Profil d'expression génique de microbes infectant utilisant une plateforme numérique de codage de bar

L’objectif global de cette expérience est de mesurer avec précision l’expression des gènes d’un agent pathogène in vivo afin de faire la lumière sur la façon dont un agent pathogène s’adapte à l’environnement infectieux et cause des dommages à son hôte. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies infectieuses pour explorer la dynamique de l’expression des gènes pathogènes lors d’une infection réelle sur divers types de tissus et à plusieurs moments du sujet. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est très sensible et extrêmement reproductible.

Cette méthode permet de quantifier l’expression des gènes pathogènes à partir d’une infime quantité de tissus issus d’une infection réelle. Pour commencer à préparer les réactifs, ajoutez du 2-Mercaptoéthanol pour tamponner le RLT et mélangez bien. Préparez un mélange 25:24:1 d’une solution d’alcool isoamylique phénol-chloroforme.

Étiquetez les tubes d’homogénéisation de type M et refroidissez-les sur de la glace. Étiquetez deux tubes à bouchon à vis d’un millilitre et ajoutez environ 300 microlitres de billes de zircone dans chaque tube. Ayez les instruments suivants prêts à l’emploi, y compris un dissociateur de tissus, un batteur de billes, une centrifugeuse de table avec des adaptateurs pour tubes de 50 millilitres et plaques de 96 puits et un photomètre.

Retirez d’un congélateur à 80 degrés Celsius les reins précédemment congelés isolés de souris infectées par C. albicans et mettez-les sur de la glace. Ajoutez 1,2 millilitre de tampon RLT dans chaque rein. Ensuite, décantez chaque rein avec un tampon dans un tube d’homogénéisation de type M.

La quantité de RLT tampon utilisée est déterminée empiriquement. Trop de tampon RLT diluera la concentration de l’échantillon, tandis que trop peu rendra l’homogénat très visqueux et extrêmement difficile à manipuler. Ensuite, à l’aide d’un dissociateur tissulaire sur le réglage préchargé ARN 2.01, homogénéisez les reins.

Ensuite, centrifugez à 1000 x G pendant une minute. Transférez 600 microlitres de chaque homogénat dans un tube à bouchon à vis contenant des billes de zircone et conservez l’homogénat restant sur de la glace. Ajoutez 600 microlitres d’alcool isoamylique phénol-chloroforme dans chaque tube, fermez bien les couvercles et faites tourner le batteur à billes pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Centrifuger à 15 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube de microfuge de 1,5 millilitre, en ajoutant un volume égal de 70 % d’éthanol. Ensuite, chargez sur la colonne d’essorage et essorez à 8 000 x G.Avec 700 microlitres de tampon RW, lavez chaque colonne d’essorage une fois, suivie de deux lavages avec 500 microlitres de tampon RPE.

Transférez les colonnes dans des tubes de collecte secs et tournez une minute supplémentaire pour éliminer tout liquide restant. Enfin, utilisez 50 microlitres d’eau pour éluer l’ARN. Utilisez ensuite un spectrophotomètre à OD 216 animètres pour mesurer la concentration en ARN.

Pour effectuer le profilage de l’expression génique à l’aide d’un code-barres numérique, commencez par décongeler le jeu de codes rapporteurs et le jeu de codes de capture sur de la glace. Ajoutez 130 microlitres de tampon d’hybridation à l’ensemble de codes rapporteurs. Retournez pour mélanger et tournez.

Ajoutez ensuite 20 microlitres du mélange dans chacun des 12 tubes de réaction. Ajoutez ensuite 10 microgrammes d’ARN tissulaire total dans chaque tube et mélangez par pipetage. En fonction du modèle d’infection, de la taille de l’inoculum et de la souche pathogène utilisée, le pourcentage d’ARN pathogène dans l’ARN total varie de 0 à 2 %. Par conséquent, la quantité totale d’ARN à ajouter pour chacun doit être optimisée empiriquement.

Ajoutez maintenant cinq microlitres de code de capture défini sur chaque tube. Mélangez en retournant les tubes et tournez rapidement. Ensuite, incubez les réactions dans un thermocycleur à 65 degrés Celsius avec un couvercle chauffé pendant environ 18 heures.

Retirez une cartouche d’échantillon à 20 degrés Celsius et laissez-la se réchauffer à température ambiante. Retirez deux plaques de réactif de quatre degrés Celsius et faites-les tourner dans une centrifugeuse de table à 670 x G pendant deux minutes. Ensuite, configurez la station de préparation en suivant les instructions étape par étape à l’écran, en sélectionnant l’option haute sensibilité.

Retirez ensuite les réactions du thermocycleur et chargez immédiatement la station de préparation. Après avoir exécuté le programme haute sensibilité de trois heures, retirez la cartouche et utilisez du ruban adhésif transparent pour sceller les voies. Appliquez de l’huile minérale au bas de la cartouche si nécessaire.

Chargez ensuite la cartouche sur l’analyseur numérique. Configurez l’analyseur numérique en suivant les instructions étape par étape à l’écran, en sélectionnant l’option de balayage haute résolution. Après avoir exécuté le programme de numérisation, téléchargez les résultats ou choisissez de les recevoir par e-mail et importez les données brutes dans le logiciel du fabricant.

Analysez les données selon le protocole texte. Le protocole présenté dans cette vidéo présente l’avantage unique d’utiliser à la fois une sonde de capture et une sonde de rapport pour augmenter la spécificité et réduire le bruit de l’ARN hôte. Comme le montre le tableau ci-dessous, les numérations brutes de fond d’un échantillon de tissu non infecté étaient toutes inférieures à 10, tandis que les numérations brutes de deux échantillons de tissus infectés étaient toutes supérieures à 10.

Les comptages bruts de deux échantillons biologiques présentaient une très bonne corrélation avec une valeur R au carré de 0,945. La plate-forme offre également une plage dynamique suffisante pour englober les niveaux d’expression biologique naturelle. À l’aide d’un ensemble de sondes spécifiant 248 gènes de réponse environnementale, deux phases d’expression des gènes de l’agent pathogène ont été déterminées.

Une réponse précoce à l’expression génique comprend des gènes dont les niveaux d’ARN sont significativement différents entre l’inoculum et les échantillons 12 heures après l’infection. Une réponse tardive à l’expression génique a également été découverte, qui comprend des gènes dont les niveaux d’ARN sont significativement différents entre les échantillons de 12 heures et les 48 heures après l’infection. Ces résultats indiquent que l’expression du gène C. albicans est régulée dynamiquement lors de l’infection invasive d’un hôte mammifère.

Cette méthode est simple et rapide. L’ensemble de la procédure, de la collecte des tissus à l’expression des données, nécessite moins de 48 heures. Le temps de manipulation est d’environ quatre heures pour 12 échantillons.

Bien que cette méthode soit développée pour capturer l’expression des gènes pathogènes in vivo, elle peut également être utilisée pour répondre à l’expression des gènes de l’hôte. Par conséquent, les chercheurs peuvent obtenir simultanément des informations utiles des deux côtés d’une infection.