Conception, Traitement de surface, Cellulaire Placage et culture des réseaux neuronaux modulaires Composé de circuits Fonctionnellement Inter-connectées
15 avril 2015
Ce manuscrit décrit un protocole de croître dans les réseaux modulaires in vitro consistant en l'espace confiné, circuits neuronaux fonctionnellement interconnectés. Un masque de polymère est utilisé pour motif une couche de protéines pour favoriser l'adhérence cellulaire sur le substrat de culture. Plaqués neurones poussent sur les zones revêtues établissant des connexions spontanées et présentant une activité électrophysiologique.
L’objectif global de cette procédure est de développer des réseaux modulaires in vitro constitués de circuits neuronaux interconnectés, fonctionnels et spatialement confinés. Pour ce faire, il suffit d’abord de préparer les pochoirs PDMS pour modeler une couche de protéines afin de favoriser l’adhésion cellulaire sur le substrat de culture. La deuxième étape consiste à nettoyer les substrats de culture.
Plus précisément, les surfaces des boîtes de Pétri, des lamelles de recouvrement et des réseaux multi-électrodes. Ensuite, les pochoirs PDMS sont déposés sur le substrat de culture et les motifs de couche de protéines adhésives souhaités sont créés. La dernière étape est le placage des cellules gliales neuronales.
En fin de compte, les enregistrements de réseaux d’électrodes multiples et l’imagerie calcique sont utilisés pour montrer la dynamique des réseaux neuronaux modulaires réalisés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions ouvertes clés dans le domaine des neurosciences, telles que l’étude de la dynamique de la communication entre les assemblages neuronaux, et permettra de contrer les conditions expérimentales. Le polyméthylsoane ou PDMS est fabriqué en mélangeant d’abord une partie d’agent de durcissement avec 10 parties d’agent de base.
Après cinq minutes de mélange, déplacez le mélange dans une chambre à vide pendant 15 minutes. Après 15 minutes, vérifiez s’il y a des bulles et retournez la solution dans la chambre pendant 15 minutes de plus. Ensuite, préparez une plaquette sur le codeur de spin.
Ouvrez les boutons de gaz pour l’azote gazeux. Placez une plaquette sur l’essoreuse et fixez-la en place avec l’aspirateur. Versez ensuite une fine couche de PDMS sur la plaquette.
Faites tourner la plaquette avec du PDMS pendant une minute à 1000 tr/min pour obtenir un revêtement PDMS de 100 microns d’épaisseur sur la plaquette. Transférez ensuite la gaufrette sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius. Laissez-le cuire pendant 30 minutes.
Une fois que le PDMS a durci, utilisez une pipette pour tracer les bords des pochoirs avec plus de PDMS. Faites ensuite cuire le PDMS ajouté sur la gaufrette. Comme précédemment, lorsque les bordures PDMS ont durci, coupez le pochoir le long des bordures et retirez le pochoir en silicone de la plaquette pour commencer les RIN.
Des plaques de verre carrées de 23 millimètres sont recouvertes d’eau distillée, suivie de 70 % d’éthanol, puis d’acétone, puis d’isopropanol et enfin d’eau distillée. Encore une fois, séchez les carrés sous un flux d’azote gazeux. Ensuite, appuyez doucement sur un pochoir PDMS sur chaque bordereau de protection.
Mettez les lamelles avec les pochoirs dans une chambre à vide pendant 15 minutes. Une fois aspiré, déposez un millilitre de PDL sur les pochoirs et remettez les assemblages dans la chambre à vide pendant 20 minutes. Répétez une fois le cycle d’aspiration de 20 minutes, puis laissez sécher le PDL pendant la nuit le lendemain.
Préparez les boîtes de Pétri qui soutiendront les cellules de réseautage. Premier. Couvrir des plats de 3,5 centimètres avec un millilitre de PDL pendant deux heures. À température ambiante plus tard, retirez le PDL du plat par aspiration.
Lavez ensuite la vaisselle à l’eau distillée et laissez-la sécher. Une fois qu’un plat est sec, ajoutez un petit volume de graisse silicone dans le plat en fonction des quatre coins de la lamelle. Placez les lamelles sur le plat avec le PDMS vers le haut et appuyez doucement dessus pour vous assurer qu’elles sont fixées.
Maintenant, épilez doucement A-P-D-M-S des capots en laissant le motif PDL. Enfin, stérilisez les plats en les exposant aux UV pendant sept minutes. Tout d’abord, nettoyez le réseau multi-électrodes en le lavant sous l’eau du robinet, puis en le sonicant dans un détergent enzymatique concentré.
Répétez ces étapes trois fois. Ensuite, sonifiez le MEA dans de l’eau distillée pure trois fois, puis sous une hotte. Lavez le MEA avec de l’eau distillée au préalable.
Stérilisez-le à la lumière UV pendant 30 minutes. Ensuite, préparez d’abord le réseau de soutien. Versez le PDMS dans une plaque de 12 ou 24 puits.
