Résolue en temps d'échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l'étude de la structure des protéines et dynamique

La flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines, et l’objectif global de la spectrométrie de masse à échange d’hydrogène-deutérium par ionisation électro-décapotable résolue en temps est de sonder les changements structurels rapides qui contrôlent la fonction dans les protéines ordonnées et désorganisées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale, telles que la cratérisation des confirmations de protéines transitoires, ce qui n’est pas un minimum aux techniques classiques à haute résolution telles que l’électrocystographie et la RMN. Le principal avantage de cette technique est que les réactions peuvent être surveillées à l’échelle de la milliseconde, ce qui est important pour caractériser les crêtes de boucle, les Moltinglobyales et les protéines intrinsèquement désordonnées.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des troubles neurodégénératifs. Comme ils impliquent souvent le mauvais repliement ou l’agrégation de régions protéiques intrinsèquement désordonnées. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des protéines structurées hebdomadaires, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les enzymes subissant un renouvellement catalytique, ou la caractérisation des interactions protéine, protéine et protéine, ligan.

Pour commencer cette procédure, il suffit de laserer une plaque à travers un canal d’entrée pour l’introduction des réactifs, une chambre de dialyse et un canal de sortie, sur un bloc PMM8 standard, à l’aide d’un graveur laser. Ensuite, coupez un capillaire en acier inoxydable de calibre 30 en deux morceaux de 10 centimètres à l’aide d’un outil rotatif pour le disque coupé de 164 pouces d’épaisseur. Utilisez du papier de verre pour lisser l’extrémité des capillaires, ce qui peut être facilité par une visualisation au microscope optique.

Maintenant, faites fondre ces capillaires dans le bloc PMM8 gravé à l’aide d’un fer à repasser. Pour construire un mélangeur cinétique à écoulement continu et résolu dans le temps, insérez un capillaire en verre cilica fondu de 40 centimètres dans un capillaire en acier et métallique de calibre 28 d’environ 15 centimètres. Ensuite, produisez une encoche de deux millimètres, à l’aide des paramètres du graveur laser de faible puissance à une extrémité du capillaire en verre intérieur et scellez cette extrémité du capillaire en verre intérieur.

Il s’agit d’une étape critique qui assure un mélange orthogonal et efficace de la protéine, qui sort par l’encoche qui se détériore généralement. L’espace intercapillaire de deux millimètres entre l’encoche et l’extrémité du capillaire est le mélange et le volume. Fixez des raccords et des manchons de tube de taille appropriée et incorporez un connecteur en T, qui sera utilisé pour fournir du deterium.

Ensuite, alignez le capillaire intérieur en verre avec l’extrémité du capillaire métallique, ce qui peut être facilité par une visualisation au microscope optique. Marquez-la comme la position zéro millimètre. Fixez ce mélangeur cinétique à une extrémité du T de mélange.Fixez ensuite un capillaire en verre de silice fondu de 40 centimètres à l’extrémité opposée du mélangeur cinétique sur le T de mélange.Pour l’activation de la pepsine, suspendez 20 milligrammes de pepsine de la muqueuse gazeuse de Porsena dans un millilitre de tampon de couplage.

Ajoutez 50 milligrammes de vitesses agro activées par le NHS aux protiens remis en suspension et tournez doucement pendant la nuit, à quatre degrés Celsius. Le lendemain, faites tourner le mélange à mille fois G pendant deux minutes à température ambiante pour récupérer la résine. Aspirez ensuite les protiyes non liés.

Ensuite, incubez l’agros dans un millilitre de tampon de blocage et tournez-le doucement à température ambiante pendant une heure. Après avoir recueilli la résine et aspiré le tampon de blocage, incubez la pepsine agguros avec un millilitre d’acide acédique à cinq pour cent pendant cinq minutes. Faites tourner le mélange à 1 000 fois G, pendant deux minutes à température ambiante, pour recueillir la résine, puis aspirez le surnaturel.

Après avoir répété les étapes précédentes, pour un total de trois lavages, stockez les billes dans un millilitre d’acide acédique à quatre degrés Celsius pour une utilisation à long terme. Pour assembler l’appareil, remplissez une chambre de prodialyse avec une boue de billes de pepsine agguros activées dans de l’acide acédique à cinq pour cent à l’aide d’une spatule stérile. Placez la plate-forme micro falitique en PMMA entre deux blocs de PMMA vierges comme couvercle pour sceller l’appareil, doublé de caoutchouc de silicone pour créer un joint étanche aux liquides.

