Name: Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Découvrez l'optimisation du test de migration par blessure pour quantifier la capacité migratoire des cellules mésenchymateuses stromales pulmonaires murines après exposition à l'extrait soluble de fumée de cigarette.

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Nous sommes reconnaissants envers les autres membres du laboratoire pour leur aide technique dans l’élaboration de l’analyse des dommages causés par le CSE, ainsi que pour leur soutien et leurs conseils pendant la mise au point de cette analyse. De plus, nous sommes reconnaissants envers le Holy Cross Fenwick Scholar Committee pour son soutien à Nicholas Cormier, et le programme de spécialisation du Holy Cross College pour son soutien à Alexander Yeo.

Remarque: Pour cette étude, des cellules stromales mésenchymateuses du poumon (LR-MSC) à partir de tissu pulmonaire distale ont été isolés soit en fonction de leur expression de marqueurs de surface cellulaire (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 élevé, EpCAM neg) 14,15, à l&#39;aide explantation hors croissance de 16, ou en utilisant une digestion enzymatique 17. LR-adhérent CSM ont été cultivées dans du DMEM riche en glucose avec et sans glutamine, 15% de FBS, de la glutamine mM antibiotique / antimycotique, et deux 1x (médias désormais complet) et on incube à 37 ° C, 5% CO 2. LR-MSC ont été passées 3-4 fois afin d&#39;assurer une population de cellules ayant des caractéristiques de croissance relativement homogènes pour l&#39;essai de migration. 1. Préparation d&#39;une monocouche confluente <ol><li> Pour détacher MSC de boîtes de culture de 100 mm, laver les cellules avec 10 ml de 37 ° C préchauffé PBS, aspirer le PBS et ajouter 4 ml de trypsine (0,25%). Incuber 3 à 5 min dans un incubateur à 37 °. Aspirer le cElls dans un tube conique, ajouter un volume égal de milieu complet et centrifuger à 300 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules vers le bas. Remarque: incubation plus long peut modifier la trypsine dans les récepteurs de la surface cellulaire et potentiellement affecter la migration. </li><li> Aspirer le milieu et remettre les cellules dans un milieu complet frais. Compter les cellules, à l&#39;exclusion des cellules mortes en utilisant exclusion du bleu trypan et de la plaque de cellules stromales mésenchymateuses 500.000 dans 4 ml de milieu complet sur une boîte de culture cellulaire de 60 mm. Note: En fonction de la source des cellules, des tests peuvent être nécessaires pour déterminer le nombre optimal de cellules nécessaires. </li><li> Incuber les cellules jusqu&#39;à ce que les plaques sont 90% de confluence pour une fixation optimale des cellules et la prolifération, habituellement 48-72 h pour MSC. Remarque: 100% de confluence est pas recommandé, car un grand nombre de cellules expérience inhibition de contact de l&#39;ancrage à charge, ce qui peut modifier leur capacité migratoire. Plaques avec moins de 80% de confluence se traduira par des photos inutilisables parce que le logiciel d&#39;analyse d&#39;image va interpréter écarts entre les cellules dans le cadre du périmètre de la rayure (voir figure 1D). </li><li> Après que les cellules ont atteint 90% de confluence, les cellules comme endommager approprié pour l&#39;application. Pour évaluer les dommages cellulaires après exposition à soluble extrait de la fumée de cigarette (CSE), générer 100% CST en dessinant la fumée à partir du 1er Université du Kentucky cigarette de recherche (3R4F) à travers 25 ml de milieu complet dans un flacon Büchner plus de 2 min 18. </li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures dans 4 ml 1-4% CST diluée dans un milieu complet. Après incubation, laver les cellules deux fois avec 4 ml de PBS chaud stérile, avant de remplacer avec 4 ml de milieu complet frais. Remarque: endommager les cellules avec des concentrations élevées de l&#39;extrait de la fumée de cigarette (&gt; 5%) peut réduire sensiblement la confluence. </li></ol> 2. Création du Scratch <ol><li> Dans un environnement