Optimisé de gratter Assay for In Vitro test de Migration cellulaire avec une caméra optique automatisée

Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez regarder les cellules en temps réel dans le microscope optique automatique. Les implications de ce traitement s’étendent à une thérapie des plaies chroniques ou du cancer où la migration joue un rôle crucial dans ces maladies. Commencez par laver une culture confluente de cellules HaCaT deux fois avec cinq millilitres de PBS stérile sans magnésium et sans calcium par lavage.

Ensuite, incubez les cellules avec un millilitre de trypsine dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq à huit minutes. Après avoir confirmé le détachement au microscope optique, arrêtez la réaction enzymatique avec neuf millilitres de milieu de culture complété par FBS. Et diluez les cellules à 7,5 fois 10 à la quatrième cellules par 250 microlitres de milieu plus la concentration FBS.

Ensuite, ensemencez 250 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à fond rond de 48 puits, et faites glisser doucement la plaque d’un côté à l’autre pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties sur le fond du puits. Transférez ensuite la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cultures ont atteint une confluence de 90 à 95 %, remplacez le surnageant dans chaque puits par 250 microlitres de milieu fraîchement préparé complété par 10 microgrammes par millilitre de mitomycine C, et remettez la plaque dans l’incubateur pendant deux heures supplémentaires.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS et ajoutez 250 microlitres de PBS frais dans chaque puits. Ensuite, utilisez une pointe de micropipette de 200 microlitres pour faire une rayure verticale dans chaque monocouche de cellule. Lorsque toutes les monocouches ont été grattées, remplacez le PBS dans chaque puits par 250 microlitres avec le stimulus peptidique d’intérêt et montez la plaque dans un système de caméra optique avec le couvercle intact.

Pour configurer la caméra optique, ouvrez la fenêtre d’acquisition et sélectionnez Cicatrisation des plaies. Sélectionnez le type de plaque et désélectionnez les puits non utilisés. Ensuite, cliquez sur activer et faites un clic droit sur l’un des puits pour ajuster la mise au point en fonction de la position des cellules.

Définissez la période des images sous l’intervalle d’image et définissez le nombre de répétitions pour s’adapter à la période souhaitée. Sélectionnez ensuite le type d’analyse approprié. Cliquez ensuite sur Démarrer pour commencer à imager les cellules.

Lorsqu’une plaie se produit, les cellules de la peau commencent à proliférer et à migrer à travers le lit de la plaie pour fermer la plaie, un processus qui peut être observé à travers la caméra optique. Après une incubation de 48 heures, le traitement par facteur de croissance endothéliale induit une fermeture de près de 95 % de la plaie, contre une fermeture de 38 % dans les puits témoins non traités, et de 33 et 62 % dans les cultures de lactoferrine et de lactoferricine respectivement. Le pourcentage de fermeture de la plaie déterminé à partir des changements de largeur de l’espace par rapport à la rayure initiale peut également être tracé pour chaque stimulus de croissance.

Cette vidéo décrit un protocole simple et efficace pour étudier la migration des kératinocytes à travers une égratignure faite dans une monocouche de cellules saines. Bien que les cellules utilisées dans ce test soient des cellules HaCaT, la méthode peut également être appliquée sur d’autres lignées cellulaires, des champignons ou même des bactéries, à condition qu’elles adhèrent au bas de la plaque de microtitration.