Test de criblage enzymatique à base d’hydrogel de polymère chromogène : une méthode à haut débit pour cribler les enzymes actives en glucides à l’aide de substrats synthétiques

Les enzymes dégradant les glucides décomposent les polysaccharides complexes en oligosaccharides plus petits.

Pour dépister l’activité de dégradation enzymatique, commencez par prendre plusieurs hydrogels de polymères chromogènes, CPH, qui sont préparés en colorant des polysaccharides avec des colorants chlorotriazines de différentes couleurs. Chaque polysaccharide est ensuite réticulé chimiquement pour former de l’hydrogel - un substrat synthétique pour la dégradation enzymatique.

Maintenant, distribuez différents substrats CPH dans des puits distincts d’une plaque de réaction poreuse. Ajoutez une solution d’activation et incubez-la pour assurer une activation optimale des substrats.

Placez la plaque de dosage sur une plaque de produit vide. Centrifugez les plaques ensemble à basse vitesse pour faciliter l’élimination efficace de la solution d’activation à travers les pores de la plaque réactionnelle.

Ensuite, complétez tous les puits de la plaque réactionnelle avec le même type d’enzyme dégradant les glucides dans un tampon approprié qui maintient un pH optimal pour l’activité enzymatique. Scellez la plaque et incubez-la avec une légère agitation pour permettre une distribution uniforme des enzymes dans le réseau polymère, leur permettant d’accéder au substrat.

Au cours de l’incubation, l’enzyme, avec une activité appropriée contre le substrat, dégrade les polysaccharides dans le CPH pour produire des oligosaccharides liés à des colorants plus petits. Ces produits sont solubles, ce qui rend la solution colorée. Faites tourner les plaques pour recueillir la solution colorée dans la plaque de produit.

Spectrophotométriquement, déterminer l’absorbance du produit pour mesurer l’activité enzymatique.

Pour commencer, activez la plaque du kit de dosage du filtre à 96 puits en ajoutant 200 microlitres de solution d’activation à chaque puits. Incuber à température ambiante sans agitation pendant 10 minutes.

Utilisez une centrifugeuse et n’importe quelle plaque standard à 96 puits pour la collecte afin de faire tourner la solution d’activation existante. Ajoutez 100 microlitres d’eau stérile dans l’hydrogel polymère chromogène, ou substrats CPH, et appliquez un vide ou une rotation pour retirer le stabilisant. Répétez le lavage deux fois de plus.

Pour préparer la réaction enzymatique, ajoutez 150 microlitres de tampon d’acétate de sodium de 100 millimolaires pH 4,5 et 5 microlitres de solution d’endocellulase avec trois concentrations différentes, dans chaque puits de la plaque du kit de dosage.

Placez la plaque de produit sous la plaque du kit de test pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de réaction pendant l’agitation. Ensuite, incubez la plaque du kit de dosage à température ambiante dans un agitateur horizontal à 100 tr/min pendant 30 minutes.

Pour recevoir des données fiables, il est nécessaire d’agiter le mélange réactionnel pendant l’incubation.

Placez la plaque du kit de dosage avec la plaque de produit en dessous dans la centrifugeuse et tournez à 2 700 x g pendant 10 minutes, pour transférer le produit de réaction dans les puits de la plaque de produit.

Après l’essorage, inspectez visuellement la plaque du produit pour vérifier que le volume de liquide dans chaque puits est à peu près le même. À l’aide d’un lecteur de plaques, lire l’absorbance de la plaque collectrice à 630 nanomètres pour les différents substrats verts CPH.