stérile, retirer le couvercle de la plaque de 60 mm de MSC endommagés, et de jeter un bord droit (par exemple, une règle en plastique stérilisé) across le rebord supérieur de la plaque. Sans retirer le support, utiliser une pipette de 200 pi stérile guidée par le straight-edge stérile pour faire de un à quatre rayures parallèles à travers la plaque d&#39;environ 5 mm d&#39;intervalle et 50 mm de long. Remarque: A bord droit minimise la quantité de réglages en rotation nécessaires à la plaque quand il est sur la platine du microscope. Il est impératif que les rayures apparaissent complètement verticale (ou horizontale) sur l&#39;écran. Générer de multiples rayures sur une plaque de 60 mm ne modifie pas le micro-environnement d&#39;une manière qui affecte la migration des cellules (données non présentées), mais elle peut être une considération pour les autres types de cellules. L&#39;utilisation de petits puits est déconseillé car la variabilité de la croissance de cellules près du bord du puits devient plus prononcée et peut affecter la génération uniforme de rayures. </li><li> Aspirer les médias et laver délicatement les plaques avec 2 ml de milieux complets pré-chauffé pour empêcher les cellules d&#39;adhérer au centre de la rayure, et de supprimer la cellules qui ont été ébranlée par le grattage. Remplacer avec 4 ml de milieu complet frais. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un marqueur permanent stérile, étiqueter chaque scratch parmi 1-4 sur la face inférieure de la plaque à l&#39;emplacement qui ne sera pas interférer avec l&#39;imagerie des rayures. Remarque: Il est important que les images de la même zéro sont comparés avant et après la migration, car il peut y avoir des variations dans la largeur de zéro. </li></ol> 3. Prenant images initiales de la rayure Remarque: Si le dosage de zéro est effectuée sur des plaques multiples, il est recommandé que les images initiales de toutes les rayures sur une seule plaque sont prises avant rayures sont faites sur la plaque suivante. <ol><li> Utiliser un microscope à contraste de phase inversée avec un appareil pour générer les images nécessaires à l&#39;analyse. </li><li> Placer la plaque de culture sur le microscope, et d&#39;utiliser l&#39;objectif de faible puissance (10X) pour localiser zéro # 1. Si de la condensation sur le couvercle de la plaque de culture est une entrave claire image des cellules, utilisez un ensemble de stade chauffé à 37 ° C. </li><li> Garder le scratch complètement horizontal et dans le centre du champ de vision, obtenir autant d&#39;images que nécessaire pour englober 90% de la longueur de la rayure. Obtenir des images de parties distinctes de la rayure sans chevauchement entre les images. Remarque: La réfraction de la lumière sur les bords de la boîte de culture surexpose les images, ce qui les rend impossibles à analyser. Par conséquent, ne pas prendre des images de la première et dernière 5% de la longueur de la rayure. </li><li> Enregistrez les images de chaque zéro dans un dossier distinct. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.4 pour les égratignures 2, 3, et 4. </li><li> Remettre les assiettes à l&#39;incubateur immédiatement après l&#39;imagerie initiale. Laissez cellules migrent pour 4-7 heures. Remarque: 7 h est optimale lors de l&#39;évaluation MSC endommagés avec le CST. Incubation des cellules pendant plus de 7 heures est pas recommandé car la prolifération cellulaire peut agir comme un facteur de confusion pour la migration cellulaire (voir la note 8.2 ci-dessous en option). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analyse initiales Scratch Images <ol><li> Télécharger ImageJ et installer le plugin de guérison des plaies outil (se référer à la Table des Matières / Équipement). </li><li> Ouvrez le fichier d&#39;image dans ImageJ, puis cliquez sur &quot;Process&quot; et &quot;Trouver Edges&quot; de mettre en évidence les cellules environnantes le scratch pour la guérison des plaies outil pour calculer l&#39;aire de zéro (figure 2B). Ensuite, cliquez sur &quot;Image&quot;, &quot;Ajuster&quot;, &quot;Seuil de couleur&quot; et dans le menu déroulant intitulé &quot;Seuil de couleur&quot; changer la valeur de &quot;B &amp; W.