Code-barres génétique avec protéines fluorescentes pour des applications multiplexés

L’objectif global de l’expérience suivante est d’établir un code-barres fluorescent sur des cellules de mammifères afin d’améliorer les tests biologiques multiplexés à haut débit qui reposent sur des lectures fluorescentes distinctes. Pour ce faire, des particules rétrovirales sont utilisées pour exprimer de manière stable des protéines fluorescentes dans les cellules de mammifères, leur codant ainsi à barres. Ensuite, un tri cellulaire activé par fluorescence est effectué pour obtenir des populations clonales à code-barres.

Les populations clonales sont ensuite amplifiées, combinées et analysées par cytométrie en flux pour confirmer qu’elles peuvent être distinguées les unes des autres et donc être utilisées simultanément. Enfin, les lignées cellulaires à code-barres sont transduites avec un test marqué. Les protéines et l’activité biologique sont surveillées à l’aide de canaux fluorescents distincts des canaux à code-barres.

Les résultats démontrent l’utilité du revêtement fluorescent des cellules de mammifères pour des applications multiplexées dans un environnement à haut débit. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes qui nécessitent un calibrage minutieux de l’anticorps ou du colorant est qu’une fois que les lignées cellulaires génétiquement codées sont établies, elles ne nécessitent aucune manipulation supplémentaire et, comme la protéine d’intérêt est exprimée pendant de longues périodes, elles sont utilisées davantage pour les adaptations biologiques. Le couplage de lignées cellulaires fluorescentes génétiquement codées à barres avec des tests de surface nous permet d’étudier les fonctions ou les effets biologiques de manière indépendante dans un format à débit hydro.

Dans notre exemple, nous utilisons un revêtement de barre génétique fluorescent pour surveiller le clivage de différents substrats viraux par multiplexage. Le test peut être exploité davantage pour étudier les machines impliquées dans le clivage et pour la découverte de médicaments à haut débit. La veille de la transfection, ensemencez une plaque de 10 centimètres avec 2,5 fois 10 à la sixième cellule Phoenix GP en DMEM avec 10 % FBS.

Cette lignée cellulaire d’emballage exprime de manière stable les protéines gag et pole pour la formation de particules rétrovirales en transe. Le jour de la transfection, utilisez un microscope à fond clair pour examiner les cellules. Les cellules doivent être saines et adhérer à la plaque en une monocouche pour être utilisées pour la transfection.

Ensuite, préparez le mélange de transfection de l’ADN à 125 microlitres de sérum libre. DMEM. Ajouter trois microgrammes de vecteur de glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire, P-C-I-V-S-V-G, et trois microgrammes de vecteur de transfert portant le gène de protéine fluorescente d’intérêt, ajouter 15 microlitres de réactif de transfection de polyétheramine et mélanger pour obtenir des particules virales portant différents marqueurs de protéines fluorescentes. Effectuez chaque transfection indépendamment avec le marqueur de votre choix pour ce faire.

Incuber chaque mélange à température ambiante pendant 15 minutes après le transfet d’incubation en ajoutant le mélange dans les cellules. Dropwise incubez ensuite les plaques à 37 degrés Celsius. En option, après 24 heures, remplacez le milieu par sept millilitres de milieu frais.

Bien que cela puisse améliorer la santé cellulaire, cela peut diminuer la charge virale dans le surnageant. 48 heures après la transfection, utilisez une pipette pour transférer le surnageant, qui contient les particules virales, dans une seringue de 10 millilitres. Équipé d’un filtre en polytétrafluoroéthylène de 0,20 micromolaire pour appuyer sur le piston afin de distribuer le filtrat dans deux tubes de micro-centrifugeuse d’un millilitre.

Réservez une aliquote de deux millilitres pour une utilisation immédiate. Placez le reste du snat viral et des aliquotes sur de la glace et transférez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés 24 heures avant la transduction dans chaque puits d’une graine à six puits de 2,0 à 3,0 fois 10 à la cinquième cellule adhérente ici 2 9 3 cellules T sont utilisées le lendemain. Pour transduire les cellules adhérentes, retirez le média existant de la plaque.

