Profil d'expression génique de microbes infectant utilisant une plateforme numérique de codage de bar

L'objectif général de cette expérience est de mesurer précisément l'expression des gènes pathogènes in vivo afin de comprendre comment un agent pathogène s'adapte à l'environnement infectieux et provoque des dommages à son hôte. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies infectieuses pour explorer la dynamique d'expression des gènes pathogènes durant une infection réelle, sur divers types de tissus et à plusieurs points temporels. Le principal avantage de cette méthode est sa grande sensibilité et sa reproductibilité extrême.

Cette méthode rend possible la quantification de l'expression génique des agents pathogènes à partir d'une quantité minime de tissus provenant d'une infection réelle. Pour commencer la préparation des réactifs, ajoutez du 2-mercaptoéthanol au tampon RLT et mélangez soigneusement. Préparez un mélange 25:24:1 de solution de phénol-chloroforme-alcool isoamylique.

Étiqueter des tubes de type M pour l'homogénéisation et les refroidir sur de la glace. Étiqueter des tubes filetés de deux millilitres et ajouter environ 300 microlitres de billes de zircone dans chaque tube. Avoir les instruments suivants prêts à l'emploi : un dissociateur de tissus, un broyeur à billes, une centrifugeuse de table équipée d'adaptateurs pour tubes de 50 millilitres et plaques de 96 puits, ainsi qu'un photomètre.

Retirer les reins préalablement congelés, isolés de souris infectées par C.albicans, d'un congélateur à -80 °C et les placer sur de la glace. Ajouter 1,2 millilitre de tampon RLT à chaque rein. Ensuite, verser délicatement chaque rein avec le tampon dans un tube d'homogénéisation de type M.

La quantité de tampon RLT utilisée est déterminée empiriquement. Un excès de tampon RLT diluera la concentration de l'échantillon, tandis qu'une quantité insuffisante rendra l'homogénat très visqueux et extrêmement difficile à manipuler. Ensuite, à l’aide d’un dissociateur tissulaire réglé sur le programme prédéfini RNA 2.01, homogénéisez les reins.

Ensuite, centrifuger à 1000 x G pendant une minute. Transférer 600 microlitres de chaque homogénat dans un tube à vis contenant des billes de zircone et conserver le reste de l'homogénat sur de la glace. Ajouter 600 microlitres de phénol-chloroforme-alcool isoamylique à chaque tube, fermer hermétiquement les couvercles et vortexer sur l'agitateur à billes pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Centrifuger à 15 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, en ajoutant un volume égal d'éthanol à 70 %. Puis charger sur la colonne de centrifugation et centrifuger à 8 000 ×g. Laver chaque colonne de centrifugation une fois avec 700 microlitres de tampon RW, suivi de deux lavages avec 500 microlitres de tampon RPE.

Transférez les colonnes dans des tubes de collecte secs et faites-les centrifuger une minute supplémentaire afin d'éliminer tout liquide résiduel. Enfin, utilisez 50 microlitres d'eau pour éluer l'ARN. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre à une OD de 216 nanomètres pour mesurer la concentration en ARN.

Pour réaliser un profilage de l'expression génique à l'aide d'un codage numérique par séquences barres, commencez par décongeler le jeu de codes rapporteurs et le jeu de codes de capture sur de la glace. Ajoutez 130 microlitres de tampon d'hybridation au jeu de codes rapporteurs. Inversez délicatement pour mélanger, puis effectuez une brève centrifugation.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres du mélange à chacun des 12 tubes de réaction. Puis ajoutez 10 microgrammes d'ARN total tissulaire à chaque tube et mélangez à l’aide d’une pipette. Selon le modèle d’infection, la taille de l’inoculum et la souche du pathogène utilisée, le pourcentage d’ARN du pathogène par rapport à l’ARN total varie de 0 à 2 %. Par conséquent, la quantité totale d’ARN à ajouter pour chaque échantillon doit être optimisée empiriquement.

Ajoutez maintenant cinq microlitres de jeu de codes de capture à chaque tube. Mélangez en retournant les tubes et centrifugez brièvement. Incubez ensuite les réactions dans un thermocycleur à 65 degrés Celsius avec un couvercle chauffant pendant environ 18 heures.

Retirer une cartouche d'échantillon à 20 degrés celsius et la laisser atteindre la température ambiante. Retirer deux plaques de réactifs à quatre degrés celsius et les centrifuger dans une centrifugeuse de table à 670 x g pendant deux minutes. Ensuite, configurer la station de préparation en suivant les instructions étape par étape à l'écran, en sélectionnant l'option haute sensibilité.

Ensuite, retirez les réactions du thermocycleur et chargez-les immédiatement sur la station de préparation. Après avoir exécuté le programme à haute sensibilité de trois heures, retirez la cartouche et utilisez un ruban adhésif transparent pour sceller les pistes. Appliquez de l'huile minérale sur le fond de la cartouche si nécessaire.

Ensuite, chargez la cartouche dans l'analyseur numérique. Configurez l'analyseur numérique en suivant les instructions étape par étape affichées à l'écran, en sélectionnant l'option de numérisation haute résolution. Après avoir exécuté le programme de numérisation, téléchargez les résultats ou choisissez de les recevoir par courrier électronique, puis importez les données brutes dans le logiciel du fabricant.

Analyser les données conformément au protocole décrit dans le texte. Le protocole présenté dans cette vidéo présente l'avantage unique d'utiliser à la fois une sonde de capture et une sonde rapporteur afin d'augmenter la spécificité et de réduire le bruit provenant de l'ARN de l'hôte. Comme illustré ici, les valeurs brutes du fond parasite provenant d'un échantillon de tissu non infecté étaient toutes inférieures à 10, tandis que les valeurs brutes provenant de deux échantillons de tissu infectés étaient toutes supérieures à 10.

Les décomptes bruts de deux échantillons biologiques présentaient une très bonne corrélation, avec une valeur de R carré de 0,945. La plateforme offre également une gamme dynamique suffisante pour couvrir les niveaux d'expression biologique naturels. À l'aide d'un ensemble de sondes ciblant 248 gènes de réponse environnementale, deux phases d'expression génique du pathogène ont été déterminées.

Une réponse précoce d'expression génique comprend des gènes dont les niveaux d'ARN sont significativement différents entre les échantillons d'inoculum et ceux prélevés 12 heures après l'infection. Une réponse d'expression génique tardive a également été identifiée, comprenant des gènes dont les niveaux d'ARN diffèrent significativement entre le point à 12 heures et celui à 48 heures après l'infection. Ces résultats indiquent que l'expression génique de C.albicans est régulée de manière dynamique pendant l'infection invasive d'un hôte mammalien.

Cette méthode est simple et rapide. L'ensemble de la procédure, de la collecte des tissus à l'expression des données, nécessite moins de 48 heures. Le temps d'intervention est d'environ quatre heures pour 12 échantillons.

Bien que cette méthode ait été mise au point pour capturer l'expression génique des agents pathogènes in vivo, elle peut également être utilisée pour analyser l'expression génique de l'hôte. Les chercheurs peuvent ainsi obtenir des informations utiles des deux côtés d'une infection simultanément.