Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

L’objectif global de ce test est de détecter les changements dans la capacité migratoire des cellules stromales mésenchymateuses pulmonaires après des dommages avec de l’extrait soluble de fumée de cigarette. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie régénérative pulmonaire, notamment comment la capacité migratoire des cellules progénitrices pulmonaires peut être améliorée pour aider à la réparation pulmonaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a été optimisée pour fournir de meilleures mesures quantitatives de la migration cellulaire tout en restant économique à réaliser et facile à personnaliser.

Dans cette démonstration, le test scratch sera utilisé pour quantifier la capacité migratoire des cellules stromales mésenchymateuses du poumon murin, ou CSM. Après exposition à de l’extrait soluble de fumée de cigarette, les CSM sont cultivées dans un milieu complet sur des plaques de 60 millimètres et endommagées comme décrit dans le texte du protocole. Une confluence appropriée est importante pour le test de rayure, car elle garantit que le logiciel d’imagerie peut identifier correctement les limites de la rayure.

Cet exemple montre des CSM à 95 % de confluence appropriée pour le grattage dans un environnement stérile. Retirez le couvercle d’une plaque de CSM endommagée et posez un bord droit, tel qu’une règle en plastique stérilisé, sur le bord supérieur de la plaque. Une règle droite minimise le nombre de réglages de rotation nécessaires pour la plaque lorsqu’elle est ensuite placée sur la platine du microscope pour l’imagerie.

Sans retirer le support, utilisez une pointe de pipette stérile de 200 microlitres guidée par le bord droit stérile pour faire quatre rayures parallèles sur la plaque, espacées d’environ cinq millimètres et longues de 50 millimètres. La génération de plusieurs rayures sur une plaque de 60 millimètres ne modifie pas le microenvironnement d’une manière qui affecte la migration cellulaire des CSM, mais peut être envisagée pour d’autres types de cellules. Aspirez le média et lavez délicatement la plaque avec deux millilitres de média complet préchauffé.

Cela empêche les cellules d’adhérer au centre de la rayure et élimine les cellules qui ont été desserrées par le grattage. Remplacer par quatre millilitres de milieu complet frais à l’aide d’un marqueur stérile et permanent : étiquetez chaque rayure de une à quatre sur la face inférieure de la plaque à des endroits qui n’interféreront pas avec l’imagerie. Les images initiales de chaque rayure doivent être prises car il est important que les images de la même rayure soient comparées avant et après la migration, car il peut y avoir des variations dans la largeur de la rayure.

Si le test de rayure est effectué sur plusieurs plaques, il est recommandé de prendre des images initiales de toutes les rayures sur une seule plaque avant que les rayures ne soient faites sur la plaque suivante. Utilisez un microscope à contraste de phase inversé avec une caméra pour acquérir les images nécessaires à l’analyse. Positionnez la plaque de culture sur le microscope et utilisez l’objectif de faible puissance pour localiser les rayures.

numéro un. Il est impératif que la rayure apparaisse complètement horizontale sur l’écran tout en gardant la rayure complètement horizontale et au centre du champ de vision, obtenir autant d’images que nécessaire pour englober 90 % de la longueur de la rayure. Obtenez des images à partir de parties distinctes de l’égratignure sans chevauchement entre les images.

Ne prenez pas d’images du premier et du dernier 5 % de la longueur de la rayure car la réfraction de la lumière sur les bords de la boîte de culture expose trop les images, les rendant impossibles à analyser. Enregistrez les images à partir de zéro, numéro un dans un dossier. Obtenez les images pour les rayures deux, trois et quatre de la même manière, et enregistrez les images de chaque rayure dans un dossier séparé.

Remettez les plaques dans l’incubateur immédiatement après cette première imagerie. Laissez les cellules migrer pendant quatre à sept heures avant de commencer ce test. Téléchargez le logiciel Image J et installez le plug-in de l’outil de cicatrisation.

Ouvrez le fichier image dans l’image J, puis cliquez sur Traiter et rechercher les bords pour mettre en évidence les cellules entourant l’égratignure pour l’outil de cicatrisation. Pour calculer la zone de rayure, cliquez sur ajuster l’image et le seuil de couleur, et dans le menu déroulant étiqueté couleur de seuil, remplacez la valeur par BNW dans le menu du seuil de couleur. Déplacez le curseur inférieur complètement vers la droite pour rendre l’image complètement noire, puis ajustez le curseur supérieur pour générer un contraste maximal entre l’égratignure et l’avant de la cellule.

Ajustez lentement le curseur de luminosité supérieur de gauche à droite jusqu’à ce que l’image affiche clairement le contour de la rayure. Une fois que les bords de l’égratignure ont été identifiés, cliquez sur plus d’outils. Dans la barre d’outils de l’image J, sélectionnez l’outil de cicatrisation des plaies IRM dans le menu déroulant et appuyez sur le bouton M pour mettre en surbrillance la zone de rayure et afficher la zone calculée.

Dans une fenêtre contextuelle de résultats, copiez et collez tous les nombres de la fenêtre de résultats dans une feuille de calcul Excel. Assurez-vous de séparer les données des rayures individuelles. Une fois que les cellules ont migré pendant quatre à sept heures, répétez la procédure d’acquisition d’images pour les rayures qui imagent les plaques dans le même ordre qu’elles ont été grattées afin que les cellules de chaque plaque aient eu le même temps de migrer.

Les cellules peuvent être imagées à plusieurs moments en fonction de leur sensibilité aux changements de température et de pH. Les images de rayures finales sont ensuite analysées à l’aide de l’image J de la même manière que pour les images de rayures initiales. Les zones de rayure peuvent également être calculées pour quantifier la migration, c’est correct.

La confluence est essentielle au succès du test de grattage. Un grattage réussi des CSM pulmonaires murines à 95 % de confluence est montré ici. En revanche, une confluence de 70 % est trop faible pour une rayure réussie et peut produire de fausses limites.

Il s’agit d’images originales représentatives de pré-migration et de post-migration avec des limites de zone de travail correspondantes telles que définies par le logiciel d’imagerie. Ces graphiques montrent la surface de rayure moyenne calculée en pixels pour chacune des quatre égratignures effectuées sur une plaque de CSM pulmonaires murines à 95 % de confluence avant ou après la migration avec une exposition à 0 % ou 4 % d’extrait de fumée de cigarette. Une comparaison de la variation moyenne calculée de la surface de grattage a révélé une migration moindre des CSM pulmonaires murines après exposition à 4 % d’extrait de fumée de cigarette.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser et de surveiller attentivement la confluence cellulaire pour le type de cellule particulier avec lequel nous travaillions et de s’entraîner à générer les rayures pour s’assurer qu’elles sont aussi uniformes que possible. À la suite de cette procédure, d’autres techniques telles que l’immunohistochimie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les altérations et l’expression des protéines qui peuvent affecter la migration cellulaire.