Réseaux de neurones conçus par micro-tissus tridimensionnels inspirés anatomiquement pour la reconstruction, la modulation et la modélisation du système nerveux

Ce protocole décrit la fabrication de réseaux neuronaux miniaturisés conçus par ingénierie tissulaire, ou micro-TENNs, qui sont des constructions tridimensionnelles miniatures composées de longs faisceaux d'axones alignés reliant des populations neuronales distinctes à l'intérieur de la lumière d'un hydrogel tubulaire. Les micro-TENNs reproduisent l'anatomie de type systémique du connectome cérébral, plus précisément des groupes fonctionnellement similaires de neurones reliés par de longs faisceaux axonaux. Étant donné qu'elles sont pré-cultivées pour imiter la cytoarchitecture des voies cérébrales, les micro-TENNs peuvent être utilisées pour la reconstruction ciblée des circuits neuronaux perdus suite à un traumatisme ou à une maladie neurodégénérative, ainsi que comme modèles biofidèles pour des études neurobiologiques.

Un des aspects les plus difficiles de ce protocole consiste à manipuler un format de l'ordre du micron, ce qui est finalement nécessaire pour permettre une administration minimement invasive dans le cerveau. Commencez par casser manuellement des tubes capillaires en verre en fragments de 2 à 2,5 centimètres, puis insérez une aiguille d'acupuncture dans chaque fragment. Transférez un millilitre d'agarose à trois pour cent dans du DPBS à la surface d'une boîte de Pétri vide.

En tenant le tube capillaire dans l'aiguille introduite, placer une extrémité du tube en contact avec la flaque d'agarose liquide pour le remplir par action capillaire. Lorsque le liquide cesse de monter, retirer le tube capillaire de la flaque et le placer horizontalement à la surface d'une boîte de Pétri. Ensuite, placer le pouce et l'index de chaque côté du tube et serrer fermement.

Utilisez l'autre main pour retirer rapidement l'aiguille tout en empêchant, à l'aide du pouce et de l'index, que la micro-colonne elle-même ne glisse hors du tube. Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 dans le tube capillaire pour pousser lentement la micro-colonne dans une boîte contenant du DPBS. Transférez soigneusement une micro-colonne du DPBS vers une boîte vide à l'aide de pinces fines.

Ajouter 10 microlitres de DPBS au sommet de la micro-colonne à l’aide d’une micropipette afin d’éviter tout dessèchement. Sous un stéréomicroscope, sectionner la micro-colonne à l’aide d’un micro-scalpel pour la raccourcir à la longueur souhaitée. Puis, utiliser une pince fine pour transférer la micro-colonne taillée vers une autre boîte de Pétri contenant du DPBS.

Stériliser les micro-colonnes dans les boîtes de Pétri contenant du DPBS sous une lumière ultraviolette pendant 30 minutes. Utiliser une mèche de perceuse pour percer 16 trous formant une matrice de 4 sur 4 de 4 centimètres avec un espacement de 1 centimètre sur le couvercle d'une boîte de Pétri de 10 centimètres. À l'intérieur d'une hotte chimique, utiliser la partie inférieure d'une boîte de Pétri pour peser 27 grammes de PDMS et 3 grammes d'agent de réticulation.

Agiter avec une spatule micro pour répartir le réactif uniformément. Ensuite, couvrir le réactif de durcissement du PDMS avec le couvercle perforé. Connecter une extrémité d'un tuyau au port sous vide de la hotte aspirante, et insérer l'autre extrémité dans la tige d'une ampoule de taille appropriée.

Placez une poire de pipette de 1 millilitre avec une pointe de 1 millilitre dans le tuyau, puis tirez le tuyau vers le haut jusqu'à ce que la poire scelle le tuyau dans la tige de l'entonnoir. Ensuite, placez l'entonnoir sur le couvercle de boîte perforé et fixez le tuyau à l'aide d'un support solide disponible. Ouvrez la vanne à vide pendant cinq minutes afin d'aspirer et de faire remonter les bulles d'air à la surface.

Après cinq minutes, fermez le robinet, retirez l'entonnoir et tapez légèrement la boîte de Pétri contre la surface de la hotte aspirante plusieurs fois pour faire éclater les bulles d'air restantes. Placez un moule 3D imprimé à puits pyramidaux dans chacun des puits d'une plaque de culture 12 puits, les pyramides orientées vers le haut. Ensuite, versez l'agent de réticulation du PDMS sur les moules jusqu'à ce que chaque puits de la plaque soit rempli.

Transférez la plaque couverte dans un four pendant une heure à 60 degrés Celsius pour la sécher. Après avoir stérilisé les réseaux de PDMS par autoclavage et en travaillant dans une hotte de sécurité, insérez un réseau de micropuits dans chaque puits d'une plaque stérile de 12 puits. Pour former les agrégats neuronaux, utilisez une micropipette pour ajouter 12 microlitres de suspension cellulaire dans chaque micropuit du réseau de PDMS.

