Name: Fast Processing Enzymatic des protéines pour MS de détection avec un microréacteur Flow-through (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Apprenez la fabrication d'un microréacteur trypsique à flux continu pour la digestion enzymatique rapide des protéines en vue de leur identification par spectrométrie de masse. Cette méthode rapide et économique s'intègre facilement aux plateformes microfabriquées.

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1. Préparation du microréacteur Capillaire <ol><li> Couper le diamètre interne de 100 um (ID) x 360 um de diamètre extérieur (OD) capillaire à une longueur de 7-8 cm et le diamètre intérieur x 20 um 90 um OD capillaire 3-5 cm avec le hachoir à capillaire en verre; vérifier sous le microscope que les deux extrémités capillaires ont, une coupe droite propre, sans bavures saillantes. </li><li> Insérer le 20 um x 90 um ID OD capillaire dans une extrémité de l&#39;ID de 100 um x 360 um diamètre extérieur capillaire, pour une longueur de ~ 6 mm; en cas de besoin, d&#39;observer cette opération sous un microscope. </li><li> Appliquer une petite goutte de colle E6000 autour de la jonction des 90 um OD / 100 capillaires um d&#39;identité avec la fin d&#39;un Q-tip, et laisser la colle cure O / N à la température ambiante. </li><li> Couper l&#39;insertion 20 um x 90 um ID OD capillaire à une longueur de ~ 10 à 15 mm; ce sera l&#39;ionisation électrospray émetteur. </li><li> Pré-couper le 1/32 &quot;PEEK OD, 1/16&quot; PEEK OD et 1/16 &quot;PTFE baignoire ODtion en morceaux de 4-5 cm de longueur; ce seront les manches utilisés dans les syndicats capillaires pour fournir une connexion sans fuite. </li><li> Connectez l&#39;autre extrémité du 100 um ID x 360 um OD capillaire à une union de PEEK; utiliser un manchon 1/32 &quot;PEEK pour fournir une connexion sans fuite. </li><li> Insérer / serrer un morceau de ~ longue 1/16 &quot;tube de PTFE 5 cm dans l&#39;extrémité opposée de l&#39;union. </li><li> Peser ~ 4 mg de C18 (5 um) des particules dans un pré-nettoyée / séchée de 2 ml du flacon de verre; ajouter 0,5 ml d&#39;isopropanol, fermer le flacon et disperser la boue dans le bain de appareil à ultrasons. </li><li> Retirer avec une seringue de 250 pi environ 200 en suspension ul, insérer l&#39;aiguille de la seringue dans le &quot;tube de l&#39;union de PEEK 1/16 de PTFE, et distribuer lentement la suspension dans le 100 um ID x 360 um OD capillaire; observer au microscope comme capillaire remplit avec des particules jusqu&#39;à une longueur de 2-3 mm d&#39; emballage est réalisé, ce sera le microréacteur (Figure 1) le 20 μ.m ID capillaire retient les particules dans le microréacteur par un effet Keystone. 15 </li><li> Rincer le microréacteur avec une solution ~ 50 ul de H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, puis avec une solution ~ 50 ul de H 2 O / CH 3 CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;échantillon Solutions Remarque: Les opérations qui impliquent la manipulation de solvants et d&#39;acides organiques et de la préparation de la solution doivent être effectuées dans une hotte. Porter des lunettes, des gants et des vêtements de protection. <ol><li> Rinçage avec CH3OH et sécher quelques flacons en verre (4 ml) et des tubes de polypropylene (15 ml). </li><li> Préparer 10 ml d&#39;une solution de H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) dans un tube de 15 ml en polypropylene en mélangeant 9,8 ml de H 2 O avec 200 pi de CH3CN; mélanger par sonication. </li><li> Préparer 10 ml d&#39;une solution de H 2 O / CH3CN (50:50 v / v) dans un tube de 15 ml en polypropylene en mélangeant 5 ml de H 2 &lt;/ sub&gt; O avec 5 ml CH 3 CN; mélanger par sonication. </li><li> Préparer 4 ml d&#39;une solution aqueuse acidifiée (TFA 0,01% v / v) par addition de 4 ul de TFA (10%) à 4 ml d&#39; H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) dans un flacon de 4 ml en verre; mélanger par sonication. </li><li> Préparer 4 ml d&#39;une solution organique acidifiée (TFA 0,01% v / v) par addition de 4 ul de TFA (10%) à 4 ml d&#39; H 2 O / CH3CN (50:50 v / v) dans un flacon de 4 ml en verre; mélanger par sonication. </li><li> Peser 16 mg NH 4 HCO 3 avec une microbalance analytique dans un flacon de 4 ml en verre; ajouter 4 ml d&#39;H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) et