Coloration par immunofluorescence pour la visualisation de cellules souches neurales proliférées dans des sections de cerveau de souris

Prenez des sections fixes de cerveau de souris contenant des cellules neurales, y compris des cellules souches neurales proliférantes étiquetées avec EdU, un analogue de la thymidine.

Délimitez les sections avec un marquage hydrophobe pour éviter l’étalement de la solution.

Ajoutez un détergent pour perméabiliser le tissu. Laver pour enlever l’excès de détergent.

Ajouter un fluorophore pour étiqueter l’EdU. Retirez les fluorophores en excès.

À l’aide d’un microscope à fluorescence, confirmez la coloration correcte des cellules marquées à l’EdU.

Appliquez un tampon bloquant contenant des protéines pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques. Retirez l’excès de protéines.

Incuber avec des anticorps primaires qui se lient à des protéines spécifiques dans les cellules souches neurales. Retirez les anticorps non liés.

Ajoutez des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores pour lier les anticorps primaires. Lavez les anticorps non liés.

Teindre les noyaux avec un colorant et enlever l’excédent de colorant.

Retirez le marquage hydrophobe, appliquez le support de montage et placez une lamelle.

À l’aide d’un microscope confocal, observez les coupes pour visualiser les cellules souches neurales marquées.

Pour colorer les coupes de tissu avec un analogue de thymidine, retirez les sections de tissu du tampon de citrate. Laissez les sections de tissu sécher et adhérer complètement aux lames avant de dessiner une bordure avec un stylo hydrophobe. Ensuite, perméabilisez les sections avec un tampon de perméabilisation pendant 20 à 30 minutes. Lavez les sections deux fois à l’aide de TBS Triton pendant 5 minutes à chaque fois. Ensuite, préparez une solution de réaction EdU.

Incuber les sections dans la solution réactionnelle EdU pendant 30 minutes à une heure. Par la suite, lavez-les trois fois dans du TBS Triton pendant 5 minutes à chaque fois. À ce stade, vérifiez si la réaction EdU fonctionne à l’aide d’un microscope fluorescent. Les cellules marquées à l’EdU doivent être observées si la réaction fonctionne. Maintenant, bloquez les sections de tissu montées à l’aide d’un tampon de blocage élevé chez le même animal que l’anticorps secondaire pendant 30 minutes à une heure. Ensuite, lavez-les deux fois dans du TBS Triton pendant 5 minutes à chaque fois.

Pendant l’étape de blocage, préparez la solution d’anticorps primaires en mélangeant l’anticorps primaire dans le tampon de blocage. Par la suite, ajoutez 250 microlitres de solution d’anticorps primaires par lame pour vous assurer que les sections de tissu sont complètement immergées, et incubez-les pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, lavez les coupes de tissu trois fois dans du TBS Triton pendant 5 minutes chacune pour éliminer l’excès d’anticorps primaires.

Ensuite, incubez les sections de tissu dans un anticorps secondaire conjugué au fluorophore préparé dans une solution tampon bloquante pendant deux heures à température ambiante. Lavez les sections de tissu trois fois dans du TBS Triton pendant 5 minutes chacune pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires. Ensuite, appliquez une solution de DAPI de 300 micromolaires à raison de 1 à 100 dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les sections de tissu trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune pour éliminer l’excès de DAPI, et retirez le cercle du stylo PAP autour du tissu à l’aide d’un coton-tige. Laissez sécher les sections avant d’appliquer le support de montage et de les recouvrir de lamelles.