&quot; </li><li> Dans le menu &quot;seuil de couleur&quot;, régler les deux curseurs de seuil de luminosité jusqu&#39;à ce contraste optimal entre le zéro et la cellule avant est atteint. Afin de permettre la plus grande gamme en essayant de créer contraste de l&#39;image, déplacez le curseur en bas complètement à droite (image complètement noire), puis ajustez le curseur dessus pour générer un contraste maximum. </li><li> Ajuster lentement le bri topghtness curseur de gauche à droite jusqu&#39;à ce que l&#39;image affiche proprement le contour de la rayure (figure 2C). Une fois les bords de la rayure ont été identifiés, cliquez sur &quot;Plus Outils» dans la barre d&#39;outils ImageJ, sélectionnez &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; dans le menu déroulant, puis appuyez sur la touche &quot;m&quot; (qui apparaîtra dans la barre d&#39;outils ImageJ) pour mettre en évidence la zone de zéro et la sortie de la zone calculée dans une fenêtre de résultats pop-out (figure 2D). </li><li> Copier et coller tous les numéros de la fenêtre des résultats (figure 2E) dans un tableur Excel. Assurez-vous de séparer les données individuelles des égratignures. </li></ol> 5. Compte Images finales du Scratch <ol><li> Après que les cellules ont migré (4-7 heures), répétez les étapes 3.2 à 3.4. Image les plaques dans le même ordre qu&#39;ils ont été rayés de sorte que les cellules sur chaque plaque ont eu le temps égal à migrer. Remarque: Les cellules peuvent être visualisés à de multiples points dans le temps, en fonction de leur sensitivité à la fois des changements de température et de pH. Alternativement, imagerie de cellules vivantes peut être utilisé pour suivre les cellules en temps réel lors de leur migration. </li></ol> 6. Analyse finales Scratch Images <ol><li> Répétez les étapes 4.2 à 4.5 pour des images de Final Scratch. </li></ol> 7. Calcul de la zone de Scratch pour quantifier la migration <ol><li> Calculer la superficie moyenne de pré-migration par la moyenne des valeurs de la zone de départ des rayures respectifs. </li><li> Calculer le montant total de la migration en soustrayant la zone de migration finale pour chaque image, calculée à l&#39;étape 6, à partir de la zone de pré-migration moyenne (étape 7.1). Générer une liste de valeurs pour chaque zéro représentant l&#39;évolution de la migration. </li><li> Regrouper les données provenant de plusieurs rayures à l&#39;intérieur du même groupe d&#39;essai (à savoir toutes les plaques et les griffes sur les cellules exposées à 0% CSE). Utiliser une analyse de l&#39;essai Écart d&#39;analyser les différences entre les groupes expérimentaux. </li><li> Si les cellules sont lentes à migreret exiger un temps d&#39;incubation plus longue après grattage (supérieure à 12.10 h), effectuer une BrDU ou EdU incorporation test 19 pour déterminer si les cellules sont en cours de prolifération pendant toute la période pendant laquelle l&#39;essai de migration est en cours. Choisir un temps d&#39;essai de migration pour éviter la prolifération cellulaire significative. </li></ol> 8. Facultatif <ol><li> Pour évaluer si la sénescence cellulaire importante est en cours à la suite de la procédure de grattage, effectuer une bêta-galactosidase dosage de la sénescence associée sur une plaque d&#39;essai à des moments prédéterminés après grattage 19. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole décrit ici offre une méthode quantitative robuste standardisée pour réaliser et analyser les tests de grattage. Dosages à gratter simples sont couramment utilisés dans de nombreux domaines d&#39;étude pour examiner la migration cellulaire. Cependant, traditionnellement le dosage de zéro a manqué un set-up et la quantification protocole standardisé, qui a conduit à des problèmes avec la reproductibilité 7,10. Beaucoup de modifications et optimisations pour améliorer le dosage de zéro ont réduit ce...