de se disperser par sonication; il en résulte une solution à 50 mM de NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) dans un tampon aqueux. </li><li> Peser 5 mg d&#39;une protéine standard (par exemple, l&#39; albumine de sérum bovin, l&#39; hémoglobine α / β, le cytochrome C, l&#39; anhydrase carbonique, l&#39; α-2-HS-glycoprotéine, etc.) avec une micro - balance analytique dans un flacon de 4 ml en verre; ajouter 4 ml DI water et disperser par sonication; cela se traduit généralement par une solution de concentration de niveau élevé iM. </li><li> Préparer 1 ml de solution de protéine (1-2 uM) en diluant la solution de concentration au niveau iM haut avec un volume approprié de NH 4 HCO 3 (50 mM) , un tampon aqueux; mélanger par sonication. </li><li> Préparer la solution de trypsine (5 uM) en dissolvant 20 ug séquençage teneur trypsine dans 170 pl de NH 4 HCO 3 (50 mM) , un tampon aqueux; disperser par sonication. </li></ol> 3. Configuration expérimentale Remarque: Le système LTQ-MS est équipé d&#39;une source ESI modifiée qui comprend une étape de XYZ-maison construite qui permet l&#39;interface du spectromètre de masse à diverses approches d&#39;entrée d&#39;échantillon. <ol><li> Débranchez le microréacteur capillaire du syndicat PEEK et se connecter au PEEK Tee. </li><li> Insérez un ~ 2 cm de long fil Pt dans le bras latéral du PEEK Tee; utiliser un &quot;manchon 1/32 PEEK pour fournir unconnexion et pour isoler le fil Pt sans fuite. </li><li> Connectez un 50 pm ID x 360 um OD (~ 0,5 m de long) transfert d&#39;échantillon capillaire à l&#39;extrémité opposée de la PEEK Tee; utiliser un manchon 1/32 &quot;PEEK pour fournir une connexion sans fuite. </li><li> Fixer le PEEK T sur le XYZ-scène et positionner l&#39;ESI émetteur ~ 2 mm de la masse capillaire d&#39;entrée du spectromètre. </li><li> Connectez le fil Pt à la source d&#39;alimentation ESI du spectromètre de masse. </li><li> Connectez l&#39;autre extrémité du transfert de l&#39;échantillon capillaire à l&#39;union en acier inoxydable; utiliser un manchon 1/16 &quot;PEEK pour fournir une connexion sans fuite. </li><li> Connectez un 4-5 cm de long 1/16 &quot;tube en PTFE à l&#39;extrémité opposée de l&#39;union en acier inoxydable et insérer l&#39;aiguille de la seringue 250 pi dans le tube de PTFE, tourner sur la pompe et régler le débit à la valeur désirée (par exemple, 2 pl / min). </li><li> tandem d&#39;entrée d&#39;acquisition de données MS paramètres dans le logiciel qui contrôle l&#39;instrument MSd enregistrer en tant que fichier de méthode pour préparer le programme d&#39;installation pour effectuer l&#39;analyse; pour le système LTQ-MS, utilisez les paramètres d&#39;analyse dépendant de données suivantes: exclusion dynamique activé pour 180 secondes avec une largeur de masse d&#39;exclusion ± 1,5 m / z; un MS scan suivi d&#39;un zoom et MS 2 scans sur le top 5 des pics les plus intenses, zoom largeur de balayage ± 5 m / z; dissociation induite par collision (CID) des paramètres fixés à la largeur d&#39;isolement 3 m / z, normalisée énergie de collision de 35%, l&#39;activation Q 0,25, et le temps d&#39;activation de 30 msec. </li></ol> 4. Configuration microfluidique <ol><li> Préparer un dispositif microfluidique à partir de verre ou de substrats polymères; 16-18 l&#39;agencement du dispositif est pourvu sur la figure 2A, constitué d&#39;un micro - réacteur (1) (0,13 mm Longueur Largeur x 2 mm x 50 um de profondeur) reliée à une entrée (2 ), la sortie (3) et un orifice latéral (4); les canaux d&#39;interconnexion pour les manipulations fluidiques sont ~110 m de large et de ~ 50 um de profondeur; une structure multi - canaux (5), composé de ~ 1,5 à 2 um de profondeur x 10 um de largeur x 100 um de long microcanaux 25 um placés à part, va agir comme un filtre pour retenir les particules dans le microréacteur. </li><li> Activer les connexions fluides livraison à la puce par collage des connecteurs spécialisés aux ports d&#39;entrée, ou en concevant un stand polymère qui accueille des raccords pour la distribution de fluide (figure 2B). 