Une fois que le PDMS a durci, retirez-le à l’aide d’une aiguille. Maintenant, découpez des trous au centre des disques pour faire des anneaux, qui servent de support de moule. Placez maintenant un support de moule au centre du MEA et couvrez la surface externe exposée du MEA.
Laissez cela reposer pendant deux heures dans la chambre. Ensuite, aspirez le lavage PDL, la surface externe exposée du MEA avec de l’eau distillée, et retirez le support du moule afin que le MEA puisse être laissé sécher. Fixez maintenant un pochoir à un micro-manipulateur préparé sous un microscope inversé.
Inspectez et alignez la structure à motifs pour qu’elle corresponde aux électrodes du MEA. Ensuite, utilisez le micro-manipulateur pour abaisser le pochoir sur la surface MEA. Une fois fixé, soulevez le manipulateur microm et, si nécessaire, utilisez une pince à épiler pour appliquer une petite pression afin d’empêcher le PDMS de se détacher.
Transférez maintenant le MEA dans la chambre à vide pendant 15 minutes. Appliquez ensuite une goutte d’un millilitre de PDL sur le pochoir et retournez dans la chambre à vide pendant deux cycles de 20 minutes. Laissez sécher le PDL pendant la nuit le lendemain.
Retirez les pochoirs P DM S des meas à l’aide d’une pince à épiler. Enfin, stérilisez les meas pendant sept minutes. Ils sont ensuite prêts pour les cellules dans les cellules de culture de préparation et préparent les suspensions comme dans le protocole de texte.
Une fois que Resus a suspendu le nombre requis de cellules, plaquez-les au centre de la zone à motifs sur le MEA ou la lamelle. Un MEA doit être chargé avec des volumes de 100 microlitres et un bordereau de couverture. Peut accueillir 1000 microlitres.
Incuber les cellules de la plaque pendant 40 minutes, puis ajouter un milieu de placage pour maintenir les cellules tous les quatre jours. Rajoutez du milieu de croissance frais supplémenté. Après le sixième ou le septième jour, les connexions neuronales entre les modules devraient commencer à se former à ce moment-là.
Diluez le milieu de culture avec un agent anti-mitotique pour éviter la prolifération gliale. Après quatre jours in vitro, il est possible d’observer que les neurones attachés à l’intérieur de la DL codent des taches de 600 microns carrées après 14 jours. En culture, les neurones établissent spontanément une connexion à l’intérieur des modules et entre les modules formant des réseaux fonctionnels actifs.
Des circuits neuronaux de 300 microns carrés ont été observés en ayant la taille des caractéristiques du PDMS tout en conservant la même concentration de placage. L’imagerie calcique a été réalisée à l’aide d’un objectif Forex pour une activité générale dans les réseaux cultivés. Entre les modules verts et roses, on voit un plus grand nombre de connexions tandis que les modules bleus et rouges sont moins connectés aux autres modules.
Un graphique des événements calciques est montré pour un film acquis à 30 hertz avec une image de 1 million de pixels. Les modules verts et roses étaient très synchronisés, tandis que les modules bleu et rouge l’étaient moins. Un réseau modulaire cortical composé de trois circuits distincts a été enregistré à 21 jours in vitro.
À l’aide d’une MEA, des circuits neuronaux distants d’environ 600 microns se sont avérés interconnectés. Leur activité électrophysiologique a été reconstituée. À l’aide d’un algorithme précis de détection des pointes de synchronisation, un tracé de liste de cinq minutes de ces données a été réalisé avec des données de cluster codées en couleur.
Cela permet de comparer l’ensemble du réseau et l’activité d’un seul cluster et donne un aperçu de la synchronisation intra-cluster. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des pochoirs PDM et de les utiliser pour modéliser l’adhésion des cellules neurogliales conduisant à l’établissement d’un réseau modal fonctionnel.
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Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant de cultiver in vitro des réseaux modulaires composés de circuits neuronaux interconnectés fonctionnellement et spatialement confinés. Cette réalisation est obtenue en préparant des pochoirs en PDMS pour dessiner une couche de protéine qui favorise l'adhésion cellulaire sur le substrat de culture.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Électrophysiologie
Contexte
- Les réseaux neuronaux in vitro sont essentiels à l'étude de la connectivité neuronale.
- Le confinement spatial des circuits neuronaux peut améliorer l'interconnectivité fonctionnelle.
- L'adhésion cellulaire est cruciale pour une croissance neuronale réussie.
- Les pochoirs en PDMS sont couramment utilisés pour le dessin de motifs en culture cellulaire.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour créer des réseaux neuronaux modulaires in vitro.
- Étudier les propriétés électrophysiologiques de ces réseaux.
- Établir des connexions spontanées entre les neurones ensemencés.
Méthodes utilisées
- Préparation de pochoirs en PDMS pour le dessin de motifs protéiques.