La migration cellulaire est hautement coordonnée et essentielle pour de nombreux processus physiologiques tels que le développement des tissus, la réparation et la régénération, ainsi que des processus pathologiques tels que les métastases du cancer et une artériosclérose. Une bonne compréhension de la migration cellulaire est particulièrement pertinent pour les nouvelles thérapies utilisées pour réparer les tissus endommagés et traiter des conditions pathologiques, y compris les technologies de transplantation de cellules et de tissus artificiels greffage 2. Compte tenu de l&#39;intérêt actuel pour le rôle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans la médiation de la réparation des tissus 3, la quantification de la capacité de migration de ces cellules en utilisant un dosage qui est rigoureusement quantifiables, adaptable et rentable est d&#39;intérêt. Surtout, un tel essai doit être suffisamment sensible pour détecter des changements relativement subtiles dans la capacité migratoire cellulaire après les dommages. Les méthodes actuelles pour quantifier la migration des cellules, y compris des essais à gratter, des essais de migration trans-puits (Boyden chambres), tableaux micropilier et l&#39;exclusion de la zone cellulaire tests possèdent une gamme de limitations dans la reproductibilité, de personnalisation, de quantification et coût-efficacité 1,4,5. Le dosage de zéro optimisé décrit ici démontre des résultats robustes, des capacités d&#39;analyse et quantifiables basés sur l&#39;image, coût-efficacité, l&#39;adaptabilité et à d&#39;autres applications. Des dosages de grattage ont été utilisés dans de multiples capacités d&#39;évaluer la migration et la prolifération cellulaire dans différentes conditions expérimentales 5. Le test implique l&#39;ensemencement des cellules désignées, les cultiver à compléter ou à proximité de la confluence, et gratter la monocouche résultant avec une aiguille stérile ou pipette 6. L&#39;analyse est le plus souvent réalisée en comparant la largeur de la rayure sur plusieurs points de temps à des endroits choisis au hasard 7-9. En dépit de son utilisation importante, l&#39;essai de rayure est confondu par des problèmes avec la reproductibilité et la quantification. La variabilité dansgénération de la rayure ne modifie pas le micro-environnement des cellules, mais peut également empêcher la migration des cellules en endommageant la surface de la plaque sous-jacente et la matrice extracellulaire-5. Les dosages sont effectués fréquemment plus de 7 à 12 heures, mais pour des lignées cellulaires présentant migration plus lente et de plus longs temps de dosage, la prolifération devient un facteur de confusion 7,10. Enfin, les cellules sénescentes générés par le processus de grattage peuvent libérer des facteurs qui interfèrent avec la signalisation extracellulaire nécessaire pour combler l&#39;écart dans la monocouche 1. Optimiser le dosage de zéro nécessite la création d&#39;un espace cohérent qui ne perturbe pas les propriétés de surface, ce qui minimise dosage longueur de temps, et de prévenir la mort des cellules non désirées lors de la manipulation. Le dosage est basé bouchon une optimisation du dosage d&#39;une zone d&#39;exclusion de cellules. Cet essai utilise un bouchon placé au milieu du puits, qui exclut la croissance des cellules, mais permet aux cellules d&#39;être plaqués autour de la zone d&#39;exclusion central.Pour évaluer la migration, le bouchon est enlevé, et la zone d&#39;exclusion résultante fournit une surface pour la migration se produise. Toutefois, ce dosage est difficile pour personnaliser ou adapter 10 et pour certaines applications, cette technique peut également être prohibitif. Contrairement aux tests de grattage et de leurs dérivés, des tests de migration trans-de puits (ou de Boyden dosages de chambre) évaluer la migration en quantifiant le nombre de cellules qui se déplacent d&#39;une chambre, à travers une membrane de filtration microporeuse, dans une chambre contenant des agents chimiotactiques 8,11, 12. Cette technique a une utilité limitée pour les cellules adhérentes comme MSC, car après la migration à travers la membrane poreuse, les cellules adhèrent au côté de la membrane exposée aux agents chimiotactiques, et peuvent être difficiles à quantifier avec précision. Alors que le test est en mesure d&#39;examiner certains schémas de migration en trois dimensions, les types de cellules restreintes pour lesquelles il est en mesure de quantifier avec précision la limite de la migration des cellules de son utilitaire 10. Une autre alternative pour des essais de rayure utilise une matrice de micro-colonne, qui mesure la motilité cellulaire à travers un espace à trois dimensions en utilisant la capacité des cellules à se déformer et à migrer dans la matrice en tant que substitut. Polydimethlysiloxane (PDMS) élastomères durcis sur un moule précis et traités avec de l&#39;ozone et de la fibronectine produit un micro-environnement homogène et non dégradable. Micro-pilier espacement peut également être modifié selon les besoins pour évaluer la capacité des cellules pour entrer dans le tableau 4. Le moule est créée par profonde gravure ionique réactive de plaquettes de silicium pour créer une version négative de la haute rapport d&#39;aspect 13 gamme. Bien que le dosage est renforcé par sa personnalisation, la capacité de modéliser la migration en trois dimensions, et l&#39;analyse par la visualisation directe des cellules migrantes, la difficulté à créer des réseaux de micro-pilier économique empêche son utilisation généralisée. Le dosage de zéro optimisé décrit dans ce protocole offre une efficacité, des cosProcédé de t-efficace pour produire des rayures uniformes qui peuvent être analysées en utilisant un logiciel disponible gratuitement. Au lieu de simples mesures de largeur faites à travers le scratch avant et après la migration cellulaire, le logiciel permet à l&#39;utilisateur de déterminer les zones à gratter totaux avant et après la migration. Cet avancement limite la question d&#39;essayer de déterminer où le zéro les mesures de largeur doivent être prises, et si la largeur de la rayure est uniforme le long de sa longueur. En outre, une optimisation soignée du nombre de cellules, la confluence des cellules et le type et le degré de dommages infligés aux cellules est discutée afin d&#39;optimiser le dosage.