16 </li><li> Préparer une suspension de particules C18 (5 um) comme décrit à l&#39;étape 1.8; fournir la suspension dans le microréacteur avec une seringue à l&#39;aide de 16.01 &quot;tube en PTFE relié à l&#39;orifice latéral de la puce (4) scelle l&#39;orifice après le chargement des particules avec de la colle epoxy et durcir pendant 1 heure dans une étuve à 90 ° C 16. </li><li> Insérez un capillaire (20 pm ID x 90 um OD x 10 mm de longueur) dans l&#39;orifice de sortie, sceller avec E6000 colle et laisser sécher O / N; cela deviendra l&#39;émetteur ESI ( <strong&gt; 6). </li><li> Connectez un 50 pm ID x 360 OD um (~ 0,5 m de long) transfert d&#39;échantillon capillaire à l&#39;orifice d&#39;entrée de la puce (2); connecter l&#39;extrémité opposée du tube capillaire à une seringue de 250 ul et la pompe de seringue, comme décrit dans 3,6 à 3,7. </li><li> Placez un léger PEEK Tee connecteur sur la ligne de transfert d&#39;échantillon juste avant l&#39;orifice d&#39;entrée (2) et insérer un fil de Pt sur ​​le côté-bras du T, comme décrit dans 3.2; ce sera l&#39;électrode ESI. </li><li> Fixer le dispositif microfluidique sur la platine XYZ avec l&#39;émetteur positionné ESI ~ 2 mm par rapport à la masse capillaire d&#39;entrée du spectromètre; préparer le MS pour l&#39;analyse comme décrit dans 3.8. </li></ol> 5. Sample Loading, Digestion protéolytique et Elution pour MS Analysis Remarque: Toutes les étapes de transfert solution / échantillon sont effectuées à l&#39;aide d&#39;une pompe à seringue et devrait permettre pendant quelques minutes supplémentaires pour terminer, pour compenser les morts-volumes associés aux lignes de transfert vers et depuis le microréacteur; le temps nécessaire dépendra des débits en cause. <ol><li> Rincer le microréacteur et la préparer pour l&#39; analyse par infusion d&#39; une solution aqueuse de NH 4 HCO 3 (50 mM) dans du H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) à 2 ul / min pendant 5 min; utiliser une seringue de 250 pi. </li><li> Charger l&#39;échantillon de protéine (1 uM) dans le microréacteur en injectant la solution d&#39;échantillon à 2 pi / min pendant 5 min; utiliser une seringue de 250 pi. </li><li> Perfuser la solution de trypsine (5 uM) sur la protéine adsorbée sur le microréacteur à 2 ul / min pendant 1-3 min. </li><li> Étancher le processus de digestion protéolytique par rinçage du micro - réacteur avec une solution aqueuse acidifiée de TFA (0,01% v / v) dans H2O / CH3CN (98: 2 v / v) à 2 ul / min pendant 5 min; utiliser une seringue de 250 pi. </li><li> Lancer l&#39;élution de la digestion protéique du microréacteur en infusant une solution organique acidifiée de TFA (0,01%v / v) dans H 2 O / CH3CN (50:50 v / v) à 300 Nl / min. </li><li> Allumez le processus d&#39;acquisition de données MS et la tension ESI (~ 2,000 V); acquérir des données MS en utilisant les paramètres d&#39;acquisition de données fournies à l&#39;étape 3.8; observer l&#39;élution des peptides tryptiques. </li></ol> 6. Traitement des données <ol><li> Traiter les données avec un moteur de recherche compatible avec le format de données MS brut tandem MS. <ol><li> Traiter les fichiers bruts LTQ-MS à l&#39;aide d&#39;un organisme de base de données spécifique de la protéine peu redondante; télécharger les données brutes dans le moteur de recherche, définissez les parents et le fragment d&#39;ions tolérances de masse à 2 et 1 Da, respectivement, et utiliser des fragments seulement entièrement tryptiques avec jusqu&#39;à deux clivages pour la recherche manquée; ne permettent pas de modifications post-traductionnelles; fixer les taux de découverte haute et moyenne confiance faux (FDR) à 1% et 3%, respectivement, et ne permettent pas de modifications post-traductionnelles. </li></ol></li><li> Filtrer les données pour sélectionner seulement de haute confiancepeptide correspond aux protéines contenues dans la base de données; évaluer les protéines et niveau peptide résultats. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Le microréacteur décrit dans ce travail fournit un outil facile à mettre en œuvre l&#39;installation expérimentale pour effectuer la digestion enzymatique de protéines pour permettre l&#39;analyse MS et l&#39;identification en moins de 30 min. Les avantages distincts de ce système, par rapport aux approches conventionnelles, notamment la simplicité, la rapidité, la faible consommation de réactifs et de faibles coûts. En particulier, il n&#39;y a pas besoin de billes de trypsine immobilisée coûteux et des cartouches. La ...

