Réseaux de neurones conçus par micro-tissus tridimensionnels inspirés anatomiquement pour la reconstruction, la modulation et la modélisation du système nerveux

Ce protocole décrit la fabrication de réseaux neuronaux micro-tissulaires ou micro-TENNs, qui sont des constructions tridimensionnelles miniatures composées de longs faisceaux axonaux alignés couvrant des populations neuronales discrètes dans la lumière d’un hydrogel tubulaire. Les micro-TENN reproduisent l’anatomie générale du connectome cérébral au niveau des systèmes, en particulier des groupes de neurones fonctionnellement similaires reliés par de longs faisceaux axonaux. Parce qu’ils sont pré-cultivés pour imiter la cytoarchitecture des voies cérébrales, les micro-TENN peuvent être utilisés pour la reconstruction ciblée des circuits neuronaux perdus en raison d’un traumatisme ou d’une maladie neurodégénérative et comme modèles biofidèles pour les études neurobiologiques.

L’un des aspects les plus difficiles de ce protocole est de travailler avec le facteur de forme à l’échelle du micron, qui est finalement nécessaire pour permettre une administration peu invasive dans le cerveau. Commencez par briser manuellement les tubes capillaires en verre en fragments de 2 à 2,5 centimètres et insérez une aiguille d’acupuncture dans chaque fragment. Transférez un millilitre d’agarose à trois pour cent dans du DPBS à la surface d’une boîte de Pétri vide.

En tenant le tube capillaire dans l’aiguille introduite, placez une extrémité du tube en contact avec le bassin d’agarose liquide pour le remplir par capillarité. Lorsque le liquide cesse de monter, retirez le tube capillaire de la piscine et placez-le horizontalement sur la surface d’une boîte de Pétri. Ensuite, placez le pouce et l’index de chaque côté du tube et saisissez fermement.

Utilisez l’autre main pour retirer rapidement l’aiguille tandis que le pouce et l’index empêchent la micro-colonne elle-même de glisser hors du tube. Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 dans le tube capillaire pour pousser lentement la micro-colonne dans une boîte contenant du DPBS. Transférez soigneusement une micro-colonne de DPBS dans une parabole vide à l’aide d’une pince fine.

Ajoutez 10 microlitres de DPBS en haut de la micro-colonne à l’aide d’une micropipette pour éviter le dessèchement. Pendant que vous travaillez sous un stéréomicroscope, faites tripper la micro-colonne avec un micro-scalpel pour la raccourcir à la longueur souhaitée. Ensuite, à l’aide d’une pince fine, transférez la micro-colonne coupée dans une autre boîte de Pétri contenant du DBPS.

Stérilisez les micro-colonnes dans les boîtes de Pétri contenant du DPBS sous une lumière ultraviolette pendant 30 minutes. À l’aide d’un foret, percez 16 trous en tant que réseau 4 par 4 de 4 centimètres avec une séparation de 1 centimètre dans le couvercle d’une boîte de Pétri de 10 centimètres. À l’intérieur d’une hotte chimique, utilisez la partie inférieure d’une boîte de Pétri pour peser 27 grammes de PDMS et trois grammes d’agent de durcissement.

Remuez à l’aide d’une micro spatule pour répartir uniformément l’agent. Couvrez ensuite l’agent de durcissement PDMS avec le couvercle perforé. Connectez une extrémité d’un tuyau à l’orifice d’aspiration de la hotte et insérez l’autre extrémité dans la tige d’un entonnoir de taille appropriée.

Placez une poire de pipette de 1 millilitre sur un embout de 1 millilitre dans le tuyau et tirez le tuyau vers le haut jusqu’à ce que l’ampoule scelle le tuyau dans la tige de l’entonnoir. Ensuite, placez l’entonnoir sur le couvercle de la vaisselle perforé et fixez le tuyau avec un support solide disponible. Ouvrez la soupape de dépression pendant cinq minutes pour aspirer et ramener les bulles d’air à la surface.

Au bout de cinq minutes, fermez la vanne, retirez l’entonnoir et frappez la boîte de Pétri contre la surface de la hotte à quelques reprises pour faire éclater les bulles d’air restantes. Placez un moule pyramidal imprimé en 3D dans chacun des puits dans une plaque de culture à 12 puits avec les pyramides pointant vers le haut. Versez ensuite l’agent de durcissement PDMS sur le dessus des moules jusqu’à ce que chaque puits de la plaque soit rempli.

Transférez la plaque couverte dans un four pendant une heure à 60 degrés Celsius pour sécher. Après avoir stérilisé les réseaux PDMS par autoclave et travaillé dans une enceinte de biosécurité, insérez un réseau de micro-puits dans chaque puits d’une plaque stérile à 12 puits. Pour former les agrégats neuronaux, utilisez une micropipette pour ajouter 12 microlitres de suspension cellulaire dans chaque micro-puits du réseau PDMS.

