Visualisation immunohistochimique de l'hippocampe Neuron Activité Après l'apprentissage spatial dans un modèle de souris de troubles neurodéveloppementaux

Nous décrivons un protocole d'immunohistochimie pour étudier le profil d'activation des neurones de l'hippocampe après exposition à une tâche spatiale d'apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d'origine neurologique du développement. Ce protocole peut être appliqué sur les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisée par des déficits cognitifs.

L’objectif global de l’expérience suivante est de détecter les changements dans la phosphorylation de l’irk de l’hippocampe après apprentissage spatial chez deux souris knock-out Grail comme modèle de troubles neurodéveloppementaux. Ceci est réalisé en testant d’abord à la fois le type sauvage et en graal deux souris knock-out dans le labyrinthe d’eau Morris. Dans un deuxième temps, le cerveau des souris est retiré et des tranches de souris de type sauvage et knock-out sont préparées par bouturage viome.

Ensuite, des tranches de cerveau de souris de type sauvage et knock-out sont traitées pour l’immunohistochimie et utilisées pour détecter les changements de phosphorylation dans l’hippocampe. Les résultats montrent des différences dans la phosphorylation de la RC de l’hippocampe entre le type sauvage et chez deux souris knock-out basées sur la visualisation par microscopie optique de la coloration immunohistochimique. Cette méthode permet d’identifier des sous-ensembles spécifiques de neurones de l’hippocampe qui sont activés à la suite d’une tâche d’apprentissage spéciale dépendante de l’hippocampe, telle que le labyrinthe d’eau de Maurice.

Nous avons d’abord ajouté l’idée de cette méthode lorsque nous avons décidé d’étudier la cascade moléculaire qui souligne le déficit moléculaire chez les souris knock-out de grade deux, un modèle murin pour les troubles du spectre autistique. Pour commencer, entraînez des souris de divers horizons d’intérêt dans une tâche d’apprentissage spatial telle que le Morris Water Mae. Suivez le régime d’entraînement tel que décrit dans le protocole textuel d’accompagnement à la fin de la période d’entraînement, euthanasiez les souris, puis réparez et retirez leur cerveau.

Lorsque vous êtes prêt à poursuivre la procédure, utilisez un scalpel pour retirer le cervelet. Ensuite, super-collez le reste du cerveau à la verticale sur la plaque de support du vibrato. Coupez le cerveau en sections en série de 20 à 40 microns d’épaisseur dans tout l’hippocampe dorsal.

Transférez chaque tranche dans un puits d’une plaque de 24 puits remplie d’un millilitre de PBS de 0,1 molaire, transférez trois à cinq sections dorsales de l’hippocampe pour chaque souris dans les puits d’une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de PBS de 0,1 molaire pour chacune. Bien laver les sections contenues dans chaque puits avec 500 microlitres de PBS 0,1 molaire, effectuer tous les lavages et incubations à température ambiante avec une agitation douce, sauf indication contraire. Sous une hotte, incubez les sections dans 40 % de méthanol, 1 % de peroxyde d’hydrogène dans 0,1 molaire de PBS pendant 20 minutes afin de réduire l’activité endogène de la peroxydase.

Après trois autres lavages dans 0,1 molaire de PBS perme les sections en les incubant dans 500 microlitres de Triton X 100 à 0,2 % pendant cinq minutes pendant que les sections sont en incubation, préparez suffisamment de tampon de blocage pour l’ensemble de l’expérience. Retirez ensuite la solution perméable et ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage à chacun. Bien incuber les sections pendant une heure.

Ensuite, retirez le tampon bloquant et couvrez les sections avec de la kinase régulée extracellulaire phosphorylée. Anticorps primaire dilué de un à 500 dans un tampon de blocage. Incuber les sections pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une légère agitation le lendemain après avoir lavé les sections trois fois dans du PBS 0,1 molaire pendant cinq minutes.

Chacun incube les sections avec un anticorps secondaire conjugué à la biotine dilué de un à 250 dans un tampon de blocage pendant une heure à température ambiante pendant l’incubation. Préparez le réactif A BC au moins 30 minutes avant utilisation afin de laisser suffisamment de temps pour que le complexe Aden et biotine se forme. Après avoir lavé les sections trois fois de plus avec du PBS 0,1 molaire, ajoutez le réactif A, b, C et laissez-le incuber avec l’échantillon pendant 45 minutes.

Au cours de la prochaine série de trois lavages dans PBS, préparez la solution de travail DAB dans la hotte selon les spécifications du fabricant, aliquote la solution de travail DAB dans la plaque. Transférez ensuite les sections dans les puits contenant la solution de travail DAB et faites tourner lentement la plaque pour permettre une exposition maximale des sections à la solution. Surveillez la réaction DAB au microscope jusqu’à ce qu’un signal adéquat se développe.

Au bout de deux à cinq minutes environ, arrêtez la réaction à l’intensité de couleur souhaitée en lavant le tissu dans du PBS à 0,1 molaire. Après trois autres lavages en PBS, montez les sections sur des lames enduites de gélatine et séchez-les à température ambiante pendant au moins trois à quatre heures. Une fois séchées à l’air, transférez les lames dans la hotte et déshydratez les sections en les plaçant séquentiellement dans des solutions d’éthanol intégrées pendant deux minutes chacune, puis nettoyez les lames dans du xylène à 100 % pendant cinq minutes.

Couvrez et glissez les lames à l’aide d’un support de montage et laissez-les dans la hotte pendant la nuit pour qu’elles sèchent, transférez les lames sur un microscope à fond clair, équipé d’une caméra et d’un objectif 20x. Acquérez plusieurs images en fond clair de chaque section à un grossissement de 200 x couvrant l’image de l’hippocampe dorsal. Trois à cinq sections de chaque animal.

Voici des coupes des régions dorsales de l’hippopotame d’une souris de type sauvage et d’une souris Graale à deux knock-out colorée pour phosphorylée. L’extracellulaire a régulé une lecture moléculaire fiable de l’activation neuronale dépendante de l’apprentissage. Ces deux souris avaient subi un régime classique de tâches d’apprentissage spatial dépendant de l’hippocampe, le labyrinthe d’eau de Morris avant le sacrifice.

Le dernier jour des tests, les souris Grailed two knockout ont montré un déficit d’apprentissage spatial significatif par rapport aux souris de type sauvage. Pour analyser les coupes de cerveau des souris, le nombre total de cellules positives a été compté dans les différentes régions de l’hippocampe. Dans la couche à trois paramètres CA, les souris de type sauvage avaient significativement plus de cellules RK positives phosphorylées par zone que chez les souris knock-out.

Des résultats opposés ont été trouvés dans la couche cellulaire hili et granulaire ou GCL. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la formulation de phos sur des tranches de cerveau de l’hippocampe de modèles murins génétiques et pharmacologiques de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits cognitifs. Cette technique peut également être utilisée pour étudier les changements de formulation de la force irk dans d’autres zones du cerveau, ainsi que pour suivre des tâches cognitivo-comportementales différentes du labyrinthe d’eau de Maurice.

N’oubliez pas que travailler avec de la benzine DIA peut être extrêmement déserteur et que des précautions, telles que le port de protections appropriées, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.