous que ces ciseaux sont maintenus en état de propreté et de fonctionnement</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Codman Classic</td><td>34-4098</td><td>Utilisation pour l’ablation du cerveau du crâne</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72957-06</td><td>Utilisation pour l’ablation du cerveau du crâne et pour la manipulation lors de la dissection</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&nbsp ;</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>² Extraction de l’ARN et préparation de l’ADNc Tri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>réactif</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>Toujours utiliser dans une hotte et porter des lunettes de protection lors de la manipulation ; éviter tout contact avec la peau</td></tr><tr><td>Seringue (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Utilisation pour l’homogénéisation des tissus</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>Toujours utiliser dans une hotte et porter des lunettes de protection lors de la manipulation ; éviter tout contact avec peau</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript First Strand Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse de table</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; PCR quantitative</td><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>Custom Oligos</td><td>Invitrogen</td><td>10668051</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plates (96 puits)</td><td>Denville Scientific</td><td>C18080-10</td><td></td></tr><tr><td>Feuilles adhésives optiques</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30538-02</td><td></td></tr><tr><td>Real Time PCR Machine</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des modifications d&#39;expression génique dans l&#39;hippocampe de rat après stimulation cérébrale profonde de l&#39;antérieur thalamique nucleus

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

La stimulation cérébrale profonde (DBS) chirurgie, en ciblant différentes régions du cerveau telles que les noyaux gris centraux, le thalamus, et les régions sous-thalamique, est un traitement efficace pour plusieurs troubles du mouvement qui ne ont pas répondu au médicament. Les progrès récents dans le domaine de la chirurgie DBS a commencé à étendre l&#39;application de cette technique chirurgicale à d&#39;autres conditions aussi diverses que l&#39;obésité morbide, la dépression et le trouble obsessionnel compulsif. Malgré ces indications en expansion, on en sait peu sur les mécanismes physiologiques sous-jacents qui facilitent les effets bénéfiques de la chirurgie DBS. Une approche pour cette question consiste à effectuer une analyse de l&#39;expression des gènes dans les neurones qui reçoivent la stimulation électrique. Des études antérieures ont montré que la neurogénèse dans le gyrus denté de rat est obtenue chez DBS ciblage du noyau antérieur du thalamus 1. La chirurgie DBS ciblant l&#39;ATN est largement utilisé pour le traitement de l&#39;épilepsie réfractaire. Il est donc beaucoup interest pour nous d&#39;explorer les changements de transcription induits par stimulation électrique du ATN. Dans ce manuscrit, nous décrivons nos méthodologies pour la chirurgie stéréotaxique DBS-guidée ciblant l&#39;ATN chez des rats Wistar mâles adultes. On discute également les étapes suivantes pour la dissection de tissu, isolement de l&#39;ARN, la préparation d&#39;ADNc et RT-PCR quantitative pour mesurer les changements d&#39;expression génique. Cette méthode peut être appliquée à jour et pour stimuler les noyaux gris centraux et d&#39;autres régions du cerveau communément cliniquement ciblée. L&#39;étude de l&#39;expression du gène décrit ici suppose une approche de gène cible candidat pour découvrir acteurs moléculaires qui pourraient être diriger le mécanisme de DBS.

Les figures 1A et 1B montrent l&#39;expression relative de BDNF et GABRD par rapport au gène de la β-actine de contrôle. BDNF, une neurotrophine est souvent associée à des effets neuroprotecteurs dans de nombreuses maladies neuronales 38-41. Il est donc intéressant d&#39;analyser le profil d&#39;expression du BDNF en réponse à la stimulation de l&#39;ATN qui donne un bénéfice thérapeutique aux patients épileptiques. Sur la figure 1A qui montre le profil d&#39...

Le mécanisme sous-jacent aux effets thérapeutiques de la chirurgie de stimulation cérébrale profonde (SCP) doit être étudié. Les méthodes présentées dans ce manuscrit décrivent une approche expérimentale pour examiner les événements cellulaires déclenchés par la SCP en analysant le profil d’expression génique des gènes candidats qui peuvent faciliter la neurogenèse après une chirurgie de SCP.

