Une méthode pour isoler l'îlot murin et transplantation rénale sous-capsulaires

La greffe d’œillets a été proposée comme traitement potentiel du diabète de type 1. Cependant, deux limites majeures l’empêchent d’être une réalité clinique généralisée. Tout d’abord, un grand nombre d’œillets est nécessaire par destinataire.

Étant donné que les œillets sont obtenus auprès de donneurs d’organes, le nombre de receveurs potentiels est sévèrement limité. La deuxième transplantation nécessite un traitement à vie avec des immunosuppresseurs puissants, ce qui expose le patient, en particulier la population pédiatrique, à un risque de malignité, d’infection et d’insuffisance rénale. La transplantation d’œillets sous la capsule rénale de souris est effectuée pour étudier des stratégies visant à améliorer les résultats cliniques de la transplantation.

Œillets isolés de souris donneuses saines assortis en groupes et préparés pour la transplantation. Les œillets sont ensuite transplantés dans l’espace sous-capsulaire du rein. Chez les souris receveuses diabétiques, la fonction de la greffe d’œillet est évaluée en surveillant la glycémie, ce qui révèle qu’environ 250 à 350 œillets rétabliront la glycémie chez une souris receveuse de 20 grammes dans les 24 heures suivant la transplantation.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour les étapes de canulation. Le canal cholédoque et le transfert des œillets dans l’espace sous-capsulaire du rein sont difficiles à apprendre. Ces étapes nécessitent une identification des structures tissulaires, des mains stables et l’utilisation d’une technique qui minimise les dommages tissulaires.

Placez une souris euthanasiée en position couchée sur une serviette en papier au niveau de la lunette de dissection et vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux pour ouvrir l’abdomen avec une incision en V de la région pubienne aux deux pattes avant. La souris se trouve sous la portée de dissection.

Positionnez-le avec la tête pointée vers l’observateur. Localisez l’entrée duodénale du canal cholédoque à l’aide d’une pince d’hémostat, l’ouverture duodénale du canal cholédoque. L’hémostat doit être positionné de telle sorte que, lorsqu’il est comprimé, il longe exactement le bord du pancréas et de l’intestin.

Ici, deux méthodes de canulation du canal biliaire seront démontrées. La méthode à main levée et la méthode d’assistance par pinceps pour canuler le canal biliaire. À l’aide de la méthode à main libre, tirez l’hémostat fixé sur le duodénum de la tête de la souris vers la queue afin que le canal cholédoque devienne tendu.

Il y a une confluence dans le canal biliaire près du foie où la bile qui s’écoule de la vésicule biliaire et les enzymes du foie se rejoignent. Avant d’entrer dans les intestins, tirez le canal biliaire pour exposer l’intérieur de la position V. Une aiguille pliée de calibre 27 attachée à une seringue de cinq millilitres de sorte que l’aiguille glisse à travers le V et canule directement la partie inférieure du conduit. Faites glisser l’aiguille à plusieurs millimètres au-delà de l’extrémité du biseau pour éviter le reflux dans le foie et la vésicule biliaire.

Une fois la canulation réussie, perfuser le pancréas en distribuant deux millilitres de liase à partir de la seringue. Surveillez l’expansion du pancréas sur l’estomac comme indication d’une canulation optimale. Alternativement, le canal biliaire peut être canulé.

Utilisation de la méthode du kyste par forceps. Tirez l’hémostat C fixé sur le duodénum loin de la tête de la souris vers la queue de sorte que le canal cholédoque devienne tordu. Ensuite, à l’aide d’une aiguille pliée de calibre 27 attachée à une seringue de cinq millilitres, percez le fascia sous le canal cholédoque près du foie.

Utilisez l’aiguille pour dégager le fascia du conduit avec l’aiguille toujours en place. Posez l’hémostat et prenez une paire de pinces. Utilisez un bras de la pince ouverte pour soutenir le canal biliaire où l’aiguille a dégagé le fascia tout en tirant le canal et la pince vers l’avant.

Glissez l’aiguille dans le conduit à l’aide de la pince comme butoir. Une canulation réussie est indiquée par une expansion uniforme de la région du pancréas sur le dessus de l’estomac. Une fois le pancréas perfusé, retirez l’hémostat du duodénum.

Ensuite, utilisez la pince pour soulever le duodénum et utilisez une deuxième paire de pinces pour séparer le pancréas des intestins. Ensuite, libérez le pancréas du haut de l’estomac et de la rate. Enfin, soulevez le pancréas de l’abdomen et libérez-le des connexions restantes du fascia avec l’intestin, l’estomac et la rate.

Placez le pancréas dans un tube conique de 50 millilitres et placez-le sur de la glace. Incuber le pancréas à 37 degrés Celsius selon les instructions du protocole écrit ci-joint. Après l’incubation, ajoutez 20 millilitres de milieu dans les tubes et dissociez le tissu en secouant vigoureusement les tubes 40 fois en 10 secondes.