Ajoutez cinq microgrammes par millilitre de poly cerveau aux deux millilitres de sinus viral précédemment collecté, et ajoutez soigneusement le mélange aux cellules. Scellez les assiettes avec du parfum. Placez ensuite les assiettes dans un seau suspendu.

Centrifugeuse centrifugeuse à 1500 fois G pendant 120 minutes à 32 degrés Celsius. Après la rotation, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après 24 heures, remplacez les cellules au moins 72 heures.

Post-transduction. Préparez-vous à analyser les cellules transduites par cytométrie en flux pour quantifier le pourcentage de taux de transduction. Tout d’abord, en utilisant une lignée cellulaire comparable transduite comme contrôle négatif, assurez-vous que les portes sont correctement réglées dans les bons canaux.

Réglez le paramètre tension du canal de sorte que la population négative soit inférieure à la valeur de 10 puissance tierce sur chaque axe fluorescent d’intérêt. Ensuite, définissez les portes de la fluorescence positive comme des événements qui apparaissent au-delà de celui du contrôle négatif. Ensuite, à l’aide des cellules transduites, déterminez le pourcentage positif pour le canal fluorescent spécifique.

Triez les cellules dans des tubes coniques de 15 millilitres contenant un millilitre de 100 % FBS. Ensuite, faites tourner les populations triées dans un seau suspendu. Centrifugeuse à rotor à 524 fois G à 32 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après la rotation, réintroduisez les cellules dans un millilitre de milieu frais, puis ensemencez deux fois 10 aux six cellules dans deux millilitres de DMEM sur une plaque de six centimètres. À cette concentration, la confluence est inférieure à 60 % et permettra la croissance et la division pendant au moins deux jours. Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant plusieurs jours pour laisser le temps à l’amplification.

Les populations clonales peuvent être générées à partir des cellules initialement transduites ou des cellules triées. Le tri des populations serrées en fonction de la fluorescence choisie plutôt que des clones individuels à ce stade garantit une population de secours pour la sélection future. Si nécessaire, réglez les portes pour le tri en fonction des populations d’intérêt, assurez-vous que les portes sont séparées d’au moins une échelle logarithmique Pour obtenir des populations distinctes à l’aide d’une unité de dépôt de cellules automatisée, triez les cellules individuelles en plaques de 96 puits, notez qu’il y aura en moyenne une cellule par puits.

Certains puits peuvent ne pas avoir de cellules et d’autres peuvent en avoir plus d’un. Tri, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant au moins deux semaines pour amplifier les clones individuels. Examinez régulièrement les cellules au microscope pour vous assurer que les populations croissantes proviennent de cellules individuelles et non de plus d’une.

Assurez-vous également que les cellules ne deviennent pas envahies après deux semaines. Criblez les populations clonales présumées par cytométrie en flux et comparez-les à une population témoin négative. Les vraies populations clonales devraient avoir des modèles de fluorescence très serrés.

Choisissez les populations les plus distinctes en fonction de l’intensité moyenne et de la tension de la population. Amplifiez-les au besoin ou stockez les stocks dans un milieu de congélation avec 10 % de DMSO à moins 80 degrés Celsius pendant de courtes périodes ou de l’azote liquide pendant plus longtemps. Ensuite, pour tester si les populations clonales peuvent être utilisées avec succès dans un système de criblage multiplex à haut débit.

Choisissez un ensemble de clones avec des spectres d’absorption, d’émission et/ou d’intensités différentes, et combinez-les dans une seule graine de tube. 50 000 cellules combinées dans 200 microlitres de DMEM supplémenté dans chaque puits d’une plaque de 96 puits dans des tubes séparés. Préparez des commandes négatives et monochromes à utiliser pour définir les paramètres et les valeurs de compensation au cytomètre en flux.

