Fast Processing Enzymatic des protéines pour MS de détection avec un microréacteur Flow-through

L'objectif général de ce protocole est de décrire la fabrication d'un microréacteur tryptique en flux continu qui effectue une digestion enzymatique rapide des protéines, permettant ainsi leur identification par spectrométrie de masse à ionisation électrospray. Cette méthode peut aider à illustrer la séquence d'acides aminés de protéines isolées et purifiées, afin de faciliter la caractérisation ultérieure de leur structure et de leur fonction. Le principal avantage de ce protocole réside dans sa rapidité, son faible coût et sa facilité d'intégration dans des flux de travail utilisant des plateformes microfabriquées.

Pour commencer, utilisez un coupe-capillaires en verre pour couper le tube capillaire plus grand à une longueur de sept à huit centimètres, et le plus petit à une longueur de trois à cinq centimètres. Utilisez un microscope pour vérifier que les deux extrémités capillaires présentent une coupe propre et droite, sans bavures proéminentes. Insérez le capillaire plus petit d’environ six millimètres dans une extrémité du capillaire plus grand.

Ensuite, utilisez un coton-tige pour appliquer une petite goutte de colle autour de la jonction des capillaires, puis laissez la colle polymériser toute la nuit à température ambiante. Ensuite, coupez le capillaire inséré à une longueur d'environ 10 à 15 millimètres. Cette extrémité servira d'émetteur pour l'ionisation par électrospray.

Insérez l'extrémité opposée du capillaire de plus grand diamètre dans un tube PEEK de 1/32 de pouce préalablement coupé entre quatre et cinq centimètres de longueur et relié à un raccord PEEK. Ensuite, insérez et serrez le morceau de cinq centimètres de longueur de tube PTFE 1/16 dans l'autre extrémité du raccord. Dans un flacon en verre propre et sec de deux millilitres, pesez quatre milligrammes de particules C18, puis ajoutez 0,5 millilitre d'isopropanol.

Fermer le flacon. Le placer dans un bain ultrasonique et soniquer afin de disperser uniformément les particules dans la solution. Ensuite, utiliser une seringue de 250 microlitres pour prélever 200 microlitres de la suspension C18.

Insérez la seringue dans le tube en PTFE de 1/16 de pouce et délivrez lentement la suspension dans le gros capillaire. Observez au microscope le remplissage du capillaire par les particules, jusqu'à l'obtention d'une hauteur d'empaquetage de deux à trois millimètres. Le petit tube capillaire retient ces particules dans le microréacteur grâce à un effet de clé de voûte.

Enfin, rincez le microréacteur avec 50 microlitres d'une solution à 50-50 d'eau et d'acétonitrile, suivie de 50 microlitres d'une solution contenant 49 microlitres d'eau mélangés à un microlitre d'acétonitrile. Débranchez le microréacteur capillaire de l'union PEEK et reliez-le à un té PEEK. Insérez ensuite un fil de platine d'une longueur de deux centimètres, gainé d'une gaine PEEK de 1/32 pouce, afin d'assurer une connexion étanche dans la ramification latérale du té PEEK.

Relier un capillaire d'échantillon d'un demi-mètre de longueur à l'extrémité opposée du T en PEEK. Utiliser un manchon en PEEK de 1/32 de pouce pour assurer une connexion étanche. Fixer solidement le T en PEEK sur la platine XYZ.

Et positionnez l'émulseur d'ionisation par électrospray à environ deux millimètres de l'entrée capillaire du spectromètre de masse. Ensuite, reliez le fil de platine à la source d'alimentation d'ionisation par électrospray du spectromètre de masse. Reliez également l'extrémité opposée du capillaire de transfert d'échantillon à l'union en acier inoxydable, en utilisant un manchon PEEK de 1/16 de pouce pour assurer une connexion étanche.

Ensuite, connectez un morceau de tube en PTFE d'une longueur de quatre à cinq centimètres et d'un diamètre de 1/16 de pouce à l'extrémité opposée du raccord en acier inoxydable. Saisissez les paramètres d'acquisition des données de spectrométrie de masse en tandem tels que décrits dans le protocole textuel accompagnant dans le logiciel qui commande l'appareil de spectrométrie de masse. Enregistrez-les sous forme de fichier méthode afin de préparer le dispositif pour effectuer l'analyse.