Centrifuger la plaque à 200 fois g pendant cinq minutes pour forcer l’agrégation des cellules au fond des micro-puits. Ensuite, ajoutez soigneusement environ deux millilitres de milieu de culture au sommet de chaque réseau PDMS pour couvrir tous les micropuits ensemencés. Incuber la plaque pendant 12 à 24 heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Pour commencer la fabrication du noyau CEM, mélangez du collagène de type 1, de la laminine et du milieu de culture dans un microtube à centrifuger et ajustez le pH à 7,2 à 7,4. Placez ensuite le tube contenant le CEM sur de la glace. À l’aide d’une pince stérile, transférez les micro-colonnes dans des boîtes de Pétri vides de 35 ou 60 millimètres.

Ensuite, tout en travaillant sous un stéréomicroscope, utilisez une pointe de 10 microlitres attachée à une pointe de 1000 microlitres pour extraire les DPBS résiduels et les bulles d’air de la lumière. Prélevez rapidement quatre à cinq microlitres de CEM dans une micropipette, puis placez la pointe de la micropipette à une extrémité d’une micro-colonne et déchargez suffisamment de CEM pour remplir la lumière. Pour éviter la déshydratation, ajoutez deux microlitres de CEM autour de chaque micro-colonne.

Incuber les micro-colonnes d’hydrogel CEM dans des boîtes de Pétri à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant 15 minutes. Procéder à l’ensemencement cellulaire immédiatement après l’incubation. Transférez environ 10 à 20 microlitres de milieu de culture dans deux zones libres dans les boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes.

À l’aide d’une micropipette, on recueille les agrégats neuronaux individuellement et on les transfère dans la boîte de Pétri contenant les constructions. Déplacez les agrégats à l’aide d’une pince dans l’un des petits bassins de milieu de culture pour préserver la santé cellulaire. Lors de l’observation au stéréomicroscope, utilisez une pince pour insérer un agrégat à une extrémité des micro-colonnes pour les micro-TENN unidirectionnels, ou à chaque extrémité pour une architecture bidirectionnelle.

Déplacez ensuite la micro-colonne ensemencée vers l’autre petit bassin de milieu de culture pour éviter la déshydratation et préserver la santé globale. Lorsque toutes les micro-colonnes ont été chargées, incuber à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant 45 minutes pour permettre aux agrégats d’adhérer au CEM. Après l’incubation, vérifiez que les agrégats restent aux extrémités des micro-colonnes à l’aide du stéréomicroscope.

Enfin, inondez soigneusement les boîtes de Pétri contenant les micro-TENN avec du milieu de culture à l’aide d’une pipette. Placez les plats dans un incubateur à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pour une culture à long terme. Ces images en contraste de phase montrent des micro-TENN unidirectionnels de 2 millilitres de long jusqu’à huit jours in vitro.

Sur ces images, remarquez les agrégats neuronaux aux extrémités de la micro-colonne tandis que les voies axonales alignées se projettent à travers la lumière. Comme on le voit ici, les voies axonales s’étendent sur presque toute la longueur de la micro-colonne pendant cinq jours in vitro. Pour les micro-TENN bidirectionnels de 5 millimètres, les voies axonales peuplent la longueur de la micro-colonne à 5 jours in-vitro, et cette architecture est maintenue au moins jusqu’à 10 jours in-vitro.

Les deux images suivantes peuvent vous aider à résoudre les problèmes liés à la procédure. Cette image montre une micro-colonne d’hydrogel séchée complètement déshydratée à la suite de l’élimination et/ou de l’évaporation complète du DPBS, du CEM ou du milieu de culture pendant la fabrication. Cette image montre une micro-colonne avec la lumière tapissant la paroi externe en raison du manque d’alignement concentrique de l’aiguille d’acupuncture avec le tube capillaire.

Enfin, cette image confocale montre un micro-TENN bidirectionnel à 28 jours in-vitro, coloré pour les noyaux cellulaires avec Hoechst en bleu, et avec les axones marqués avec tudge un en rouge, et les boutons pré-synaptiques marqués avec synapsine 1 en vert. La migration cellulaire à partir des agrégats le long des voies axonales est observée en présence de terminaisons pré-synaptiques, comme suggéré. Les Micro-TENN sont des constructions autonomes, d’inspiration anatomique, qui imitent des aspects clés de la cytoarchitecture du connectome ; par conséquent, les micro-TENN peuvent fournir un moyen de remplacer les voies neuronales perdues lors de l’implantation dans le cerveau.

Les composants cruciaux de cette méthode comprennent le schéma d’enrobage de biomatériau tubulaire, qui permet une croissance axonale longitudinale, et la méthode d’agrégation, qui garantit l’obtention de la cytoarchitecture correcte des corps cellulaires limités aux extrémités des voies axonales le long de l’intérieur. Suite à la maîtrise de ces méthodes, les principes de cette technique peuvent être appliqués pour construire des micro-TENN avec d’autres phénotypes cellulaires et composants de biomatériaux, en fonction de l’application spécifique.