Optimisé de gratter Assay for In Vitro test de Migration cellulaire avec une caméra optique automatisée
8 août 2018
Ici, nous décrivons une procédure pour tester la cellule migration in vitro avec un microscope caméra optique automatisé. Le dosage zéro a été largement utilisé lorsque la fermeture de la rayure est suivie pour une période déterminée. Le microscope optique permet une détection fiable et bon marchée de la migration cellulaire.
Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez regarder les cellules en temps réel dans le microscope optique automatique. Les implications de ce traitement s’étendent à une thérapie des plaies chroniques ou du cancer où la migration joue un rôle crucial dans ces maladies. Commencez par laver une culture confluente de cellules HaCaT deux fois avec cinq millilitres de PBS stérile sans magnésium et sans calcium par lavage.
Ensuite, incubez les cellules avec un millilitre de trypsine dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq à huit minutes. Après avoir confirmé le détachement au microscope optique, arrêtez la réaction enzymatique avec neuf millilitres de milieu de culture complété par FBS. Et diluez les cellules à 7,5 fois 10 à la quatrième cellules par 250 microlitres de milieu plus la concentration FBS.
Ensuite, ensemencez 250 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à fond rond de 48 puits, et faites glisser doucement la plaque d’un côté à l’autre pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties sur le fond du puits. Transférez ensuite la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cultures ont atteint une confluence de 90 à 95 %, remplacez le surnageant dans chaque puits par 250 microlitres de milieu fraîchement préparé complété par 10 microgrammes par millilitre de mitomycine C, et remettez la plaque dans l’incubateur pendant deux heures supplémentaires.
À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS et ajoutez 250 microlitres de PBS frais dans chaque puits. Ensuite, utilisez une pointe de micropipette de 200 microlitres pour faire une rayure verticale dans chaque monocouche de cellule. Lorsque toutes les monocouches ont été grattées, remplacez le PBS dans chaque puits par 250 microlitres avec le stimulus peptidique d’intérêt et montez la plaque dans un système de caméra optique avec le couvercle intact.
Pour configurer la caméra optique, ouvrez la fenêtre d’acquisition et sélectionnez Cicatrisation des plaies. Sélectionnez le type de plaque et désélectionnez les puits non utilisés. Ensuite, cliquez sur activer et faites un clic droit sur l’un des puits pour ajuster la mise au point en fonction de la position des cellules.
Définissez la période des images sous l’intervalle d’image et définissez le nombre de répétitions pour s’adapter à la période souhaitée. Sélectionnez ensuite le type d’analyse approprié. Cliquez ensuite sur Démarrer pour commencer à imager les cellules.
Lorsqu’une plaie se produit, les cellules de la peau commencent à proliférer et à migrer à travers le lit de la plaie pour fermer la plaie, un processus qui peut être observé à travers la caméra optique. Après une incubation de 48 heures, le traitement par facteur de croissance endothéliale induit une fermeture de près de 95 % de la plaie, contre une fermeture de 38 % dans les puits témoins non traités, et de 33 et 62 % dans les cultures de lactoferrine et de lactoferricine respectivement. Le pourcentage de fermeture de la plaie déterminé à partir des changements de largeur de l’espace par rapport à la rayure initiale peut également être tracé pour chaque stimulus de croissance.
Cette vidéo décrit un protocole simple et efficace pour étudier la migration des kératinocytes à travers une égratignure faite dans une monocouche de cellules saines. Bien que les cellules utilisées dans ce test soient des cellules HaCaT, la méthode peut également être appliquée sur d’autres lignées cellulaires, des champignons ou même des bactéries, à condition qu’elles adhèrent au bas de la plaque de microtitration.
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Aperçu
Cet article décrit une procédure permettant de tester la migration cellulaire in vitro à l'aide d'un microscope optique automatisé équipé d'une caméra. Le test d'égratignure est présenté comme une méthode fiable pour observer la migration cellulaire au fil du temps.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Microscopie
- Techniques in vitro
Contexte général
- Le test de rayure est une technique largement utilisée pour l'étude de la migration cellulaire.
- Les microscopes optiques automatisés permettent une observation en temps réel des cellules.
- La compréhension de la migration cellulaire est cruciale pour les thérapies des plaies chroniques et du cancer.