Centrifuger la plaque à 200 × g pendant cinq minutes afin de forcer l'agrégation des cellules au fond des micropuits. Ensuite, ajouter soigneusement environ deux millilitres de milieu de culture sur la partie supérieure de chaque réseau PDMS pour recouvrir tous les micropuits ensemencés. Incuber la plaque pendant 12 à 24 heures à 37 °C en présence de 5 % de dioxyde de carbone.

Pour commencer la fabrication du noyau de MEC, mélanger le collagène de type 1, la laminine et le milieu de culture dans un tube de microcentrifugeuse et ajuster le pH à 7,2-7,4. Ensuite, placer le tube contenant la MEC sur de la glace. Utiliser des pinces stériles pour transférer les microcolonnes dans des boîtes de Pétri vides de 35 ou 60 millimètres.

Ensuite, tout en travaillant sous un microscope stéréo, utilisez une pointe de 10 microlitres fixée à une micropipette de 1000 microlitres pour extraire le DPBS résiduel et les bulles d'air de la lumière. Aspirez rapidement quatre à cinq microlitres de CEM avec une micropipette, puis placez la pointe de la micropipette à une extrémité d'une microcolonne et expulsez suffisamment de CEM pour remplir la lumière. Pour éviter la déshydratation, ajoutez deux microlitres de CEM autour de chaque microcolonne.

Incuber les micro-colonnes de l'hydrogel CEM dans des boîtes de Pétri à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone pendant 15 minutes. Passer immédiatement au semis cellulaire après l'incubation. Transférer environ de 10 à 20 microlitres de milieu de culture vers deux zones libres des boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes.

Utilisez une micropipette pour prélever individuellement les agrégats neuronaux et transférez-les dans la boîte de Pétri contenant les constructions. Déplacez les agrégats à l’aide de forceps vers l’un des petits réservoirs de milieu de culture afin de préserver la viabilité cellulaire. En observant au microscope stéréoscopique, utilisez les forceps pour insérer un agrégat à une extrémité des micro-colonnes dans le cas de micro-TENNs unidirectionnels, ou à chaque extrémité pour une architecture bidirectionnelle.

Ensuite, déplacer la micro-colonne ensemencée vers l'autre petite flaque de milieu de culture afin d'éviter la déshydratation et de préserver la viabilité des agrégats. Une fois que toutes les micro-colonnes ont été chargées, incuber à 37 degrés Celsius dans un atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant 45 minutes pour permettre aux agrégats d'adhérer au MEC. Après l'incubation, vérifier que les agrégats sont toujours situés aux extrémités des micro-colonnes à l'aide du stéréomicroscope.

Enfin, inondez soigneusement les boîtes de Pétri contenant les micro-TENNs avec du milieu de culture à l’aide d’une pipette. Placez les boîtes dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour une culture à long terme. Ces images en contraste de phase montrent des micro-TENNs de 2 millilitres de long dans un sens unique, conservés jusqu’à huit jours in vitro.

Dans ces images, observez les agrégats neuronaux aux extrémités de la micro-colonne, tandis que les faisceaux axonaux alignés s'étendent à travers la lumière. Comme on le voit ici, les faisceaux axonaux s'étendent sur presque toute la longueur de la micro-colonne après cinq jours in vitro. Pour les micro-TENNs bidirectionnels de 5 millimètres, les faisceaux axonaux occupent toute la longueur de la micro-colonne au bout de 5 jours in vitro, et cette architecture est maintenue au moins jusqu'à 10 jours in vitro.

Les deux images suivantes peuvent aider à résoudre les problèmes liés à la procédure. Cette image montre une microcolonne d'hydrogel séchée complètement déshydratée, résultant de l'élimination totale et/ou de l'évaporation du DPBS, du CEM ou du milieu de culture pendant la fabrication. Cette image montre une microcolonne dont la lumière épouse la paroi externe en raison d'un alignement non concentrique de l'aiguille d'acupuncture avec le tube capillaire.

Enfin, cette image confocale montre un micro-TENN bidirectionnel à 28 jours en culture, coloré pour les noyaux cellulaires avec l’Hoechst en bleu, les axones marqués avec la tudge one en rouge, et les boutons pré-synaptiques marqués avec la synapsine 1 en vert. On observe une migration cellulaire à partir des agrégats le long des faisceaux axonaux en présence de terminaisons pré-synaptiques, comme suggéré. Les micro-TENNs sont des constructions autonomes inspirées de l’anatomie qui imitent des aspects clés de la cytoarchitecture du connectome ; par conséquent, les micro-TENNs pourraient offrir un moyen de remplacer les voies neuronales perdues après implantation dans le cerveau.

Les composants essentiels de cette méthode incluent le système d'encapsulation dans un biomatériau tubulaire, qui permet une croissance axonale longitudinale, et la méthode par agrégation, qui garantit l'obtention d'une cytoarchitecture adéquate des corps cellulaires, limités aux extrémités des faisceaux axonaux à l'intérieur du tube. Une fois ces méthodes maîtrisées, les principes de cette technique peuvent être appliqués pour construire des micro-TENNs avec d'autres phénotypes cellulaires et composants biomatériaux, selon l'application spécifique.