L&#39;identification et la caractérisation des protéines purifiées sont fréquemment obtenus en utilisant des techniques de SM. La protéine est digérée par une enzyme et les peptides sont en outre analysés par SM en utilisant un dispositif expérimental de perfusion simple. la digestion protéolytique est nécessaire pour produire des petits fragments peptidiques qui se situent dans la plage de masse utile de la plupart des analyseurs de sclérose en plaques, et qui peut être facilement fragmenté par une faible énergie dissociation induite par collision pour générer des informations de séquence d&#39;acides aminés. Pour les protéines isolées ou mélanges de protéines simples, il n&#39;y a plus besoin d&#39;une séparation chromatographique des peptides avant la détection MS. Un mélange de 25-50 peptides peut être facilement analysé en insufflant de l&#39;échantillon avec une pompe à seringue directement dans la source d&#39;ions SP. Le spectromètre de masse peut effectuer l&#39;analyse et confirmer la séquence d&#39;une protéine dans un laps de temps court. Avec les méthodes d&#39;acquisition de données modernes, ce processus peut être accompli wurant quelques minutes, voire quelques secondes. Le facteur limitant dans la réalisation de l&#39;ensemble du processus sur une échelle de temps courte est l&#39;étape de digestion protéolytique. En règle générale, ceci est réalisé en quelques heures (ou O / N), en solution, à 37 ° C, en utilisant un substrat: ratios de (50-100) de l&#39;enzyme: 1. Pour réduire le temps de digestion enzymatique minutes ou secondes, microréacteurs d&#39;enzymes immobilisées, sous la forme de réacteurs microfluidiques ou des cartouches disponibles dans le commerce, ont été décrits. 1-6 Typiquement, l&#39;enzyme est immobilisée par liaison covalente, non covalente / adsorption physique, complexe la formation ou l&#39; encapsulation, 3,6- l&#39;efficacité accrue du processus enzymatique étant activé par la grande surface-volume et de rapports enzyme-substrat. Des avantages supplémentaires de réacteurs immobilisés comprennent autolyse et l&#39;interférence réduite de l&#39;enzyme dans l&#39;analyse MS, une stabilité améliorée et la réutilisabilité enzyme. Une variété d&#39;approches, en utilisant du verre ou des dispositifs micro-usinés polymères ont été décrits,en utilisant des enzymes immobilisées sur des perles magnétiques par des interactions anticorps-antigène, 7,8 piégées dans des réseaux de nanoparticules d&#39; or, 9 encapsulées dans du dioxyde de titane-alumine sol-gels 10 et nanozeolites, 11 ou capturés par Ni-NTA ou His-Tag formation du complexe. 6 Alternativement , capillaires ouvert tubulaires avec des enzymes immobilisées ont été développés, aussi bien. 12 par ailleurs, le renforcement de clivage protéolytique a été démontrée en utilisant micro - ondes irradiation contrôlée 13 ou de la technologie de vélo assisté à la pression ou à la pression (PCT) pour réduire les temps de réaction à 30-120 min. 14 Malgré les multiples avantages de réacteurs enzymatiques immobilisés, les coûts des cartouches commerciales est élevé, la disponibilité des dispositifs microfluidiques pour une utilisation de routine est limitée, et l&#39;utilisation des technologies de micro-ondes ou PCT résultats dans le besoin pour l&#39;instrumentation supplémentaire. Le but de ce travail était de développer une méthode qui circumveNTS ces inconvénients, et qui peuvent être facilement mises en œuvre dans tous les laboratoires de permettre aux chercheurs avec une approche simple et efficace pour effectuer un clivage enzymatique de protéines en préparation pour l&#39;analyse MS en quelques minutes. L&#39;approche repose sur l&#39;utilisation de C18 particules hydrophobes qui sont pré-chargés dans un tube capillaire ou d&#39;un dispositif microfluidique, et l&#39;adsorption de la protéine (s) d&#39;intérêt sur ces particules, suivie par une digestion enzymatique pendant la perfusion de l&#39;enzyme au cours de la lit garni et de protéines (s) capturé. Dans cette approche, le substrat est immobilisé par des interactions non covalentes, et l&#39;enzyme est perfusé sur la protéine immobilisée. L&#39;efficacité protéolytique de digestion est augmentée par les grandes surfaces des particules qui exposent la protéine pour le traitement enzymatique, des distances et des temps de diffusion vers et à partir de la surface de particules réduite, améliore le transfert de masse, aucune liaison covalente qui peut affecter l&#39;activité de l&#39;enzyme, l&#39;aptitude rapidement évaluate combinaisons de différentes enzymes, et le multiplexage jetabilité si le procédé est exécuté dans un format microfluidique. Cette approche est démontrée par l&#39;utilisation d&#39;un mélange de protéines standards et trypsine l&#39;enzyme la plus couramment utilisée pour la digestion protéolytique avant la détection ESI-MS. Le spectromètre de masse utilisé pour la détection dans cette étude était un instrument linéaire piège quadripolaire (LTQ).