- Cette méthode est économique et fiable pour détecter le déplacement cellulaire.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode fiable pour évaluer la migration cellulaire.
- Explorer les implications de la migration cellulaire dans le traitement des plaies chroniques et la thérapie anticancéreuse.
- Utiliser une microscopie optique automatisée pour une analyse en temps réel.
Méthodes utilisées
- Lavage des cultures confluentes de cellules HaCaT avec du PBS.
- Incubation des cellules avec de la trypsine pour détacher les cellules.
- Arrêt de la réaction enzymatique à l’aide du milieu de culture.
- Dilution des cellules à une concentration spécifique pour analyse.
Résultats principaux
- L'observation en temps réel de la migration cellulaire a été réalisée.
- La méthode s'est révélée efficace pour le suivi de la fermeture de la rayure.
- Les résultats peuvent orienter les stratégies thérapeutiques contre les plaies chroniques et le cancer.
- La microscopie automatisée améliore la fiabilité des évaluations de migration.
Conclusions
- Le microscope optique automatisé est un outil précieux pour l'étude de la migration cellulaire.
- Cette technique peut faire progresser la recherche dans les domaines de la cicatrisation des plaies chroniques et des thérapies contre le cancer.
- Des études supplémentaires pourraient élargir ses applications à divers contextes biologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les tests de migration cellulaire sont essentiels pour évaluer les candidats thérapeutiques dans les domaines de la cicatrisation des plaies et de l'oncologie, mais les tests de rayure traditionnels souffrent d'artéfacts au niveau des bords et de goulots d'étranglement liés à une analyse manuelle. Ce protocole optimisé remédie aux problèmes de reproductibilité en éliminant l'accumulation des cellules médiée par les cations et en intégrant un imagerie automatisée, permettant ainsi des mesures de migration cohérentes et quantitatives. Cette approche soutient la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques en fournissant des données fiables en temps réel sur les composés pro- et anti-migratoires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier des hypothèses thérapeutiques en quantifiant les changements de migration en réponse à des stimuli tels que la lactoferrine ou des facteurs de croissance.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité liée à l'analyse manuelle des rayures et aux fluctuations de température grâce à un imagerie optique automatisée.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des métriques quantitatives normalisées de fermeture de plaie à partir de sections de rayures identiques au fil du temps.
- Valeur opérationnelle : Élimine le cyclage et l'analyse laborieux des images, améliorant le débit pour le criblage de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Utilise des kératinocytes HaCaT pertinents pour la maladie afin de modéliser la migration épithéliale, soutenant ainsi l'alignement translationnel des biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Garantit la continuité des tests du stade de découverte à l'évaluation préclinique grâce à des protocoles automatisés et reproductibles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, en soutenant la vérification d'hypothèses lors de la phase initiale de découverte et en permettant l'identification quantitative de composés actifs grâce à l'inhibition ou la stimulation mesurable de la migration.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques en isolant la migration comme variable dépendante en réponse à des traitements par peptides ou cytokines.
- Criblage : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles (par exemple, % de fermeture de la plaie) permettant des comparaisons entre bibliothèques de composés ou variants protéiques.
- Analytique : Génère des données de migration en série temporelle adaptées aux comparaisons statistiques et à la modélisation dose-réponse.
- Recherche translationnelle : Offre une pertinence préclinique grâce à l'utilisation de cellules kératinocytes humaines et au contexte de cicatrisation des plaies.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme automatisée et réutilisable pour les tests de migration dans divers projets et types cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les essais de migration.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et l'extensibilité grâce à l'imagerie automatisée et à une préparation uniforme des blessures.
- Valeur stratégique : Permet de mieux évaluer les décisions d'aller/arrêt en fournissant dès les premières étapes du processus des données quantitatives fiables sur la migration.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des composés en fonction d'effets de migration validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire et en technique stérile pour la préparation de la monocouche.
- Dépend de systèmes automatisés de caméra optique dotés de capacités d'acquisition en temps réel et d'analyse.
- Exige une standardisation de la largeur et du chronométrage des rayures entre les puits pour obtenir des données comparables.
- Implique une optimisation des étapes de lavage au PBS afin de prévenir les artefacts de bord chez différentes lignées cellulaires.
- Limité aux cellules adhérentes compatibles avec l'attachement au fond des plaques de microtitration.
