A Stroke Versatile modèle murin de Subcortical substance blanche pour l'étude de axonale Degeneration et blanc Matière Neurobiologie

L’objectif global de cette procédure est de localiser avec précision un petit trait dans la substance blanche murine afin de modéliser cette forme courante de trait de substance blanche sous-corticale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’AVC, telles que les mécanismes des lésions axonales, la réponse neuronale à l’AVC sous-cortical et la façon dont les éléments cellulaires de la substance blanche réagissent pendant les phases aiguës et de réparation de l’AVC. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour localiser précisément un trait dans la substance blanche, et peut être utilisée avec une grande variété de modèles de souris murines.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, en raison de la faible quantité de substance blanche qui entraîne une mauvaise localisation de l’AVC. Des ajustements mineurs de l’angle d’injection ou des coordonnées stéréotaxiques pour chaque souche de souris, ou de la configuration stéréotaxique peuvent être nécessaires. Commencez par fixer une pipette en verre tiré sur un tube fixé à une conduite de vide.

Insérez l’extrémité tirée dans la solution L-Nio ou le traceur fluorescent L-Nio plus. Démarrez le vide et appliquez l’aspiration jusqu’à ce qu’au moins deux millimètres de la partie de 0,5 millimètre de diamètre de la pipette soient remplis. Mettez la pipette remplie de côté.

Placez ensuite la souris dans un appareil stéréotaxique équipé d’un microscope stéréotaxique. Après avoir anesthésié et préparé la souris pour la chirurgie conformément aux procédures approuvées, vérifiez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement de l’orteil. Il ne devrait pas y avoir de réponse.

Ensuite, ajustez le bras d’injection à 36 degrés. Fixez un support de pipette en verre tiré à l’extrémité distale d’un système d’injection à faible pression de volume et fixez-le au bras d’injection. Après avoir pratiqué une incision de 1,5 centimètre sur la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne, séchez la surface du crâne avec un coton-tige.

Ensuite, tout en regardant à travers un microscope stéréotaxique, à un grossissement de un à trois X, utilisez un outil à micropoints pour enlever tout tissu périosté sus-jacent. Marquez le bregma avec un marqueur à pointe fine. Ensuite, utilisez une perceuse chirurgicale équipée d’un foret chirurgical à pointe fine pour percer une craniotomie elliptique de deux millimètres, commençant postérieurement au bregma et s’étendant antérieurement juste à gauche de la ligne médiane.

Retirez les fragments d’os et les tissus mous sus-jacents afin que le cortex cérébral puisse être visualisé. Gardez la surface corticale humide en appliquant par intermittence des gouttes de sérum physiologique. Ensuite, fixez la pipette remplie sur le bras de l’injecteur.

Alignez l’extrémité distale de la pipette avec bregma et mettez à zéro les coordonnées stéréotaxiques. Avancez la pipette jusqu’au premier point d’injection en utilisant les coordonnées antérieures, postérieures et médio-latérales indiquées dans le tableau un. Ensuite, avancez la pipette vers la surface corticale et mettez à zéro la mesure dorsale-ventrale.

Abaissez lentement la pipette jusqu’aux coordonnées dorsale-ventrale. Assurez-vous que le grossissement du microscope stéréotaxique est réglé sur trois X et que le réticule calibré peut être clairement visualisé. Visualisez la pipette inclinée de côté de sorte que le ménisque du fluide d’air ait une vue sagittale.

Le ménisque doit apparaître dans le même plan focal des parois interne et externe de la pipette. Maintenant, à l’aide d’un système d’injection de pression locale réglé à 20 PSI pour des impulsions de 20 millisecondes, injectez 100 nanolitres de L-Nio dans le cerveau. Après avoir injecté le volume total, attendez cinq minutes pour éviter le reflux dans la piste de la pipette.

Ensuite, retirez la pipette et répétez la procédure d’injection aux deuxième et troisième séries de coordonnées fournies dans le tableau un. Après l’injection finale, retirez la pipette et placez suffisamment de cire osseuse pour remplir le site de craniotomie. Enfin, approchez les bords de la plaie du cuir chevelu et liez-la avec de l’adhésif dermique.

Après avoir administré l’analgésie postopératoire, placez l’animal dans une cage propre. Administrer des antibiotiques postopératoires dans l’eau de boisson pendant cinq jours, ou jusqu’au sacrifice si moins de cinq jours. Après avoir sacrifié et décapité la souris selon les procédures approuvées, utilisez des ciseaux stériles pour ouvrir le crâne vers l’arrière, puis utilisez une spatule pour retirer délicatement le crâne sus-jacent.

Ensuite, insérez une spatule stérile de quatre millimètres à l’avant du cerveau pour sectionner le bulbe olfactif et les nerfs optiques. Ensuite, soulevez doucement le cerveau hors du calvarium et placez-le dans un tampon de dissection glacé. À l’aide d’un bloc cérébral et de lames de rasoir stériles, coupez des tranches de deux à trois millimètres contenant la région touchée et placez-les dans un tampon de dissection froide.

À l’aide d’un microscope à dissection, identifiez la substance blanche sous-jacente au cortex moteur dans l’hémisphère injecté. À des intervalles post-AVC plus précoces, l’injection de L-Nio mélangée à des colorants de laboratoire courants, tels que le vert rapide, peut permettre une identification visuelle de l’AVC. À des intervalles plus longs après l’AVC, la région peut être identifiée visuellement par une nécrose focale et une pâleur de la myéline.

Une fois identifié, utilisez un scalpel pour disséquer soigneusement la région de la substance blanche contenant l’AVC. Retirez le cortex sus-jacent et le striatum sous-jacent, comme vous le souhaitez. Comme le montre ici, le marquage immunofluorescent des filaments neuraux, en rouge, démontre le degré de perte axonale sept jours après l’AVC, en utilisant l’approche médiale.

En utilisant l’approche inclinée postérieure, la lésion de la substance blanche est ciblée juste au-dessus du ventricule latéral et présente une réactivité microgliale intense, comme détecté par immunomarquage pour IBA-1. Deux marqueurs de filaments intermédiaires astrocytaires, la vimentine, représentée en rouge, et la protéine acide fibrillaire gliale, représentée en vert, révèlent des changements dans la morphologie des astrocytes de la substance blanche après un AVC. La co-injection de dextran amine fluorescente au moment de l’induction de l’AVC permet d’identifier les neurones individuels dont les axones ont été endommagés par l’AVC.

La plupart du marquage se produit dans les axones des neurones des couches cinq et six dans les cortex sensorimoteurs primaires recouvrant l’AVC. Cette image représente sept jours après l’AVC. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 45 minutes, si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire un trait de substance blanche focale chez une souris et préparer le cerveau à une variété de traitements en aval, utiles pour répondre à des questions importantes sur l’AVC et la réparation neurologique.