Fast Processing Enzymatic des protéines pour MS de détection avec un microréacteur Flow-through

L’objectif général de ce protocole est de décrire la fabrication d’un micro-oxythéacteur tryptique à flux continu qui effectue une digestion enzymatique rapide des protéines pour permettre l’identification des protéines à l’aide d’un spectromètre de masse à ionisation par électronébulisation. La méthode peut aider à illustrer la séquence d’acides aminés des protéines isolées et purifiées pour soutenir la caractérisation en aval de la structure et de la fonction. Le principal avantage de ce protocole est qu’il est rapide, rentable et susceptible d’être intégré dans des flux de travail qui utilisent des plates-formes microfabriquées.

Pour commencer, utilisez un couperet capillaire en verre pour couper le plus grand tube capillaire en verre sur une longueur de sept à huit centimètres, et le plus petit sur une longueur de trois à cinq centimètres. Utilisez un microscope pour vérifier que les deux extrémités capillaires ont une coupe nette et droite, sans bavures saillantes. Insérez le plus petit capillaire d’environ six millimètres dans une extrémité du plus grand.

Ensuite, utilisez un coton-tige pour appliquer une petite goutte de colle autour de la jonction des capillaires et laissez la colle durcir pendant la nuit à température ambiante. Ensuite, coupez le capillaire inséré à une longueur d’environ 10 à 15 millimètres. Cette extrémité agira comme l’émetteur d’ionisation par électronébulisation.

Insérez l’extrémité opposée du capillaire de plus grand diamètre dans un tube PEEK de 1/32 de pouce qui a été prédécoupé entre quatre et cinq centimètres de longueur et connecté à un raccord PEEK. Ensuite, insérez et serrez le morceau de cinq centimètres de long de tube PTFE 1/16 dans l’extrémité opposée du raccord. Dans une lime en verre propre et sèche de deux millilitres, pesez quatre milligrammes de particules de C18, puis ajoutez 0,5 millilitre d’isopropanol.

Fermez le flacon. Placez-le dans un bain d’ultrasonateur et sonicate pour disperser les particules uniformément dans la solution. Ensuite, utilisez une seringue de 250 microlitres pour prélever 200 microlitres de la boue C18.

Insérez la seringue dans le tube en PTFE de 1/16 de pouce et distribuez lentement la boue dans le grand capillaire. Observez au microscope pendant que le capillaire se remplit de particules, jusqu’à ce que deux à trois millimètres d’accumulation de particules aient été obtenus. Le tube capillaire plus petit retient ces particules dans le microréacteur par un effet clé.

Enfin, rincez le microréacteur avec 50 microlitres d’une solution 50 à 50 d’eau et d’acétonitrile, suivie de 50 microlitres d’une solution contenant 49 microlitres d’eau, mélangée à un microlitre d’acétonitrile. Déconnectez le microréacteur capillaire du raccord PEEK et connectez-le à un PEEK-T. Ensuite, insérez un fil de platine de deux centimètres de long, isolé par un manchon en PEEK de 1/32 de pouce pour fournir une connexion sans fuite dans le bras latéral du PEEK-T.

Connectez un capillaire de transfert d’échantillon d’un demi-mètre de long à l’extrémité opposée du PEEK-T. Utilisez un manchon en PEEK de 1/32 de pouce pour fournir une connexion sans fuite. Fixez le PEEK-T sur la platine XYZ.

Et positionnez l’émetteur d’ionisation par électronébulisation à environ deux millimètres du capillaire d’entrée du spectromètre de masse. Ensuite, connectez le fil de platine à la source d’alimentation par ionisation par électronébulisation du spectromètre de masse. Connectez également l’extrémité opposée du capillaire de transfert d’échantillon au raccord en acier inoxydable, à l’aide d’un manchon PEEK de 1/16 de pouce pour fournir une connexion sans fuite.

Ensuite, connectez un morceau de tube en PTFE de quatre à cinq centimètres de long à l’extrémité opposée du raccord en acier inoxydable. Entrez les paramètres d’acquisition de données en tandem de la MS comme décrit dans le protocole texte ci-joint dans le progiciel qui commande l’instrument MS. Enregistrez-les en tant que fichier de méthode pour préparer la configuration à effectuer l’analyse.