<table><tbody><tr><td>Piège à ions ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>Le spectromètre de masse LTQ est utilisé pour l’acquisition de données MS en tandem</td></tr><tr><td>Étage XYZ Newport</td><td>Pièces multiples</td><td>L’étage XYZ de fabrication artisanale est utilisé pour adapter la source nano-ESI commerciale LTQ afin de recevoir des informations de divers systèmes de distribution d’échantillons</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>Le microscope est utilisé pour observer le processus d’emballage du microréacteur</td></tr><tr><td>Balance analytique/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>La balance est utilisée pour peser les échantillons de protéines</td></tr><tr><td>Bain à ultrasons/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>Le bain sonique est utilisé pour mélanger/homogénéiser les échantillons et disperser la boue de particules C18</td></tr><tr><td>Pompe à seringue 22</td><td>Appareil de Harvard</td><td>552222</td><td>La micropompe est utilisée pour le chargement, le rinçage et l’élution de l’échantillon et de l’enzyme sur et depuis le microréacteur capillaire à garnissage</td></tr><tr><td>Système d’eau ultrapure Milli-Q</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp ;</td><td>Le système d’eau MilliQ est utilisé pour préparer de l’eau DI purifiée</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1 000&nbsp ; et micro ; l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>La pipette est utilisée pour mesurer de petits volumes de solutions d’échantillons</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp ; et micro ; l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>La pipette est utilisée pour mesurer de petits volumes de solutions d’échantillons</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp ; et micro ; l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>La pipette est utilisée pour mesurer de petits volumes de solutions d’échantillons</td></tr><tr><td>Capillaire en silice fondue (100 & micro ; m ID x 360 & micro ; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>Ce capillaire est utilisé pour la fabrication du microréacteur</td></tr><tr><td>Capillaire en silice fondue (20&nbsp ; et micro ; m ID x 100 & micro ; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>Ce capillaire est utilisé pour la fabrication de l’émetteur ESI</td></tr><tr><td>Capillaire en silice fondue (50&nbsp ; et micro ; m ID x 360 & micro ; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>Ce capillaire est utilisé pour transférer les échantillons et l’éluant de la pompe à seringue au microréacteur capillaire</td></tr><tr><td>Couperet capillaire en verre</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>Il s’agit d’un outil permettant de couper les capillaires en silice fondue à la longueur souhaitée</td></tr><tr><td>Colle</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>Cette colle est utilisée pour fixer l’émetteur ESI dans le microréacteur capillaire ou la puce microfluidique</td></tr><tr><td>Colle époxy</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>Cette colle est utilisée pour sceller le trou d’entrée microfluidique par lequel les particules de C18 sont chargées</td></tr><tr><td>Particules de C18 en phase inverse (5&nbsp ; et micro ; m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>Il s’agit de particules C18 sur lesquelles les protéines sont adsorbées ; les particules ont été extraites d’un 4&nbsp ; mm x 20 cm C18 LC colonne en</td></tr><tr><td>seringue/verre Agilent (250 & micro ; l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>Les seringues en verre sont utilisées pour charger la suspension de particules de C18 dans le microréacteur capillaire et pour livrer l’échantillon et les éluants au microréacteur</td></tr> Union <tr><td>réductrice interne PEEK (1/16 » à 1/32 »)</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>Ce raccord est utilisé pour connecter les 250 & ; micro ; l seringue au microréacteur pour charger le 5 & micro ; Raccord en</td></tr><tr><td>acier inoxydable (1/16")</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>L’union en acier inoxydable est utilisée pour connecter l’aiguille de la seringue en verre au</td></tr><tr><td>connecteur en T Microvolume PEEK capillaire à perfusion (1/32")</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>Le té Peek est utilisé pour connecter le capillaire de transfert d’échantillons au microréacteur capillaire ; sur son bras latéral, il permet l’insertion du connecteur en T du fil Pt</td></tr><tr><td>(poids léger)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>Ce connecteur en T est utilisé pour appliquer une tension ESI à la puce microfluidique par le biais de la ligne de transfert d’échantillons</td></tr><tr><td>Fil Pt (0,404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>Le fil Pt fournit une connexion électrique pour la génération d’ESI et est connecté au tube PTFE d’alimentation du spectromètre de masse ESI</td></tr><tr><td>(1/16" OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>Le tube en téflon est utilisé pour permettre une connexion étanche à l’air entre l’aiguille de la seringue et le raccord en acier inoxydable.