Cette étape est essentielle pour une récupération optimale des violettes. Les cellules de rotation ont une fréquence de 800 rotations par minute. Passez 15 millilitres de milieu et condensez les échantillons.

Versez la boue remise en suspension à travers un treillis métallique de 0,419 millimètre et acheminez-la dans un tube conique frais de 50 millilitres. Rincez le premier tube avec 10 millilitres supplémentaires de milieu contenant 10 % de sérum de veau fœtal et versez-le à travers le granulé de treillis métallique les cellules par centrifugation reus, pliez le granulé en cinq millilitres de température ambiante son opaque 10 77. Ensuite, tourbillonnez doucement pendant plusieurs secondes, ajoutez cinq millilitres supplémentaires de son opaque autour de l’intérieur du tube pour laver les œillets de la paroi du tube, pipetez lentement pour superposer 10 millilitres de RPMI sans sérum sur le côté du tube à raison d’un millilitre toutes les 10 secondes.

Une interface nette doit être évidente. Ensuite, faites tourner les échantillons dans une centrifugeuse à godets oscillants à 20 degrés Celsius et 900 fois la gravité pendant 20 minutes avec une accélération très lente et sans freinage suite à la centrifugation, les îlots seront séparés des cellules exocrines à l’aide d’une pipette sérologique jetable de 10 millilitres. Transférez les œillets de l’interface multimédia histo Paque vers un nouveau tube conique de 50 millilitres.

Plusieurs tubes peuvent être regroupés à ce stade pour éliminer les œillets résiduels, ses tubes opaques remplissent les tubes de sérum contenant du sérum et granulent les îlots en centrifugeant les tubes pendant deux minutes à 800 rotations par minute. Ensuite, les îlots sont suspendus dans des milieux frais. Répétez cette étape au moins deux fois. Reus.

Suspendez la palette dans cinq millilitres de support. Placez une passoire à cellules en nylon de 0,1 millimètre à l’envers sur un tube conique de 15 millilitres. Pipetez la boue de cellule en suspension à travers celle-ci pour recueillir les œillets.

Rincez ensuite le tube de 50 millilitres avec six millilitres supplémentaires de média et passez-le dans la passoire. Placez une goutte de trois millilitres de milieu dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Renversez la passoire cellulaire et plongez-la dans la goutte de milieu pour recueillir les œillets, pipetez cinq à sept millilitres supplémentaires de milieu de culture à travers la passoire dans la boîte de Pétri.

Pour recueillir les œillets restants de la crépine sous un objectif quadruple, prélevez les œillets individuellement avec une pipette P 200 et transférez-les dans un tube micro-fuge de 1,5 millilitre. Ces images montrent des œillets isolés de souris C 57 noires six âgées de 12 semaines. La pureté et la qualité des œillets peuvent être estimées au microscope à la fin de la procédure d’isolement.

Par exemple, les deux images présentées ici montrent un champ représentatif où des débris et une contamination cellulaire exocrine sont présents. Lorsque vous choisissez des œillets pour une expérience, évitez de choisir des cellules exocrines contaminantes ou des œillets qui semblent malsains. Les œillets avec des centres nécrotiques sont malsains comme le montre cette figure prise 24 heures après l’isolement, les centres nécrotiques ne seront pas visibles immédiatement après l’isolement.

Les œillets qui sont des cellules de desquamation sont inévitables et peuvent être utilisés dans la transplantation d’œillets dans cette vidéo en accéléré de 24 heures d’œillets. Immédiatement après l’isolement, des centres nécrotiques se développent dans de nombreux œillets. Ces centres nécrotiques semblent être expulsés de l’œillet vers la fin de l’enregistrement lors de la cueillette des œillets.

Regroupez-les de manière à ce que chaque tube ait une répartition uniforme de la qualité et de la taille des œillets. Par exemple, chaque groupe de 15 œillets peut contenir quatre œillets de grande taille, six œillets moyens et cinq petits œillets. Lieu. Le tube sur œillets de glace peut être utilisé immédiatement pour la transplantation ou manipulé.

Avant utilisation. Placez un embout de chargement de gel stérile dans l’ouverture d’un tube micro-fusionné de 1,5 millilitre de manière à ce qu’il y ait une légère courbure, qui forme un U à l’extrémité étroite de l’embout. Les deux ouvertures de la pointe doivent être orientées directement vers le haut à l’extérieur du micro-tube à déchets.

Retirez délicatement un tube d’œillets de la glace. Assurez-vous que tous les œillets sont bien installés au fond du tube. À l’aide d’une pipette P 200, prélevez délicatement les œillets dans un volume minimal au bas du tube et transférez-les sur l’embout incurvé préparé.

