A Stroke Versatile modèle murin de Subcortical substance blanche pour l'étude de axonale Degeneration et blanc Matière Neurobiologie

L'objectif général de cette procédure est de localiser précisément un petit accident vasculaire cérébral dans la substance blanche murine afin de modéliser cette forme courante d'accident vasculaire cérébral sous-cortical de la substance blanche. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'accident vasculaire cérébral, telles que les mécanismes de lésion axonale, la réponse neuronale à un accident vasculaire cérébral sous-cortical, et la manière dont les éléments cellulaires de la substance blanche réagissent durant les phases aiguë et de réparation de l'accident vasculaire cérébral. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de localiser avec précision un accident vasculaire cérébral dans la substance blanche, et qu'elle peut être utilisée avec une grande variété de modèles murins.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, en raison de la faible quantité de matière blanche entraînant une mauvaise localisation de l'infarctus. Des ajustements mineurs de l'angle d'injection ou des coordonnées stéréotaxiques pour chaque souche de souris, ou du dispositif stéréotaxique, peuvent être nécessaires. Commencez par fixer d'abord une micropipette en verre étirée à un tube relié à une ligne de vide.

Insérez l'extrémité étirée dans la solution de L-Nio, ou dans le mélange de L-Nio et de traceur fluorescent. Démarrez le vide et appliquez une aspiration jusqu'à ce qu'au moins deux millimètres de la partie de la pipette ayant un diamètre de 0,5 millimètre soient remplis. Mettez la pipette remplie de côté.

Ensuite, placer la souris dans un appareil stéréotaxique équipé d'un microscope stéréotaxique. Après avoir anesthésié et préparé la souris pour la chirurgie selon les procédures approuvées, vérifier la profondeur de l'anesthésie à l'aide d'une pincée du orteil. Il ne devrait y avoir aucune réaction.

Ensuite, régler le bras d'injection à 36 degrés. Fixer un porte-pipette en verre étiré à l'extrémité distale d'un système d'injection à faible volume sous pression, puis le fixer au bras d'injection. Après avoir pratiqué une incision médiane de 1,5 centimètre sur le cuir chevelu afin d'exposer le crâne, sécher la surface osseuse avec un coton-tige.

Ensuite, tout en observant au microscope stéréotaxique, avec un grossissement de un à trois fois, utilisez un outil micropoint pour retirer tout tissu périosté recouvrant. Marquez le bregma à l’aide d’un marqueur à pointe fine. Puis, utilisez un trépan chirurgical équipé d’un foret chirurgical à extrémité fine pour réaliser une craniotomie elliptique de deux millimètres, en commençant postérieurement au bregma et en s’étendant antérieurement légèrement à gauche de la ligne médiane.

Retirez les fragments osseux et les tissus mous superficiels afin de visualiser le cortex cérébral. Maintenez la surface corticale humide en appliquant périodiquement des gouttes de sérum physiologique stérile. Ensuite, fixez la pipette remplie au bras de l'injecteur.

Alignez l'extrémité distale de la pipette avec le bregma et réinitialisez les coordonnées stéréotaxiques. Avancez la pipette jusqu'au premier point d'injection en utilisant les coordonnées antérieure, postérieure et médio-latérale indiquées dans le tableau un. Ensuite, avancez la pipette jusqu'à la surface corticale et réinitialisez la mesure dorso-ventrale.

Abaissez lentement la pipette jusqu'aux coordonnées dorso-ventrales. Assurez-vous que le grossissement du microscope stéréotaxique est réglé à trois fois, et que le réticule étalonné est clairement visible. Observez la pipette inclinée de côté afin d'obtenir une vue sagittale du ménisque air-liquide.

Le ménisque doit apparaître dans le même plan focal que la paroi interne et la paroi externe de la pipette. Ensuite, à l’aide d’un système d’injection de pression locale réglé à 20 psi pendant des impulsions de 20 millisecondes, injecter 100 nanolitres de L-Nio dans le cerveau. Après avoir injecté le volume total, attendre cinq minutes afin d’éviter un reflux le long du trajet de la pipette.

Ensuite, retirez la pipette et répétez la procédure d'injection aux deuxième et troisième jeux de coordonnées indiqués dans le tableau un. Après l'injection finale, retirez la pipette et appliquez suffisamment de cire osseuse pour combler le site de craniotomie. Enfin, rapprochez les bords de la plaie du cuir chevelu et fixez-les à l’aide d’un adhésif cutané.

Après l'administration d'une analgésie postopératoire, placer l'animal dans une cage propre. Fournir des antibiotiques postopératoires dans l'eau de boisson pendant cinq jours, ou jusqu'à l'euthanasie si celle-ci a lieu en moins de cinq jours. Après l'euthanasie et la décapitation de la souris selon les procédures approuvées, utiliser des ciseaux stériles pour ouvrir le crâne par la partie postérieure, puis utiliser une spatule pour retirer délicatement l'os crânien recouvrant le cerveau.

Ensuite, insérez une spatule stérile de quatre millimètres à l'avant du cerveau pour sectionner le bulbe olfactif et les nerfs optiques. Puis, soulevez délicatement le cerveau de la calvaria et placez-le dans un tampon de dissection glacé. À l'aide d'un bloc cérébral et de lames de rasoir stériles, découpez des tranches de deux à trois millimètres contenant la région affectée, et placez-les dans du tampon de dissection froid.

Sous un microscope stéréoscopique, identifier la substance blanche sous-jacente au cortex moteur dans l'hémisphère injecté. Lors d'intervalles post-accident vasculaire cérébral plus courts, l'injection de L-Nio mélangé à des colorants de laboratoire courants, tels que le vert rapide, peut permettre l'identification visuelle de l'accident vasculaire cérébral. Pour des intervalles post-accident vasculaire cérébral plus longs, la région peut être identifiée visuellement par une nécrose focale et une pâleur de la myéline.

Une fois identifiée, utilisez un scalpel pour disséquer soigneusement la région de substance blanche contenant l'infarctus. Retirez le cortex sus-jacent et le striatum sous-jacent, selon les besoins. Comme illustré ici, le marquage immunofluorescent des neurofilaments, en rouge, montre le degré de perte axonale sept jours après l'infarctus, en utilisant l'approche médiale.

En utilisant l'approche postérieure angulée, la lésion de l'infarctus de la substance blanche est ciblée juste au-dessus du ventricule latéral et présente une réactivité microgliale intense, telle que détectée par l'immunomarquage de l'IBA-1. Deux marqueurs des filaments intermédiaires des astrocytes, la vimentine, en rouge, et la protéine acide fibrillaire gliale, en vert, révèlent des modifications de la morphologie des astrocytes de la substance blanche après l'infarctus. L'injection concomitante d'amine de dextran fluorescent au moment de l'induction de l'infarctus permet d'identifier les neurones individuels dont les axones ont été lésés par l'infarctus.

La majeure partie du marquage se produit dans les axones des neurones des couches cinq et six des cortices sensorimoteurs primaires recouvrant la zone d'infarctus. Cette image représente sept jours après l'infarctus. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 45 minutes, si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment provoquer un infarctus focal de la substance blanche chez la souris et préparer le cerveau pour divers traitements ultérieurs, utiles pour répondre à des questions importantes en matière d'AVC et de réparation neurologique.