</td></tr><tr><td>Tube PEEK (0,015" ID x 1/16 po OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>Le tube Peek est utilisé comme manchon pour permettre une connexion étanche à l’air entre le raccord en acier inoxydable et le 50&nbsp ; et micro ; Tube PEEK capillaire de transfert m ID</td></tr><tr><td>(0,015" ID x 1/32 po OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>Le tube Peek est utilisé comme manchon pour permettre une connexion sans fuite entre les capillaires en silice fondue et le</td></tr><tr><td>coupe-tube en polymère Peek Tee Clean-cut</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>Ce coupe-tube est utilisé pour pré-découper les 1/16" et 1/32' Tube en polymère Peek qui est utilisé comme manchon pour des connexions étanches en morceaux de ~4-5 cm de longueur</td></tr><tr><td>Flacon ambré (2 ml)</td><td>Agilent&nbsp ;</td><td>HP-5183-2069</td><td>Les flacons sont utilisés pour préparer des solutions d’échantillon et la suspension de particules C18.</td></tr><tr><td>Flacon ambré (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>Les flacons sont utilisés pour préparer des solutions d’échantillons</td></tr><tr><td>Tube en polypropylène (15&nbsp ; ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>Les flacons sont utilisés pour préparer des solutions tampons</td></tr><tr><td>Cylindre (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>Le cylindre est utilisé pour mesurer les volumes de solvant</td></tr><tr><td>Cylindre (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>Le cylindre est utilisé pour mesurer les volumes de solvant</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (1 000 & micro ; l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>Les pointes de pipette sont utilisées pour mesurer de petits volumes de solutions d’échantillon</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (100 &micro ; l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>Les pointes de pipette sont utilisées pour mesurer de petits volumes de solutions d’échantillon</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (10 & micro ; l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>Les pointes de pipette sont utilisées pour mesurer de petits volumes de solutions d’échantillons</td></tr><tr><td>Substrats en verre</td><td>Nanofilm</td><td>B270 couronne blanche, 3 » x 3 »</td><td>Il s’agit de substrats en verre pour la fabrication de micropuces</td></tr><tr><td>Raccord à écrou mâle (1/16")</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>Ce raccord est utilisé pour connecter les capillaires de transfert à la puce microfluidique</td></tr><tr><td>Assemblage de nanoports</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>Ce raccord est utilisé pour connecter les capillaires de transfert à la puce microfluidique</td></tr><tr><td>Étalons de protéines</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, qualité HPLC</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol, qualité</td> <td>HPLCFisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, grade HPLC</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, grade de séquençage</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

fast processing enzymatic des protéines pour ms de détection avec un microréacteur flow-through

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

La grande majorité de la spectrométrie de masse (MS) à base de méthodes d&#39;analyse de protéines impliquent une étape de digestion enzymatique avant la détection, généralement avec de la trypsine. Cette étape est nécessaire pour la génération de peptides de poids moléculaire, généralement PM &lt;3000-4000 Da, qui se situent dans la plage de balayage effective de la spectrométrie de masse de l&#39;instrumentation. protocoles classiques impliquent O / N digestion enzymatique à 37 ° C. Des progrès récents ont permis le développement d&#39;une variété de stratégies, impliquant habituellement l&#39;utilisation d&#39;un microréacteur avec des enzymes immobilisées ou d&#39;une série de processus physiques complémentaires qui permettent de réduire le temps nécessaire à la digestion protéolytique , à quelques minutes (par exemple, micro - onde ou de haute activité pression). Dans ce travail, nous décrivons une approche simple et rentable qui peut être mis en œuvre dans un laboratoire pour réaliser une digestion enzymatique rapide d&#39;une protéine. Le (ou mélange de protéines) de la protéine est adsorbé sur C18 lié en phase inverse à haute perfORMANCE chromatographie liquide (HPLC) des particules de silice pré-chargés dans une colonne capillaire, et de la trypsine dans un tampon aqueux est imprégné sur les particules pendant un court laps de temps. Pour activer la détection en ligne MS, les peptides tryptiques sont élues avec un système solvant avec un contenu organique augmenté directement dans la source MS ion. Cette approche évite l&#39;utilisation de particules d&#39;enzymes immobilisées à prix élevé et ne nécessite pas d&#39;aide pour compléter le processus. la digestion des protéines et analyse complète de l&#39;échantillon peut être accompli en moins de 3 min et ~ ~ 30 min, respectivement.