Le système de spectrométrie de masse LTQ est équipé d'une source ESI modifiée comprenant une platine XYZ fabriquée en laboratoire, qui permet d'interfacer le spectromètre de masse à diverses méthodes d'introduction d'échantillons. Remplissez une seringue de 250 microlitres avec une solution aqueuse de bicarbonate à 50 millimolaire dissoute dans 2 % d'acétonitrile. Ensuite, reliez la seringue au microréacteur et placez-la sous la pompe à seringue.

Rincez le microréacteur à deux microlitres par minute pendant cinq minutes, afin de le préparer pour l'analyse. Ensuite, chargez l'échantillon protéique d'intérêt dans une seringue de 250 microlitres et injectez la solution échantillon à deux microlitres par minute pendant cinq minutes. Puis, placez une seringue de 250 microlitres chargée d'une solution de trypsine à cinq micromolaire sous la pompe à seringue, et faites infuser sur la protéine adsorbée dans le microréacteur à deux microlitres par minute pendant une à trois minutes.

Il est essentiel de décongeler et de préparer une solution de trypsine fraîche avant chaque expérience. Cela garantira que l'enzyme protéolytique conserve son activité ainsi que le pH de fonctionnement du microréacteur, qui est d'environ 8. Remplir une autre seringue de 250 microlitres avec une solution aqueuse contenant 0 %1 % d'acide trifluoroacétique ajouté à 2 % d'acétonitrile.

Utiliser cette solution pour arrêter le processus de digestion protéolytique en rinçant le microréacteur à raison de deux microlitres par minute pendant cinq minutes. Ensuite, passer à une seringue remplie d’acide trifluoroacétique à 0,1 % ajouté à 50 % d’acétonitrile, puis activer le processus d’acquisition de données du spectromètre de masse sous tension d’ionisation par électrospray d’environ 2000 volts. Utiliser la solution acidifiée pour commencer l’élution du digest protéique à partir du microréacteur à 300 nanolitres par minute pendant 20 à 30 minutes.

Acquérir les données de spectrométrie de masse en utilisant les paramètres d'acquisition indiqués dans le protocole textuel accompagnant. Traiter les fichiers bruts LTQ MS à l'aide d'une base de données protéique minimale et redondante en chargeant d'abord les données brutes dans le moteur de recherche. Ensuite, régler les tolérances de masse des ions parent et fragment à deux et un dalton respectivement, et n'utiliser que les fragments entièrement trypsiques avec au maximum deux clivages manqués pour la recherche.

En outre, définissez les taux de faux positifs à confiance élevée et intermédiaire respectivement à 1 % et 3 %, et n'autorisez pas les modifications post-traductionnelles, sauf si la recherche porte spécifiquement sur certaines modifications. Enfin, filtrez les données pour ne retenir que les correspondances peptidiques à haute confiance. On observe ici un spectre de masse composé de peptides triptiques générés à partir d'un mélange protéique ayant subi une protéolyse dans le microréacteur.

Ces étiquettes représentent les ions peptidiques tryptiques les plus intenses et indiquent leur séquence ainsi que l'identifiant protéique correspondant. Ce microréacteur permet une mise en œuvre facile de l'expérience pour réaliser la digestion enzymatique des protéines et autorise une analyse et une identification par spectrométrie de masse en moins de 30 minutes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de veiller à maintenir la propreté des vials et des instruments entrant en contact avec les solutions, afin d'éviter toute contamination des échantillons.

Après cette procédure, d'autres méthodes d'acquisition de données par spectrométrie de masse peuvent être utilisées afin de mieux caractériser les peptides générés et répondre à des questions supplémentaires relatives à la structure des protéines. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la protéonomique de concevoir des protocoles plus rapides pour l'analyse des protéines et d'explorer la mise au point de nouvelles plateformes microphalitiques permettant l'exploration à haut débit d'échantillons biologiques. Cette technique est limitée à l'analyse de mélanges protéiques relativement simples produisant de 25 à 50 peptides.

Ces peptides peuvent être analysés par de simples expériences d'infusion et ne nécessitent pas de séparation chromatographique liquide avant l'analyse par spectrométrie de masse. N'oubliez pas que le travail avec des solvants organiques peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l'évitement des flammes nues doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.