Méthodes basées sur la microscopie pour l’évaluation de la Migration de cellules épithéliales lors In Vitro la cicatrisation des plaies

L’objectif global de ces procédures de plaies artificielles par culture de cellules épithéliales est d’étudier la migration cellulaire d’un point de vue quantitatif et qualitif, permettant d’évaluer les effets de traitements spécifiques d’intérêt sur la cicatrisation des plaies. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cicatrisation des plaies, car elle permet de caractériser précisément les rôles de processus de migration spécifiques lors de la perturbation épithéliale. Le principal avantage de cette approche est qu’elle permet de corréler les mesures de migration cellulaire avec les changements de comportement des marqueurs moléculaires pertinents.

L’implication de ces techniques s’étend à un traitement des plaies cliniques, car elles offrent une configuration pratique pour le dépistage précoce des médicaments et pour la fermeture des plaies. Généralement, dans cette méthode commencera en raison des difficultés à obtenir une reproductibilité cohérente dans les plaies avec une génération. Pour un test de grattage de plaie artificielle, commencez par ensemencer chaque puits d’une plaque de culture avec deux millilitres de cellules épithéliales d’intérêt dans un milieu complet.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours jusqu’à 100 % de confluence. Lorsque les cellules sont prêtes, lavez-les deux fois avec un milieu frais sans sérum, suivies de 24 heures de culture dans un milieu frais sans sérum. Le lendemain, placez la plaque dans une zone de travail stérile et faites glisser l’extrémité étroite d’une pointe de micro-pipette stérile au fond de chaque puits deux fois pour générer une plaie en forme de croix.

Un espace constant est obtenu en appliquant une pression constante et ferme tout en déplaçant doucement la pointe le long de la surface épithéliale. Une pression excessive déformera la pointe, provoquant un rayon de plaie irrégulier. Retirez délicatement le surnageant pour jeter les cellules détachées et ajoutez soigneusement un milieu frais sans sérum dans les puits.

À l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé connecté à une caméra de dispositif à couplage de charge, alignez le bord du champ du microscope avec l’intersection adjacente des rayures pour obtenir jusqu’à quatre images de référence de prétraitement de l’espace de rayure dans chaque puits. Lorsque toutes les images ont été acquises, remplacez le milieu dans les puits de traitement désignés par un milieu frais, complété par des traitements d’intérêt sélectionnés, et retournez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsqu’au moins une condition atteint environ 90 % de fermeture de l’espace entre les rayures, remplacez doucement le surnageant par un millilitre de formol à quatre pour cent dans du PBS pour une incubation de 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez doucement les cellules avec du PBS au moins trois fois pour éliminer tout excès de formol et imagez les puits comme nous venons de le démontrer, en utilisant les mêmes paramètres d’imagerie dans les zones de référence d’origine capturées après le grattage. Pour analyser les images à l’aide du logiciel de traitement d’image approprié, ouvrez l’image d’intérêt enregistrée en prétraitement et, dans le menu Image, définissez le type d’image sur 8 bits. Dans le menu Processus, sélectionnez le sous-menu Filtres et appliquez le filtrage des écarts.

Dans le menu Image, ouvrez le sous-menu Ajuster et réglez le seuil sur noir et blanc. Dans le menu Processus, sélectionnez le sous-menu Binaire et appliquez l’option Remplir les trous. Dans le menu Analyser, sélectionnez Définir les mesures et activez Zone.

Dessinez ensuite la zone mesurable, en suivant le contour du bord migrant pour délimiter l’espace. Dans le menu Analyser, sélectionnez Analyser les particules et enregistrez les valeurs de surface totale de la surface de la surface dessinée. Pour quantifier la migration absolue de chaque ensemble d’échantillons individuels en tant que différence entre les mesures de surface d’espace, exportez les valeurs de surface d’espace totale avant et après traitement dans une feuille de calcul et tracez les résultats de quantification.

Dans le cas d’un essai de front de migration artificielle, dans des conditions stériles, ajoutez une couche d’un maximum de 33 lamelles rondes stérilisées dans des plaques de culture vides de 10 centimètres. Lorsque la surface de la plaque est complètement recouverte, ensemencez doucement les cellules épithéliales d’intérêt à une concentration qui permet une confluence de 100 % après deux ou trois jours de culture. Si nécessaire, enfoncez doucement les lamelles à l’aide d’une pointe de micropipette stérile pour éviter qu’elles ne flottent.

Lorsque les cellules atteignent la confluence, remplacez le surnageant par un milieu sans sérum pour une autre culture de 24 heures. Ensuite, à l’aide d’une pince à pince stérile, transférez soigneusement une lamelle dans une nouvelle plaque de 10 centimètres contenant un milieu frais sans sérum, en prenant soin de tenir la lamelle le long de sa périphérie. Pour créer les plaies artificielles, faites glisser une lame de rasoir stérilisée d’avant en arrière sur chaque lamelle pour tracer une ligne transversale de trois à quatre millimètres au centre de chaque culture cellulaire afin de retirer complètement la bande monocouche centrale.

Prenez soin de placer le bord de la lame de rasoir fortement sur la surface de la lamelle lors de la plaie pour vous protéger contre une forme de bord irrégulière et la génération de parties épithéliales tombantes. Transférez jusqu’à quatre lamelles de plaie, côté cellulaire vers le haut, dans les puits individuels d’une plaque à six puits, contenant au moins deux millilitres de milieu sans sérum et lavez doucement chaque puits deux fois avec un milieu frais sans sérum pour éliminer toutes les cellules détachées. Lorsque toutes les cellules détachées ont été éliminées, remplacez délicatement le milieu de lavage par un milieu frais complété par les traitements d’intérêt, et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.

À la fin de la période expérimentale appropriée, fixez les cellules avec quatre pour cent de formol dans le PBS comme nous venons de le démontrer, et colorez les cellules avec les anticorps conjugués fluorescents appropriés d’intérêt. Ensuite, imagez les changements structurels survenant au bord avant migrant par microscopie à fluorescence selon les paramètres expérimentaux d’intérêt. Dans cette expérience, les espaces de la plaie ont été mesurés avant et après le traitement avec le facteur de croissance épidermique, un inducteur bien connu de la prolifération et de la migration des cellules épithéliales.

La migration absolue a ensuite été calculée comme la différence entre les surfaces d’espace avant et après traitement. Le traitement par facteur de croissance épidermique potentialise la dynamique du cytosquelette cellulaire, comme observé dans ces images de microscopie à balayage laser de la coloration de l’actine F des cellules contrôlées et stimulées par le facteur de croissance. De plus, une surexpression de c-Jun est observée avec une expression accrue de la protéine apparente dans les cellules adjacentes au front de migration.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier l’intégrité des bords de la plaie pour la présence de lambeaux de cellules épithéliales qui pourraient perturber la quantification de la migration. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer quantitativement et qualitativement le comportement migratoire de la