Un résultat représentatif d&#39;un procédé de digestion protéolytique effectuée simultanément sur ​​un mélange de protéines, avec des microréacteurs (figures 1 et 2) est fournie dans le tableau 1 décrit ci-dessus. Le tableau comprend les séquences peptidiques uniques qui identifient une protéine particulière, la croix score de corrélation (Xcorr) (ie, un score qui caractérise la qualité du match expérimentale à théorique pour le spectre de masse...

Un protocole rapide pour la digestion protéolytique avec un microréacteur tryptique à flux continu construit en interne et couplé à un spectromètre de masse à ionisation par électronébulisation (ESI) est présenté. La fabrication du microréacteur, le montage expérimental et le processus d’acquisition des données sont décrits.

Fast Processing Enzymatic des protéines pour MS de détection avec un microréacteur Flow-through

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire la fabrication d'un microréacteur tryptique en flux continu qui effectue une digestion enzymatique rapide des protéines, permettant ainsi leur identification par spectrométrie de masse à ionisation électrospray. Cette méthode peut aider à illustrer la séquence d'acides aminés de protéines isolées et purifiées, afin de faciliter la caractérisation ultérieure de leur structure et de leur fonction. Le principal avantage de ce protocole réside dans sa rapidité, son faible coût et sa facilité d'intégration dans des flux de travail utilisant des plateformes microfabriquées.Pour commencer, utilisez un coupe-capillaires en verre pour couper le tube capillaire plus grand à une longueur de sept à huit centimètres, et le plus petit à une longueur de trois à cinq centimètres. Utilisez un microscope pour vérifier que les deux extrémités capillaires présentent une coupe propre et droite, sans bavures proéminentes. Insérez le capillaire plus petit d’environ six millimètres dans une extrémité du capillaire plus grand.Ensuite, utilisez un coton-tige pour appliquer une petite goutte de colle autour de la jonction des capillaires, puis laissez la colle polymériser toute la nuit à température ambiante. Ensuite, coupez le capillaire inséré à une longueur d'environ 10 à 15 millimètres. Cette extrémité servira d'émetteur pour l'ionisation par électrospray.Insérez l'extrémité opposée du capillaire de plus grand diamètre dans un tube PEEK de 1/32 de pouce préalablement coupé entre quatre et cinq centimètres de longueur et relié à un raccord PEEK. Ensuite, insérez et serrez le morceau de cinq centimètres de longueur de tube PTFE 1/16 dans l'autre extrémité du raccord. Dans un flacon en verre propre et sec de deux millilitres, pesez quatre milligrammes de particules C18, puis ajoutez 0,5 millilitre d'isopropanol.Fermer le flacon. Le placer dans un bain ultrasonique et soniquer afin de disperser uniformément les particules dans la solution. Ensuite, utiliser une seringue de 250 microlitres pour prélever 200 microlitres de la suspension C18.Insérez la seringue dans le tube en PTFE de 1/16 de pouce et délivrez lentement la suspension dans le gros capillaire. Observez au microscope le remplissage du capillaire par les particules, jusqu'à l'obtention d'une hauteur d'empaquetage de deux à trois millimètres. Le petit tube capillaire retient ces particules dans le microréacteur grâce à un effet de clé de voûte.Enfin, rincez le microréacteur avec 50 microlitres d'une solution à 50-50 d'eau et d'acétonitrile, suivie de 50 microlitres d'une solution contenant 49 microlitres d'eau mélangés à un microlitre d'acétonitrile. Débranchez le microréacteur capillaire de l'union PEEK et reliez-le à un té PEEK. Insérez ensuite un fil de platine d'une longueur de deux centimètres, gainé d'une gaine PEEK de 1/32 pouce, afin d'assurer une connexion étanche dans la ramification latérale du té PEEK.Relier un capillaire d'échantillon d'un demi-mètre de longueur à l'extrémité opposée du T en PEEK. Utiliser un manchon en PEEK de 1/32 de pouce pour assurer une connexion étanche. Fixer solidement le T en PEEK sur la platine XYZ.Et positionnez l'émulseur d'ionisation par électrospray à environ deux millimètres de l'entrée capillaire du spectromètre de masse. Ensuite, reliez le fil de platine à la source d'alimentation d'ionisation par électrospray du spectromètre de masse. Reliez également l'extrémité opposée du capillaire de transfert d'échantillon à l'union en acier inoxydable, en utilisant un manchon PEEK de 1/16 de pouce pour assurer une connexion étanche.Ensuite, connectez un morceau de tube en PTFE d'une longueur de quatre à cinq centimètres et d'un diamètre de 1/16 de pouce à l'extrémité opposée du raccord en acier inoxydable. Saisissez les paramètres d'acquisition des données de spectrométrie de masse en tandem tels que décrits dans le