<table><tbody><tr><td>DMEM (hyperglycémie, sans glutamine ajoutée)</td><td>Life Technologies</td><td>31053-036</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, Thermo Scientific HyClone</td> Fisher <td>Scientific</td><td>SH3091002</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique/antimycosique, Thermo Scientific HyClone&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone</td> Fisher <td>Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire TypeLE</td><td>Life Technologies</td><td>12563-01</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s, Thermo Scientific HyClone&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Falcon standard 60 mm boîtes de culture tissulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Stérile 200 &mu ; l pointes de pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-502</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à lumière inversée avec fixation de caméra</td><td>Logiciel</td> ImageJ variable<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MRI_Wound_Healing plugin</td><td><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse statistique</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

La migration cellulaire est vitale pour de nombreux processus physiologiques et pathologiques, notamment le développement, la réparation et la régénération des tissus, les métastases cancéreuses et les réponses inflammatoires. Étant donné l’intérêt actuel pour le rôle des cellules stromales mésenchymateuses dans la médiation de la réparation tissulaire, nous nous intéressons à quantifier la capacité migratoire de ces cellules et à comprendre comment la capacité migratoire peut être altérée après des dommages. L’optimisation d’un test de migration rigoureusement quantitatif, à la fois facile à personnaliser et rentable à réaliser, est essentielle pour répondre aux questions concernant les altérations de la migration cellulaire en réponse à divers stimuli. Les méthodes actuelles de quantification de la migration cellulaire, y compris les tests de scratch, les tests de migration trans-puits (chambres de Boyden), les réseaux de micropiliers et les tests de zone d’exclusion cellulaire, présentent une série de limites en termes de reproductibilité, de personnalisation, de quantification et de rentabilité. Malgré son utilisation dominante, le test scratch est confondu par des problèmes de reproductibilité liés aux dommages du microenvironnement cellulaire, aux obstacles à la migration cellulaire, à l’influence des cellules sénescentes voisines et à la prolifération cellulaire, ainsi qu’à l’absence de quantification rigoureuse. Le test de rayure optimisé décrit ici démontre des résultats robustes, des capacités d’analyse quantifiables et basées sur l’image, une rentabilité et une adaptabilité à d’autres applications.

Les tests de grattage présentées ici ont été réalisées en utilisant des cellules stromales mésenchymateuses résidents du poumon murins (LR-MSC) et isolés comme référence dans les notes de protocole. La LR-MSC ont été ensemencées à une densité de 500.000 cellules dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm, et cultivé à 90% de confluence en 48 heures. Pour générer des dommages, 4% CST (décrite ci-dessus) a été incubé avec les cellules pendant 24 heures après la période initiale d&#39;ensemencement mais avant l&#39;essa...

La capacité de migration est une fonction clé de nombreux types de cellules différentes, y compris les cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Cependant, il est difficile de quantifier les altérations de la capacité migratoire après des dommages. Ce protocole décrit un test de migration facilement adaptable qui utilise des statistiques rigoureuses pour quantifier les changements dans la capacité migratoire des CSM après des dommages.

Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

L'objectif général de ce test est de détecter les modifications de la capacité migratoire des cellules souches mésenchymateuses pulmonaires après exposition à un extrait soluble de fumée de cigarette. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie régénérative pulmonaire, notamment comment améliorer la capacité migratoire des cellules progénitrices pulmonaires afin de favoriser la réparation pulmonaire. Le principal avantage de cette technique réside dans son optimisation pour fournir des mesures quantitatives plus précises de la migration cellulaire, tout en restant économique à réaliser et facile à personnaliser.Dans cette démonstration, le test de rayure sera utilisé pour quantifier la capacité migratoire des cellules souches mésenchymateuses pulmonaires murines, ou MSC. Après exposition à un extrait soluble de fumée de cigarette, les MSC sont cultivées dans un milieu complet sur des plaques de 60 millimètres et endommagées comme décrit dans le texte du protocole. Une confluence appropriée est importante pour le test de rayure, car elle garantit que le logiciel d'analyse d'image peut correctement identifier les limites de la rayure.Cet exemple montre des CSM à 95 % de confluence, appropriées pour une rayure en environnement stérile. Retirez le couvercle d'une plaque contenant des CSM endommagées et placez un bord droit, tel qu'une règle en plastique stérilisée, sur le rebord supérieur de la plaque. Un bord droit minimise la quantité de réglages rotationnels nécessaires pour la plaque lorsqu'elle sera ultérieurement placée sur la platine du microscope pour l'imagerie.Sans retirer le milieu, utilisez une pipette stérile de 200 microlitres guidée par le bord droit stérile pour effectuer quatre rayures parallèles sur la plaque, espacées d'environ cinq millimètres et mesurant 50 millimètres de long. La création de plusieurs rayures sur une plaque de 60 millimètres n'altère pas le microenvironnement d'une manière qui affecte la migration cellulaire des CSM, mais cela peut être une considération pour d'autres types cellulaires. Aspirez le milieu et rincez délicatement la plaque avec deux millilitres de milieu complet préchauffé.Cela empêche les cellules de s'adhérer au centre de la rayure et élimine les cellules qui ont été détachées par le rayage. Remplacer par quatre millilitres de milieu complet frais en utilisant un marqueur permanent stérile pour étiqueter chaque rayure de un à quatre sur la face inférieure de la plaque à des emplacements qui n'interféreront pas avec l'acquisition d'images. Des images initiales de chaque rayure doivent être prises, car il est important de comparer des images provenant de la même rayure avant et après la migration, étant donné qu'il peut exister des variations de la largeur des rayures.Si le test de rayure est effectué sur plusieurs plaques, il est recommandé de prendre d'abord les images initiales de toutes les rayures d'une même plaque avant de réaliser les rayures sur la plaque suivante. Utilisez un microscope inversé à contraste de phase équipé d'une caméra pour acquérir les images nécessaires à l'analyse. Placez la plaque de culture sur le microscope et utilisez l'objectif de faible grossissement pour localiser la rayure.Numéro un. Il est impératif que l’incision apparaisse parfaitement horizontale à l’écran tout en restant complètement horizontale et centrée dans le champ de vision ; obtenez autant d’images que nécessaire pour couvrir 90 % de la longueur de l’incision. Acquérez des images provenant de parties distinctes de l’incision sans chevauchement entre les images.Ne pas prendre d'images sur les 5 % initiaux et finaux de la longueur de la rayure, car la réfraction de la lumière sur les bords de la boîte de culture surexpose les images, les rendant impossibles à analyser. Enregistrer les images de la rayure numéro un dans un dossier. Obtenir les images des rayures deux, trois et quatre de la même manière, et enregistrer les images de chaque rayure dans un dossier séparé.Replacer immédiatement les plaques dans l'incubateur après cette première imagerie. Laisser les cellules migrer pendant quatre à sept heures avant de commencer ce test. Télécharger le logiciel ImageJ et installer le module complémentaire « wound healing tool ».Ouvrez le fichier image dans ImageJ, puis cliquez sur Traitement et recherchez les contours pour mettre en évidence les cellules entourant la rayure à l’aide de l’outil de cicatrisation des plaies. Pour calculer la surface de la rayure, cliquez sur Image, Réglage et Seuil de couleur, puis dans le menu déroulant intitulé Couleur du seuil, modifiez la valeur en BNW dans le menu Seuil de couleur. Déplacez complètement le curseur inférieur vers la droite pour rendre l’image entièrement noire, puis ajustez le curseur supérieur afin d’obtenir un contraste maximal entre la rayure et le front cellulaire.Réglez lentement le curseur de luminosité supérieur de gauche à droite jusqu'à ce que l'image affiche clairement le contour de la rayure. Une fois les bords de la rayure identifiés, cliquez sur davantage d'outils. Dans la barre d'outils J de l'image, sélectionnez l'outil d'analyse de cicatrisation par IRM dans le menu déroulant, puis appuyez sur le bouton M pour surligner la zone de la rayure et obtenir la surface calculée.Dans une fenêtre contextuelle de résultats, copiez et collez tous les nombres de la fenêtre de résultats dans une feuille de calcul Excel. Veillez à séparer les données provenant de chaque rayure individuelle. Après que les cellules se soient déplacées pendant quatre à sept heures, répétez la procédure d'acquisition d'images pour les rayures, en imagerie les plaques dans le même ordre que celui dans lequel elles ont été rayées, afin que les cellules de chaque plaque aient eu un temps égal pour migrer.Les cellules peuvent être observées à plusieurs points temporels selon leur sensibilité aux variations de température et de pH. Les images finales de la rayure sont ensuite analysées à l’aide d’ImageJ de la même manière que celle démontrée pour les images initiales de la rayure. Les surfaces de la rayure peuvent également être calculées afin de quantifier la migration, correct.La confluence est essentielle pour la réussite du test de rayure. Une rayure réussie sur des CSM pulmonaires murins à une confluence de 95 % est illustrée ici. En revanche, une confluence de 70 % est trop faible pour une rayure réussie et peut produire des limites artéfactuelles.Voici des images originales représentatives avant et après la migration, avec les limites correspondantes de la zone grattée telles que définies par le logiciel d'imagerie. Ces graphiques montrent la surface moyenne calculée de la zone grattée en pixels pour chacune des quatre rayures réalisées sur une plaque de CSM pulmonaires murins à une confluence de 95 %, soit avant, soit après la migration, après exposition à un extrait de fumée de cigarette à 0 % ou 4 %. La comparaison de la variation moyenne calculée de la surface de la zone grattée a révélé une migration moindre des CSM pulmonaires murins après exposition à l'extrait de fumée de cigarette à 4 %.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'optimiser et de surveiller attentivement la confluence cellulaire en fonction du type cellulaire utilisé, ainsi que de s'exercer à réaliser les rayures afin de les rendre aussi uniformes que possible. Après cette procédure, d'autres techniques telles que l'immunohistochimie peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant les modifications et l'expression des protéines qui pourraient affecter la migration cellulaire.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