Analyse des modifications d&#39;expression génique dans l&#39;hippocampe de rat après stimulation cérébrale profonde de l&#39;antérieur thalamique Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une stimulation cérébrale profonde du noyau antérieur du thalamus et d'étudier les modifications de l'expression génique dans l'hippocampe du rat. Cela est réalisé en anesthésiant d'abord l'animal. Ensuite, l'animal est préparé pour l'intervention chirurgicale.Une incision est pratiquée dans le cuir chevelu et le crâne est exposé. Ensuite, à la position droite par rapport au bgma, les orifices de trépanation sont réalisés. Les électrodes de stimulation cérébrale profonde sont insérées et la stimulation est effectuée.Enfin, l'animal est euthanasié et le cerveau est disséqué. Pour extraire l'hippocampe, le tissu est traité afin d'extraire l'ARN, puis la préparation d'ADNc et la PCR quantitative sont réalisées. En définitive, les résultats démontrent que la stimulation cérébrale profonde influence l'expression génique dans l'hippocampe du rat.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la chirurgie de stimulation cérébrale profonde, telles que quelles sont les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'effet thérapeutique de cette chirurgie ? Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement non seulement de l'épilepsie, mais également d'autres affections neuronales telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et la dystonie. Étant donné que la stimulation cérébrale profonde émerge comme une approche chirurgicale pour traiter de nombreuses affections neuronales, préparez-vous à l'intervention en utilisant des compresses chirurgicales pour couvrir la paillasse et en vous assurant qu'une poubelle pour déchets biologiques est disponible.Placez le rat sur une balance et calculez la dose d'anesthésique conformément au protocole indiqué. Fixez solidement deux électrodes sur le support d'électrodes d'un cadre chirurgical stéréotaxique et, à l'aide d'un microscope, vérifiez l'alignement correct des pointes des électrodes. Fixez les électrodes à trois millimètres l'une de l'autre, en prenant soin de ne pas toucher les pointes des électrodes sur des surfaces dures. Injectez la kétamine-xylazine.Injecter par voie intrapéritonéale chez l'animal et confirmer que l'animal a atteint un stade chirurgical d'anesthésie en vérifiant le réflexe de pincement des orteils, la fréquence respiratoire ainsi que la profondeur et la régularité de la respiration. Immobiliser et positionner l'animal sur le cadre stéréotaxique. Appliquer un lubrifiant oculaire sur les yeux de l'animal afin de les protéger contre le dessèchement excessif, puis désinfecter le cuir chevelu à l'aide de trois frictions alternées, chacune au Betadine et à l'alcool ou à la solution saline stérile.Placer l'animal sur un tapis chauffant à circulation d'eau tiède ou utiliser des lampes chauffantes afin de maintenir sa température corporelle à un niveau optimal. Selon l'atlas du cerveau de rat de Paxinos et Watson, utiliser les coordonnées stéréotaxiques suivantes pour cibler le noyau thalamique antérieur : antéro-postérieur -1,6 millimètre, médio-latéral 1,5 millimètres et dorso-ventral 5,2 millimètres.Ensuite, pratiquer une incision dans le cuir chevelu en sens sagittal afin de découvrir le crâne. À l’aide d’une paire de rétracteurs, fixer le cuir chevelu incisé pour exposer le crâne. Puis, à l’aide de compresses stériles imbibées d’éthanol, nettoyer la zone incisée afin de bien mettre en évidence les sutures. Localiser le bgma et utiliser un marqueur noir pour marquer l’emplacement servant de guide pour les trous de trépanation.Effectuez deux autres marques à environ 1,5 millimètre de part et d’autre du sillon sagittal et à 1,6 millimètre en arrière du sillon coronal. Pour réaliser les deux orifices de trépanation, utilisez de l’éthanol afin de désinfecter la pointe du foret.À l’aide d’un foret tenu à un angle de 45 degrés, percer fréquemment alternativement les deux trous afin d’éviter une chaleur excessive au centre de l’un ou l’autre trou. Poursuivre le perçage jusqu’à l’exposition de la dure-mère. À l’aide d’une aiguille dont la pointe est courbée en forme de L, retirer tout éclat osseux pouvant entraver l’insertion de l’électrode.Veillez à ne pas endommager la dure-mère sous-jacente ni le tissu cérébral lors de l'élimination des fragments osseux. Fixez l'ensemble à double électrode au manche rotatif du cadre stéréotaxique et positionnez le manche à un angle de 90 degrés. À l'aide des réglages du cadre stéréotaxique, placez l'électrode gauche exactement au-dessus du bgma.