Le système LTQ MS est équipé d’une source ESI modifiée qui comprend une platine XYZ de fabrication maison, qui permet l’interfaçage du spectromètre de masse avec les différentes approches d’entrée d’échantillon. Chargez une seringue de 250 microlitres avec une solution aqueuse de bicarbonate de 50 millimolaires dissous dans 2 % d’acétonitrile. Ensuite, connectez la seringue au microréacteur et placez-la sous le pousse-seringue.

Rincez le microréacteur et deux microlitres par minute pendant cinq minutes, pour le préparer à l’analyse. Ensuite, chargez l’échantillon de protéine d’intérêt dans une seringue de 250 microlitres et perférez la solution d’échantillon à raison de deux microlitres par minute pendant cinq minutes. Ensuite, placez une seringue de 250 microlitres chargée d’une solution de trypsine à cinq micromolaires sous la pompe à seringue et infusez sur la protéine absorbée sur le microréacteur à raison de deux microlitres par minute pendant une à trois minutes.

Il est essentiel de décongeler et de préparer la solution de trypsine avant chaque expérience. Cela garantira que l’enzyme protolytique conserve son activité et son pH de fonctionnement du microréacteur, qui est un pH d’environ 8. Chargez une autre seringue de 250 microlitres avec une solution aqueuse composée de 0 % 1 % d’acide trifluoroacétique ajouté à 2 % d’acétonitrile.

Utilisez cette solution pour éteindre le processus de digestion protéolytique en rinçant le microréacteur à deux microlitres par minute pendant cinq minutes. Ensuite, passez à une seringue remplie de 01 % d’acide trifluoroacétique ajouté à 50 % d’acétonitrile, et activez le processus d’acquisition de données MS dans la tension d’ionisation par électronébulisation à environ 2000 volts. Utilisez la solution acidifiée pour commencer à éluer la digestion des protéines du microréacteur à 300 nanolitres par minute pendant 20 à 30 minutes.

Acquérez des données de spécification de masse à l’aide des paramètres d’acquisition de données fournis dans le protocole de texte d’accompagnement. Traitez les fichiers bruts LTQ MS à l’aide d’une base de données de protéines minimalement redondante en téléchargeant d’abord les données brutes dans le moteur de recherche. Ensuite, définissez les tolérances de masse ionique parent et de fragment à deux et un daltons respectivement, et n’utilisez que des fragments entièrement tryptiques avec jusqu’à deux clivages manqués pour la recherche.

De plus, fixez les taux de fausses découvertes à confiance élevée et moyenne à 1 % et 3 % respectivement, et ne permettez pas les modifications post-traductionnelles, à moins de rechercher spécifiquement des modifications particulières. Enfin, filtrez les données pour sélectionner uniquement les correspondances de peptides à haut niveau de confiance. On voit ici un spectre de masse composé de peptides tryptiques générés à partir d’un mélange de protéines soumis à une protéolyse dans le microréacteur.

Ces marqueurs représentent les ions peptidiques tryptiques les plus intenses et fournissent leur séquence et l’identifiant protéique correspondant. Ce microréacteur fournit une configuration d’expérience facile à mettre en œuvre pour effectuer la digestion enzymatique des protéines et permet une analyse et une identification de masse en moins de 30 minutes. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il est essentiel de préserver la propreté des flacons et des instruments qui entrent en contact avec les solutions pour éviter la contamination des échantillons.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes d’acquisition de données de spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour permettre une meilleure caractérisation des peptides génératifs et répondre à des questions supplémentaires liées à la structure des protéines. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéonomie pour développer des protocoles plus rapides pour l’analyse des protéines et explorer le développement de nouvelles plateformes microphalytiques permettant l’exploration à haut débit d’échantillons biologiques. Cette technique se limite à l’analyse de mélanges de protéines assez simples qui génèrent de 25 à 50 peptides.

Ces peptides peuvent être analysés par de simples expériences d’infusion et ne nécessitent pas de séparation par chromatographie liquide avant l’analyse MS. N’oubliez pas que travailler avec des solvants organiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que d’éviter les flammes nues doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.