L’étude de la migration précoce des cellules endothéliales (EEC) est importante pour comprendre la physiopathologie de certaines maladies et pour identifier potentiellement de nouvelles stratégies d’intervention thérapeutique. Le protocole suivant décrit les techniques d’évaluation de la migration cellulaire qui ont été adaptées pour l’étude de l’EEC.

Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques

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Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

Ce manuscrit décrit comment incision-comme des lésions sur des monocouches de cellules épithéliales cultivées idéalement modèle embobiné guérison in vitro, permettant pour l’imagerie confocale ou microscopie à balayage de laser, et qui peuvent fournir de haute qualité données quantitatives et qualitatives pour l’étude de comportement de la cellule tant les mécanismes impliqués dans la migration.

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Un test de migration à gratter rentable et adaptable

Grâce à l’intégration de la conception de l’expérience d’interaction et de l’analyse des exigences de l’utilisateur, nous introduisons un grattoir cellulaire innovant qui améliore les tests de cicatrisation cellulaire en termes de reproductibilité, de fiabilité, de praticité, d’intégrité cellulaire et d’expérience utilisateur.

Un outil permettant de créer automatiquement des espaces acellulaires stables et reproductibles afin d’améliorer la fiabilité du dosage de la cicatrisation cellulaire

Cette étude présente le test de migration bidimensionnel (2D) et le test de germination de sphéroïdes tridimensionnel (3D), ainsi que leurs méthodes d’analyse respectives en aval, y compris l’extraction d’ARN et l’immunocytochimie, comme des tests appropriés pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Étude de l’angiogenèse aux niveaux fonctionnel et moléculaire en exploitant le test de migration des plaies par égratignures et le test de germination des sphéroïdes

Ici, nous décrivons un modèle in vitro pour isoler et différencier les cellules épithéliales des voies respiratoires murines, en nous concentrant sur leur acclimatation à l’extrait chronique de fumée de cigarette (ECS). Le modèle pourrait être utilisé pour caractériser de manière exhaustive l’impact multi-omique de l’ECS, ce qui pourrait donner un aperçu des réponses cellulaires en cas d’exposition chronique à la fumée.

Modèle in vitro pour l’étude de la différenciation et des modifications de la multi-omique sur des cellules épithéliales des voies respiratoires murines stimulées par un extrait de fumée de cigarette

Découvrez l'optimisation du test de migration par blessure pour quantifier la capacité migratoire des cellules mésenchymateuses stromales pulmonaires murines après exposition à l'extrait soluble de fumée de cigarette.

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Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

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