À l'aide des réglages stéréotaxiques pour le médial. Le positionnement latéral a déplacé précisément l'électrode gauche de 1,5 millimètre vers le côté gauche du bgma, de sorte qu'il y ait maintenant deux électrodes parfaitement alignées le long de la suture coronale, mais espacées l'une de l'autre. À 1,5 millimètre du médial vers le latéral par rapport au bgma.Ensuite, à l’aide des réglages stéréotaxiques antéro-postérieurs, déplacer les électrodes de 1,6 millimètre vers la partie postérieure par rapport à la suture coronale. Puis, à l’aide des réglages dorso-ventraux, abaisser les électrodes afin de vérifier d’abord si les trépanations ont été réalisées à l’emplacement approprié, de sorte que les électrodes puissent être insérées facilement sans toucher les bords irréguliers des orifices de trépanation. Dans l’affirmative, insérer les électrodes à une profondeur de 5,2 millimètres par rapport à la surface du crâne.Relier les électrodes par des câbles à un stimulateur réglé à 130 hertz, 2,5 volts et une largeur d'impulsion de 90 microsecondes. Appliquer une stimulation à haute fréquence pendant une durée souhaitée. Effectuer une stimulation unilatérale ou bilatérale.Une fois la stimulation terminée, retirez soigneusement les électrodes et fermez l'incision à l’aide de trois points de suture en Zéro ou de agrafes chirurgicales stériles, administrez de la buprénorphine par voie sous-cutanée, surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve une activité normale, puis réintroduisez-le dans l’établissement d’hébergement. Placez le cerveau sur une matrice cérébrale en acrylique prérefroidie sur de la glace à l’aide d’un scalpel. Coupez le cerveau dans le plan coronal à environ sept à huit millimètres du bord le plus antérieur du cerveau.Effectuez une deuxième coupe de manière soigneuse et postérieure à la première afin de prélever une tranche de cerveau d'environ cinq millimètres d'épaisseur. Transférez la tranche cérébrale dans une boîte de Pétri contenant du PBS glacé à l’aide d’un scalpel, séparez les deux hémisphères et veillez à noter précisément lequel correspond au côté gauche et lequel au côté droit. À l’aide de pinces fines et de ciseaux, retirez soigneusement l’hippocampe, congélez le tissu sur de la glace sèche et conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’au moment d’effectuer les étapes d’ARN suivantes, réalisées conformément au protocole indiqué ici. Voici les niveaux d’expression relative du BDNF par rapport au gène témoin bêta-actine aux différents points temporels indiqués.Stimulation post-STN. Une uprégulation du BDNF est observée immédiatement après la chirurgie de STN, accompagnée d'un pic d'expression trois heures après la stimulation. Cette observation suggère qu'une expression accrue du BDNF et la neuroprotection qui en résulte pourraient contribuer à l'effet thérapeutique de la STN chez les patients épileptiques.Ce panneau illustre l'expression du récepteur GABA, G-A-B-R-D, qui présente une expression accrue chez les animaux stimulés par rapport aux témoins non stimulés, trois heures après la DBS. Étant donné que les agonistes du GABA sont utilisés comme inhibiteurs efficaces des crises, il est intéressant d'observer une expression accrue de G-A-B-R-D après la DBS, ce qui implique un rôle possible du GABA dans l'effet antiépileptique de la DBS. Suite à cette procédure.D'autres méthodes telles que le western blot, l'immunoprécipitation de chromatine et de nombreux autres tests moléculaires standards peuvent être réalisées. Cela permet de répondre à des questions relatives aux modifications de l'expression protéique, aux modifications post-traductionnelles, à la fixation de facteurs de transcription sur des régions spécifiques de promoteurs géniques, entre autres. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une chirurgie de stimulation cérébrale profonde chez le rat.Isolez le tissu hippocampique et analysez-le pour détecter des modifications de l'expression génique.

