توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل حركية النمط الظاهري لتوليد وأعداد الخلايا التائية الناتجة عن طلائع الاستيطان التيموسي في اليوم الجنيني E 13 أو E 18. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الفصوص التيموسية من أجنة الفئران في الأيام الجنينية E 13 وE 14 وE 18. وفي الخطوة الثانية، يتم تعريض الفصوص التيموسية في اليوم E 14 للإشعاع، ثم استعمارها بخلايا E 13 أو E 18 مفروزة بواسطة قياس التدفق الخلوي لمدة 48 ساعة في قطرة معلقة.

في الخطوة النهائية، يتم تطعيم الفصوص المستعمرة تحت كبسولة الكلية لفئران CD knockout البالغة. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم وجود نسل السلائف التيموسية المستقرة من E 13 و E 18 في دم الحيوانات الخيمرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقنا الحالية، مثل زراعة الخلايا التائية في المختبر على خلايا ine so، في أن هذه التقنية تجمع بين الأساليب التي تسمح بنضوج الخلايا التائية الكامل من سلائف محددة في مقايسة ثلاثية الأبعاد مع تطعيم مزارع أعضاء التيموس في فئران مستقبلة سليمة، مما يسمح بتقييم تمايز ووظيفة سلائف شرائح التيموس ونسلها.

بصفتي مهندساً بحثياً خبيراً في جراحة القوارض، سأقوم باستعراض الإجراء التالي: قبل يومين من تجربة التطعيم، وفي غطاء تدفق صفائحي، يتم تعقيم بطن أنثى فأر حامل باستخدام 70%ethanol، ثم يتم إجراء شق طولي في الجلد عند الخط الناصف، وتُباعد حواف الجلد لفتح الشق، ثم تُستخدم الملاقط والمقص لفتح البريتون دون لمس الجهاز الهضمي. بعد ذلك، يتم سحب الرحم متشعب الفصوص واستخدام المقص لفصله عن المهبل. ثم يوضع الرحم في طبق بتري مقاس 90 × 15 مليمتر يحتوي على 40 إلى 50 مليلتر من DPBS، ويُقطع عرضياً بين السفاق من كل جنين.

استخدم مقصًا دقيق السن وملقطًا دقيقًا لإزالة الغشاء العضلي للرحم، مع القص بين المشيمة والكيس المحي لإخراج كل جنين. بعد ذلك، قم بإزالة الغشاء السلوي مع الاحتفاظ بالأجنة، وضع الأجنة في طبق بتري جديد يحتوي على HBSS بالإضافة إلى 1%FCS. لعزل الغدة الزعترية، ضع الأجنة واحدًا تلو الآخر في وضع الاستلقاء تحت عدسة مكبرة ثنائية العيون.

بعد ذلك، أدخل ملقطاً بشكل طولي على طول غضروف عظم القص، ثم اضغط وافتح القفص الصدري باستخدام ملقط منحني. اسحب جدار الصدر جانباً لرؤية فصوص الغدة الزعترية على كل جانب من القصبة الهوائية. ثم اضغط أسفل الغدة الزعترية باستخدام ملقط دقيق لإزالة كل فص بعناية ووضعهما في طبق بتري يحتوي على 1 mL من HBSS بالإضافة إلى 1% FCS.

بعد ذلك، استخدم ملقطين دقيقين لإزالة النسيج الضام المحيط دون إتلاف الفصوص. ثم اغسل الفصوص في 3 mL من محلول HBSS مضافاً إليه 1% FCS للتخلص من خلايا الدم الحمراء لبدء استنبات أعضاء التيموس الجنينية. فصوص التيموس من الأجنة في اليوم E 14 والمعزولة من أجنة CD 45.2 كما تم توضيحه للتو.

اترك الفصوص لترتاح لمدة ثلاث ساعات تقريبًا. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا السلفية التيموسية المفرزة حديثاً من الأجنة في المرحلة E 13 أو E 18 مركزياً. أعد تعليق الراسب في وسط زراعي بتركيز نهائي قدره 500 cells لكل 35 µL من الوسط.

بعد ذلك، ضع قطرة بحجم 35 µL من معلق الخلايا في كل بئر متبادل من طبق Terasaki المكون من 60 بئراً، وضع فصاً واحداً مشعاً على سطح كل قطرة. أغلق الطبق واقلبه رأساً على عقب للسماح للخلايا بالوصول إلى القطب القمي للقطرة بفعل الجاذبية، مع النقر برفق على الجانب العلوي للطبق المقلوب لإجبار الفصوص على الانزلاق إلى الحافة القمية للقطرة. ثم حضّن الطبق المقلوب في حضانة رطبة لمدة 48 ساعة عند 37 °C و5% carbon dioxide.