Une fois que les œillets se sont sédimentés, retirez autant de support que possible de la pointe en aspirant le support par la grande ouverture de l’œillet portant la pointe de chargement de gel Avec une pointe de chargement de gel fraîche fixée à une pipette P 200. Fixez l’extrémité non biseautée du tube à l’ouverture étroite de l’extrémité de chargement du gel de roulement d’îlot. Fixez ensuite l’embout à une pipette P 200 et enfoncez doucement les îlots dans la tubulure.

Ensuite, connectez le bord non biseauté du tube PE 50 à l’aiguille d’une seringue Hamilton de 25 microlitres. Avec le piston retiré, appuyez sur le piston de la seringue jusqu’à ce que les œillets soient à environ 0,5 centimètre de l’ouverture biseautée. Mettez la seringue de côté de manière à ce que les œillets puissent se déposer en une seule masse près de l’ouverture biseautée du tube pendant que le rein est préparé pour recevoir les œillets.

Préparez le site chirurgical en coupant les cheveux et en frottant la peau avec de la bétadine en alternant trois fois avec de l’alcool isopropylique à 70 %. Commencez la procédure de greffe d’œillets en effectuant un pincement de l’orteil pour confirmer l’anesthésie chez la souris receveuse. Placez la tige d’une tige de verre directement sous la souris et sous le rein perpendiculairement à la moelle épinière.

Ensuite, localisez le rein à travers la peau et placez un champ chirurgical stérile. Une fois le rein localisé, utilisez des ciseaux McFerson banis pour faire une incision de deux centimètres à travers le derme directement au-dessus de celui-ci, perpendiculaire à la moelle épinière. Cette incision exposera la paroi péritonéale avec les ciseaux.

Faites une incision d’un centimètre à travers la paroi péritonéale dans la même direction que la coupe à travers la couche dermique en utilisant la tige de la tige de verre comme butée arrière, forcez le rein à travers l’ouverture péritonéale en appuyant sur la surface adjacente. Mouillez la surface du rein exposé avec du PBS stérile et glacé à l’aide d’un applicateur à embout de coton imbibé. Répétez l’étape toutes les quelques minutes au besoin pour éviter que la capsule rénale ne se dessèche.

À l’aide d’une aiguille de calibre 27, faites une incision de 0,2 centimètre à travers la capsule rénale sur la surface antérieure du rein. En vous déplaçant du côté latéral gauche vers le côté latéral droit, insérez un tube capillaire en verre tiré par la flamme. Sondez l’incision pratiquée précédemment et déplacez-la vers l’arrière le long de la surface latérale dorsale du rein.

Pour créer une poche entre la capsule rénale et le parenchyme rénal, déplacez les œillets de la seringue Hamilton de 25 millilitres préparée jusqu’au bord même de l’ouverture biseautée du tube flexible. Insérez ensuite le bord biseauté vers le haut dans la poche sous-capsulaire. Le bord long est en contact avec le parenchyme rénal.

Déplacez le tube vers l’extrémité la plus postérieure de la capsule. Transférez ensuite lentement les œillets du tube PE 50 dans la poche sous-capsulaire en appuyant sur le piston de la seringue. Au fur et à mesure que les œillets remplissent le sac, repoussez lentement le tube flexible pour faire plus de place.

Après avoir retiré le tube de la poche, faites glisser la sonde en verre le long de la surface externe du rein d’avant en arrière pour tasser doucement les œillets dans l’extrémité proximale de la poche. À l’aide d’une pince à bras plié, soulevez la muqueuse péritonéale adjacente à l’ouverture faite pour le rein. Ensuite, utilisez un applicateur à embout en coton imbibé de PBS pour repousser doucement le rein dans la cavité péritonéale.

Fermez la souris en appliquant des sutures sur la paroi péritonéale et des clips de plaie sur la couche dermique. Remettez la souris dans sa cage et son moniteur. Pour la récupération, de l’eau aceto meine doit être fournie pour l’intestin de la souris.

C œillets de souris isolés. En utilisant les méthodes décrites dans cette vidéo et une dose curative a été transplantée chez des souris allogéniques C 57 black six. La glycémie non à jeun a été surveillée à partir du premier jour postopératoire.

Le rejet est visible vers le 17e jour chez les souris receveuses de 20 grammes qui ont reçu 300 œillets d’un donneur allogénique ici. La récupération a été surveillée chez des souris ayant reçu soit 150 œillets, soit 300 œillets de donneurs syngéniques. Aucun rejet n’est observé dans ces greffes car les œillets proviennent de donneurs syngéniques.

La dose d’œillet administrée mesure la fonction principale des œillets immédiatement après la transplantation. Alors qu’une récupération marginale a été observée avec 150 œillets, une récupération complète a été observée lorsque 300 œillets ont été transplantés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer les étapes critiques nécessaires pour isoler les œillets de souris et transplanter ces œillets sous l’espace sous-capsulaire du rein.

Avec de la pratique, vous développerez la capacité de canuler rapidement le canal cholédoque, qui est l’étape la plus difficile de ce protocole.