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Source : Casquero-Veiga, M. et al. Tomographie par émission de positons in vivo pour révéler les modèles d’activité induits par la stimulation cérébrale profonde chez le rat. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre les effets métaboliques de la stimulation cérébrale profonde (SCP) à l’aide de l’imagerie FDG-PET dans un modèle de rat. Il décrit les étapes de l’administration du FDG, de l’application de la SCP et de l’imagerie TEP/TDM pour cartographier les régions du cerveau où l’activité...

Évaluation de la neuromodulation métabolique induite par la stimulation cérébrale profonde aiguë chez le rat à l’aide de la TEP-FDG in vivo

Source : Selvakumar, T., et al., Analyse des changements d’expression génique dans l’hippocampe du rat après une stimulation cérébrale profonde du noyau thalamique antérieur. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la procédure d’implantation d’électrodes dans le cerveau du rat pour appliquer une stimulation cérébrale profonde (SCP), qui module l’activité neuronale et améliore la communication avec l’hippocampe, favorisant ainsi la survie neuronale et la neurogenèse.

Effets de la stimulation cérébrale profonde sur l’activité neuronale de l’hippocampe dans un modèle de rat

Cette vidéo démontre la détection de la synthèse de l’ARN du récepteur de la sérotonine à l’aide de sondes oligonucléotidiques dans le tissu cérébral du rat affecté par le syndrome sérotoninergique. Le protocole comprend le prétraitement tissulaire, l’hybridation de sondes et la détection enzymatique pour visualiser et quantifier l’expression de l’ARN du récepteur de la sérotonine au microscope.

Hybridation in situ à l’aide de sondes oligonucléotidiques pour étudier l’expression de l’ARN dans des sections de cerveau de rat

Nous décrivons comment utiliser la microdissection par capture laser (LCM) pour obtenir des populations enrichies de neurones de l'hippocampe ou des neurones simples de coupes congelées de cerveau de rat blessé pour l'analyse d'expression génique ultérieure à l'aide quantitative PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier.

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l&#39;analyse d&#39;expression génique après un traumatisme crânien

Ce protocole décrit un procédé standard pour l'imagerie fonctionnelle simultanée de résonance magnétique et la stimulation cérébrale profonde dans le rongeur. L'utilisation combinée de ces outils expérimentaux permet l'exploration de l'activité aval mondiale en réponse à une stimulation électrique à pratiquement n'importe quelle cible de cerveau.

La stimulation cérébrale profonde avec simultanée IRMf chez les rongeurs

Une méthode d’implantation d’électrodes dans le noyau sous-thalamique (STN) de rats est décrite. Une meilleure localisation du STN a été obtenue grâce à l’utilisation d’un système de microenregistrement. De plus, une configuration de stimulation est présentée qui se caractérise par des connexions durables entre la tête de l’animal et le stimulateur.

Microélectrodes guidée implantation d&#39;électrodes dans le noyau sous-thalamique des rats à long terme de stimulation cérébrale profonde

La stimulation cérébrale profonde (SCP) est une option de traitement efficace pour la maladie de Parkinson. Nous avons établi un plan d’étude pour cribler de nouveaux paradigmes de stimulation chez le rat. Le protocole décrit l’utilisation du test de l’escalier et du test du cylindre pour l’évaluation des résultats moteurs chez les rats hémiparkinsoniens traités par DBS.

Une nouvelle approche pour évaluer les résultats du moteur de profondes cérébrales Effets Stimulation chez le rat Hemiparkinsonian: Escalier et cylindre d&#39;essai

Nous avons appliqué une stimulation magnétique transcrânienne répétitive (rTMS) à l’hémisphère unilatéral du cerveau du rat, en plaçant une bobine en forme de 8 de 25 mm à 1 cm du sommet sur la ligne biauriculaire et en angulant la bobine de 45°. Un système de refroidissement par eau interne a été utilisé pour le rTMS pendant plus de 20 min.

Répétitif stimulation magnétique transcrânienne à l&#39;Unilatérale hémisphère de cerveau de rat

Ce protocole indique comment mettre en place une méthode fiable de HFS chez la souris. Neurones dans l’hippocampe gyrus denté sont stimulés électriquement par HFS directement et indirectement in vivo. L’activité neuronale et la signalisation moléculaire sont examinés par c-fos et immunofluorescence Notch1, respectivement ; neurogenèse est quantifiée par la bromodéoxyuridine dosage d’étiquetage.

Une méthode Invasive pour l’Activation du Gyrus denté souris par Stimulation haute fréquence

La stimulation transcrânienne courant continu (CDV) est une technique thérapeutique proposée pour traiter les maladies psychiatriques. Un modèle animal est essentiel pour comprendre les altérations biologiques spécifiques évoquées par STD. Ce protocole décrit un modèle de souris de CDV qui utilise une électrode chroniquement implantée.

Stimulation transcrânienne courant continu (CDV) chez la souris

Nous décrivons une méthode expérimentale préclinique pour évaluer la neuromodulation métabolique induite par la stimulation cérébrale profonde aiguë avec le FDG-TEP in vivo . Ce manuscrit comprend toutes les étapes expérimentales, de la chirurgie stéréotaxique à l’application du traitement de stimulation et à l’acquisition, au traitement et à l’analyse des images TEP.

In vivo Tomographie par émission de positons pour révéler les schémas d’activité induits par la stimulation cérébrale profonde chez le rat

Découvrez la stimulation cérébrale profonde du noyau thalamique antérieur chez le rat Wistar pour analyser les changements d'expression génique dans l'hippocampe. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets thérapeutiques de la SCP.

Analyse des modifications dexpression génique dans lhippocampe de rat après stimulation cérébrale profonde de lantérieur thalamique Nucleus (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse des modifications d'expression génique dans l'hippocampe de rat après stimulation cérébrale profonde de l'antérieur thalamique Nucleus

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