بعد استعمار الفصوص الزعترية، تحقق من مستوى تخدير الحيوان المستقبل من خلال غياب الاستجابة المنعكسة. ثم ضع قطرة من مرهم العين على كل عين وضع الفأر على جانبه الأيمن تحت غطاء تدفق صفائحي. بعد ذلك، قم بحلاقة المنطقة الجراحية فوق مفصل الساق الخلفية مباشرة.

بعد ذلك، ارتدِ زوجاً من القفازات المعقمة وعقم المجال الجراحي باستخدام 70% ethanol ومحلول 10% IOD DY DER. استخدم مشرطاً لإجراء شق بطول 1.5 centimeter عبر الأنسجة الجلدية، يليه شق عبر الأنسجة العضلية. الآن، طبق ضغطاً خفيفاً على جانبي الشق لدفع الكلية خارج التجويف البطني وحافظ على رطوبة الكلية باستخدام محلول ملحي.

ثبّت الكلية باستخدام مسحة قطنية خارج التجويف خلف البريتوني، واستخدم ملقطين دقيقين لعمل ثقب بحجم اثنين إلى ثلاثة مليمتر في المحفظة. ثم، مع إبقاء جدار المحفظة مفتوحاً، قم بتمرير ما يصل إلى ست طعوم من الفص الزعتري بحذر نحو حافة قطب الكلية، ثم أعد الكلية إلى التجويف خلف البريتوني. قم بخياطة العضلات بغرزة متصلة، تليها خياطة الجلد باستخدام عقد جراحية منفردة.

بعد ذلك، قم بترطيب الجرح بمحلول بوفيدون يود بتركيز 10%، وضع الفأر على وسادة تدفئة بدرجة حرارة 37 degree Celsius، مع مراقبة الحيوان والجرح الجراحي حتى يتم التعافي الكامل لكليهما لتحديد أفضل طريقة لاستنفاد الخلايا التيموسية الداخلية من أجل تطوير السلف المستعمر. في هذه التجربة، تمت مقارنة مستويات إعادة تشكيل الخلايا التائية في فص تيموسي مستعمر بعد التعرض للإشعاع أو العلاج بالديوكسي غوانوزين لمدة خمسة أيام. وبينما لم يظهر أي فرق في عدد الخلايا اللمفاوية المستعمرة في اليوم التاسع من الزرع، احتوت الفصوص المشععة على خلايا تائية أكثر من تلك المعالجة بالديوكسي غوانوزين في اليوم 12، مما يجعل الإشعاع العلاج المفضل لتسهيل تطور الخلايا التائية بعد استعمار التيموس. ولدراسة القدرة التطويرية لسلف الاستيطان التيموسي في مراحل E 13 وE 18 هنا، تم استعمار فصوص تيموسية مشععة في مرحلة E 14 بعدد متساوٍ من نوعي السلف، وكما لوحظ، أنتج سلف الاستيطان التيموسي في مرحلة E 13 عدداً أقل من الخلايا التيموسية والخلايا التائية مزدوجة الإيجابية مقارنة بسلف الاستيطان التيموسي في مرحلة E 18.

ومع ذلك، زاد تردد الخلايا الناضجة الموجبة لـ CD three، وتم الكشف عن إنتاج الخلايا التائية الظهارية التغصنية فقط في نسل السلائف المستوطنة في التيموس عند المرحلة E 13. ولتحليل القدرة الحيوية (in vivo) للسلائف المستوطنة في التيموس عند المرحلتين E 13 و E 18، تم تطعيم فصوص تيموس مستعمرة بكل نوع من السلائف تحت محفظة الكلية لمستقبلين يعانيان من تعطيل جين CD three (CD three knockout). وكما تم توضيحه للتو، وكما كان متوقعاً، أنتجت السلائف المستوطنة في التيموس عند المرحلة E 13 خلايا تائية بشكل أسرع من سلائف المرحلة E 18، رغم أن عدد الخلايا التائية الدوارة كان أقل بشكل ملحوظ في الحيوانات المستعمرة بسلائف التيموس المستوطنة عند المرحلة E 13 بشكل عام. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة التطورية لاستكشاف خصائص المجموعات الفرعية للخلايا التائية، والتي ينحدر بعضها من أصل جنيني بحت في نموذج ثديي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تتبع المسارات التفاضلية والوظيفية لأسلاف الخلايا المترسبة من نوع Timex ونسلها، سواء في بيئة طبيعية أو في ظروف تنافسية.