Utilisez des plaques de serrage métalliques pour sceller sous pression l’appareil. Fixez ensuite le T de mélange à l’entrée de l’appareil à l’aide des raccords appropriés. Maintenant, coulez cinq pour cent d’acide acédique pensé à la ligne d’acide à un taux de dix microlitres par minute.

Ensuite, faites couler un tampon d’acide amonia de 50 millimètres à travers la ligne de protéines à raison d’un microlitre par minute. Couplez l’appareil à l’extrémité avant d’un spectromètre de masse à temps de vol quadrapole modifié, ou Qtof, à l’aide d’une platine isolée réglable pour obtenir des conditions optimales d’électropulvérisation. Après avoir défini les conditions ESI-MS, acquérez un spectre de pepsine uniquement.

Ensuite, introduisez 50 à 100 micromolers de protéine tau ou phospho-tau à raison d’un microlitre par minute, là où le tampon d’acitate d’ammonium de 50 millimètres s’écoulait auparavant. Après avoir laissé le système s’équilibrer pendant au moins 10 minutes, avant l’acquisition, acquérez uniquement le spectre protéique. Pendant que la protéine Tao, ou phospho tao, s’écoule, introduire de l’oxyde de dutérium à raison de trois microlitres par minute, via le connecteur T, et laisser réagir dans le mélangeur cinétique.

Afin d’augmenter le temps d’étiquetage, tirez manuellement la position du capillaire intérieur en verre pour obtenir des temps de mélange de 42 millisecondes à huit secondes, permettant au système de s’équilibrer pendant au moins 10 secondes entre chaque retrait. Cette animation décrit le flux de travail d’une expérience typique. La protéine sort par l’encoche et se mélange au dutérium venant en sens inverse.

Les hydrogènes M8 du squelette sont échangés pendant le temps de réaction imparti, qui peut être modifié en retirant le capillaire protéique. La réaction est ensuite éteinte puis digérée sur une plateforme microfluidique contenant une aiguille ESI de sortie. Le spectre résultant contient des protéines digérées.

Le pourcentage d’absorption de deutérium est calculé pour chaque peptide, puis cartographié sur la structure protéique 3D. Les profils de digestion du phospho-tau natif et du phospho-tau étaient similaires, produisant une couverture de séquence de 77,1 et 71,7 pour cent, respectivement, les distributions isotopiques les mieux ajustées et les valeurs d’absorption de deutérium associées pour quatre peptides simples sont présentées ici. Le tracé cinétique observé du pourcentage d’absorption de deutérium, en fonction du temps, pour chaque peptide est utilisé pour extraire le taux expérimental observé.

Les profils de quale aléatoires calculés sont présentés à des fins de comparaison et sont utilisés pour extraire la note intrinsèque théorique. Comme prévu, aucun facteur de protection n’a été observé dans la gamme, normalement associé à des éléments de structure secondaires, confirmant que la protéine tau native présente une faible liaison hydrogène interne. Une protection significative est observée aux extrémités N et C, dans le domaine central et dans les régions sujettes aux agrégations.

Dans la protéine tau liée à l’hyperphophopho, une augmentation générale de l’absorption de deutérium a été observée dans l’ensemble de la protéine. Il y a des augmentations significatives aux extrémités N et C et dans la région de l’hexapeptide deux. Le degré de protection des facteurs est coloré comme un schéma arc-en-ciel, comme illustré ici.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures, si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser des régions de niveau HPC, ou supérieur, pour minimiser les contaminants, car ils peuvent interférer avec l’analyse. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, telles que le marquage covalent, la réticulation chimique, la modélisation informatique et les docu-études, peuvent être effectuées afin de faire correspondre les structures protéiques tridimensionnelles, ou de confirmer les zones d’interaction protéine-protéine et protéine legine.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale, pour explorer les protéines et les domaines intrinsèquement désordonnés, les plus fréquents dans les maladies nuérodégénératives. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’ionisation par électro-pulvérisation résolue en temps, l’échange d’hydrogène-deutérium, la spectométrie de masse, pour l’étude de la structure et de la dynamique des protéines.