- Nettoyage des substrats de culture tels que les boîtes de Pétri et les lamelles.
- Dépôt de pochoirs en PDMS sur le substrat afin de créer des motifs adhésifs.
- Ensemencement de cellules neuronales et gliales sur le substrat dessiné.
Résultats principaux
- Mise en place réussie de circuits neuronaux spatialement confinés.
- Démonstration de connexions spontanées entre neurones.
- Activité électrophysiologique observée dans les réseaux cultivés.
- Validation du protocole pour des études futures sur la connectivité neuronale.
Conclusions
- Le protocole crée efficacement des réseaux neuronaux modulaires in vitro.
- Le confinement spatial améliore l'interconnectivité fonctionnelle.
- Cette méthode peut être utilisée pour des études électrophysiologiques supplémentaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cette méthodologie in vitro de réseau neuronal modulaire permet un contrôle spatial précis des assemblages neuronaux, soutenant une détection mécanistique des risques lors de la validation ciblée en découverte de médicaments en neurosciences. En établissant des circuits fonctionnellement interconnectés avec des lectures quantifiables d'électrophysiologie et d'imagerie calcique, cette approche offre une confiance prédictive dans les tests de connectivité neuronale. Elle répond à un défi majeur en phase de découverte : modéliser la dynamique des circuits cérébraux afin d'évaluer les effets des composés sur la synchronie et la communication au sein du réseau.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en modulant la distance inter-compartiment pour réguler la synchronisation entre modules.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système pertinent pour la maladie afin d'évaluer l'engagement de la cible grâce à la formation spontanée de circuits neuronaux et à l'établissement d'un réseau fonctionnel.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des mesures quantitatives de variables dépendantes par des enregistrements à l’aide de réseaux de microélectrodes et d’imagerie calcique afin d’évaluer la dynamique de l’activité du réseau.
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation des tests grâce à un façonnage reproductible à l’aide de pochoirs en PDMS et à un dépôt contrôlé de couches protéiques assurant une adhérence cellulaire constante.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Offre un alignement de biomarqueurs translationnels en corrélant la densité de connexion avec l'occurrence de la synchronisation, permettant ainsi des décisions d'avancement ajustées au risque.
- Valeur opérationnelle : Facilite la continuité des modèles précliniques en permettant l'observation de la formation des connexions neuronales après 6 à 7 jours en culture et de leur stabilisation au jour 14.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en permettant le test d'hypothèses sur la dynamique de la communication neuronale, les résultats informant directement l'identification des candidats prometteurs par profilage de l'activité du réseau.
- Découverte en biologie : Facilite l'élucidation des voies en permettant une étude contrôlée de la manière dont la densité de connexion régule la synchronisation entre modules dans les réseaux modulaires.
- Screening : Assure la préparation des tests grâce à des protocoles standardisés de traitement de surface et de mise en place cellulaire, garantissant une fixation neuronale reproductible sur les zones dessinées au PDL.
- Analytique : Offre la détection des potentiels électrophysiologiques et la mesure du début des événements calciques, permettant une comparaison quantitative de la synchronie intra- et inter-amas dans différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la validation préclinique en démontrant la formation spontanée de réseaux fonctionnels qui reflètent les principes de communication des circuits in vivo.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une capacité réutilisable de dessin de réseaux neuronaux sur divers substrats (lames, MEAs) afin de soutenir des campagnes répétées de criblage et des études de validation de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles neuronales en fournissant un système contrôlable pour étudier comment la topologie structurelle influence la connectivité fonctionnelle.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à un revêtement PDL assisté par vide et à des étapes de stérilisation par UV, qui garantissent une préparation de surface cohérente entre les expériences.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en permettant des tests de réponse-dose de composés sur la synchronisation des réseaux, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée du développement de médicaments pour le système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en quantifiant les seuils de synchronisation dépendants des connexions, fournissant ainsi des éléments pour la dé-risquisation mécanistique des cibles neuronales.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en fabrication de pochoirs microfluidiques, en culture de cellules neuronales et en techniques d’enregistrement électrophysiologiques ou optiques.
- Suppose l’accès à un équipement de dépôt par centrifugation, à des chambres à vide, à des stérilisateurs UV, à des matrices multielectrodes et à des systèmes d’imagerie calcique.
- Exige une standardisation interéquipes en matière de conception des pochoirs, de protocoles d’encapsulation des protéines et de densités de semis afin d’assurer la reproductibilité entre laboratoires.
- Implique des adaptations selon les sous-types neuronaux ou les rapports de co-culture avec les cellules gliales, afin de maintenir la stabilité du réseau et d’éviter une surcroissance.
- Comprend des limites pratiques, telles que la nécessité d’un alignement précis des pochoirs par rapport aux électrodes de la MEA et la dépendance vis-à-vis de la taille des structures en PDMS pour définir les dimensions des circuits (par exemple, des modules carrés de 300 microns).