protocole textuel accompagnant dans le logiciel qui commande l'appareil de spectrométrie de masse. Enregistrez-les sous forme de fichier méthode afin de préparer le dispositif pour effectuer l'analyse.Le système de spectrométrie de masse LTQ est équipé d'une source ESI modifiée comprenant une platine XYZ fabriquée en laboratoire, qui permet d'interfacer le spectromètre de masse à diverses méthodes d'introduction d'échantillons. Remplissez une seringue de 250 microlitres avec une solution aqueuse de bicarbonate à 50 millimolaire dissoute dans 2 % d'acétonitrile. Ensuite, reliez la seringue au microréacteur et placez-la sous la pompe à seringue.Rincez le microréacteur à deux microlitres par minute pendant cinq minutes, afin de le préparer pour l'analyse. Ensuite, chargez l'échantillon protéique d'intérêt dans une seringue de 250 microlitres et injectez la solution échantillon à deux microlitres par minute pendant cinq minutes. Puis, placez une seringue de 250 microlitres chargée d'une solution de trypsine à cinq micromolaire sous la pompe à seringue, et faites infuser sur la protéine adsorbée dans le microréacteur à deux microlitres par minute pendant une à trois minutes.Il est essentiel de décongeler et de préparer une solution de trypsine fraîche avant chaque expérience. Cela garantira que l'enzyme protéolytique conserve son activité ainsi que le pH de fonctionnement du microréacteur, qui est d'environ 8. Remplir une autre seringue de 250 microlitres avec une solution aqueuse contenant 0 %1 % d'acide trifluoroacétique ajouté à 2 % d'acétonitrile.Utiliser cette solution pour arrêter le processus de digestion protéolytique en rinçant le microréacteur à raison de deux microlitres par minute pendant cinq minutes. Ensuite, passer à une seringue remplie d’acide trifluoroacétique à 0,1 % ajouté à 50 % d’acétonitrile, puis activer le processus d’acquisition de données du spectromètre de masse sous tension d’ionisation par électrospray d’environ 2000 volts. Utiliser la solution acidifiée pour commencer l’élution du digest protéique à partir du microréacteur à 300 nanolitres par minute pendant 20 à 30 minutes.Acquérir les données de spectrométrie de masse en utilisant les paramètres d'acquisition indiqués dans le protocole textuel accompagnant. Traiter les fichiers bruts LTQ MS à l'aide d'une base de données protéique minimale et redondante en chargeant d'abord les données brutes dans le moteur de recherche. Ensuite, régler les tolérances de masse des ions parent et fragment à deux et un dalton respectivement, et n'utiliser que les fragments entièrement trypsiques avec au maximum deux clivages manqués pour la recherche.En outre, définissez les taux de faux positifs à confiance élevée et intermédiaire respectivement à 1 % et 3 %, et n'autorisez pas les modifications post-traductionnelles, sauf si la recherche porte spécifiquement sur certaines modifications. Enfin, filtrez les données pour ne retenir que les correspondances peptidiques à haute confiance. On observe ici un spectre de masse composé de peptides triptiques générés à partir d'un mélange protéique ayant subi une protéolyse dans le microréacteur.Ces étiquettes représentent les ions peptidiques tryptiques les plus intenses et indiquent leur séquence ainsi que l'identifiant protéique correspondant. Ce microréacteur permet une mise en œuvre facile de l'expérience pour réaliser la digestion enzymatique des protéines et autorise une analyse et une identification par spectrométrie de masse en moins de 30 minutes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de veiller à maintenir la propreté des vials et des instruments entrant en contact avec les solutions, afin d'éviter toute contamination des échantillons.Après cette procédure, d'autres méthodes d'acquisition de données par spectrométrie de masse peuvent être utilisées afin de mieux caractériser les peptides générés et répondre à des questions supplémentaires relatives à la structure des protéines. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la protéonomique de concevoir des protocoles plus rapides pour l'analyse des protéines et d'explorer la mise au point de nouvelles plateformes microphalitiques permettant l'exploration à haut débit d'échantillons biologiques. Cette technique est limitée à l'analyse de mélanges protéiques relativement simples produisant de 25 à 50 peptides.Ces peptides peuvent être analysés par de simples expériences d'infusion et ne nécessitent pas de séparation chromatographique liquide avant l'analyse par spectrométrie de masse. N'oubliez pas que le travail avec des solvants organiques peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l'évitement des flammes nues doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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