Définissez les valeurs de compensation. Analysez ensuite l’échantillon pour vous assurer que chacune des lignées cellulaires fluorescentes indépendantes établies peut être distinguée. Pour adapter les lignées cellulaires à code-barres à une application biologique, sélectionnez d’abord des éléments de test qui ont été conçus de telle sorte qu’ils sont couplés à un marqueur ou à une protéine fluorescente dans le cadre d’une fusion ou par le biais d’un site d’entrée interne du ribosome.

Ires, qui permet une détection simple par cytométrie en flux Western Blot ou une microscopie. Le système utilisé ici consiste en un test biologique dans lequel une protéine d’enveloppe du VIH est exprimée à la surface de la cellule, exposant son HA et ses marqueurs de drapeau. La protéine de dosage est exprimée dans une cellule à code-barres qui exprime la tomate TD.

Le clivage de la protéine peut être surveillé par coloration avec un anticorps anti-drapeau marqué FSE. Lorsque la protéine n’est pas clivée, une coloration est observée, mais lorsque la protéine est clivée, le marquage de fluorescence vert n’est plus évident. Pour établir le test biologique dans les cellules à code-barres, transduisez-les avec des particules virales qui contiennent les éléments de test de choix.

Ajouter du SUP natin viral aux cellules de votre choix et faire tourner par centrifugation. Ensuite, incubez les cellules avec des anticorps anti-HA marqués par fluorescence. Triez ensuite les cellules à code-barres pour isoler celles qui contiennent des éléments de dosage positifs pour ha.

Enfin, ils ont combiné des lignées cellulaires distinctes à code-barres. Chacun contenant un essai portant un substrat différent. Incuber le mélange de cellules avec des anticorps conjugués Anti-Flag et ZI et les analyser par cytométrie en flux pour déterminer si un clivage de la protéine s’est produit afin de remonter le test, d’analyser ou de décoder les populations dans le canal approprié où les lignées cellulaires distinctes génétiquement codées à barres peuvent être distinguées ici.

Le canal PE de la tomate TD décode ensuite la nature du substrat en analysant dans le canal fite pour révéler la population positive à tester pour le clivage des protéines exprimées en surface dans la voie sécrétoire. Sub T une cellule pour un code-barres fluorescent pour exprimer la tomate TD et triée en trois populations à différentes intensités. Chacune des populations a ensuite été transduite avec un rétrovirus différent pour induire l’expression de la protéine d’enveloppe du VIH de type sauvage, de la protéine d’enveloppe du VIH mutante ou du virus de la dengue.

Protéine limite PMR, chacune flanquée d’un drapeau et d’étiquettes HA. Les cellules transduites ont été incubées avec des anticorps anti HA et anti-Flag. Une coloration anti-HA a été effectuée pour confirmer la présence de la protéine de test modifiée, tandis qu’une coloration anti-drapeau a été effectuée pour déterminer si elle était clivée.

Lorsque des populations combinées non colorées ont été analysées par cytométrie en flux, les populations clonales ont été distinguées sur la base du code-barres de la tomate TD, mais indiscernables sur le canal fite. En revanche, lorsque les mêmes populations ont été colorées avec l’anticorps flage, une population était positive pour flagg. Sur la base du code-barres, cette population peut facilement être identifiée comme la population porteuse de l’enveloppe mutante du VIH.

Maintenant, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’utiliser la technologie des rétrovalves avec la cytométrie en flux. Afin d’établir des lignées cellulaires fluorescentes génétiquement codées à barres, quatre applications biologiques dans un format multiplex, la possibilité de coupler des cellules fluorescentes génétiquement codées à barres avec des tests cellulaires dans un format multiplex améliore considérablement les capacités à haut débit. Une fois les lignées cellulaires générées, il est important de les congeler.

Ensuite, décongelez-les périodiquement, réanalysez-les et libérez-les. Bien que la génération de lignées cellulaires fluorescentes génétiquement codées puisse prendre du temps au début, une fois établies, elles améliorent considérablement la répétabilité et la robustesse des applications futures.