Name: Résolue en temps déchange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour létude de la structure des protéines et dynamique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez la spectrométrie de masse par échange hydrogène-deutérium résolue en temps pour étudier la dynamique structurale des protéines ordonnées et désordonnées. Cette méthode permet de surveiller les réactions à l'échelle de la milliseconde.

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Nous remercions le Dr Markus Zweckstetter d’avoir fourni le fichier de coordonnées pdb pour l’ensemble tau 'natif' prédit à partir de ses travaux de RMN, avec les outils d’analyse fournis par le Dr Adnan Sljoka. Ces travaux ont été financés par le programme de subventions ENGAGE du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

REMARQUE: S&#39;il vous plaît consulter toutes les fiches de sécurité des matières pertinentes (FS) avant utilisation. Fumées produites par ablation au laser de poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) peuvent être toxiques. Assurez-vous que le graveur laser est relié à un système de ventilation du travail. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la construction du dispositif microfluidique, y compris l&#39;utilisation des contrôles techniques (hotte, collecteur de déchets) et de l&#39;équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, masque, gants, blouse, pantalon pleine longueur, des chaussures fermées). Il est d&#39;une importance capitale pour utiliser des réactifs de qualité chromatographie liquide à haute performance (HPLC) lorsque cela est possible, avec tous être de qualité ACS ou plus pour réduire les contaminants parasites lors de l&#39;analyse. 1. Préparation du dispositif microfluidique <ol><li> La construction du PMMA plateforme microfluidique <ol><li> Obtenir un bloc PMMA standard (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) et laser-ablater un canal d&#39;entrée pour l&#39;introduction des réactifs, un protéola chambre de lyse, et un canal de sortie en utilisant un graveur laser 17, 18. REMARQUE: graver la chambre de protéolyse dans une forme ovale allongée (30 x 5 x 0,05 mm). L&#39;entrée et le canal de sortie doit prolonger jusqu&#39;à l&#39;extrémité du bloc de PMMA et pas être supérieure à 75 um en largeur et en profondeur afin d&#39;accueillir un capillaire de 30 ga. </li><li> Couper une 30 ga capillaire métallique en acier inoxydable en deux morceaux d&#39;environ 10 cm chacun au moyen d&#39;un outil rotatif avec un disque de coupure d&#39;épaisseur 1/64&quot; . Utilisation du papier de verre pour lisser les extrémités des capillaires (ce qui peut être facilité par visualisation sous un microscope optique). </li><li> Faire fondre les capillaires dans le bloc poly gravé (méthacrylate de méthyle) en utilisant un fer à souder. Le canal d&#39;entrée est relié à des pompes à seringue automatique, et le canal de sortie est utilisé pour le couplage dans la MS. </li></ol></li><li> La construction du temps résolu cinétique mélangeur à flux continu <ol><li> Obtenir une fusioncapillaire en silice vitreuse (ID: 75 pm, diamètre extérieur: 150 um) d&#39;environ 40 cm, et l&#39;insérer dans un tube capillaire métallique en acier inoxydable de 28 ga d&#39;environ 15 cm. En fonction du temps de réaction nécessaire, utiliser un capillaire métallique externe plus ou avec un plus grand diamètre. REMARQUE: La détermination de la « vraie » diamètre intérieur du capillaire de métal est critique pour obtenir des temps de réaction précises. Ceci peut être réalisé en fixant le tube capillaire métallique à une HPLC, écoulement de solvant si le capillaire, et l&#39;enregistrement de la pression de retour. Une contre-pression de calcul de diamètre intérieur peut être faite, et le véritable diamètre intérieur du capillaire métallique déterminée. Cela peut être calculé à l&#39;aide du logiciel Poids moléculaire Calculator (pour Windows version 6.49). </li><li> Produire une encoche de 2 mm en utilisant de faibles paramètres de graveur laser de puissance sur une extrémité du capillaire de verre intérieure et sceller cette extrémité du capillaire de verre intérieure (figure 2). Vous pouvez également faire l&#39;encoche en utilisant un Cappilar en verre céramiqueOutil de coupe y ou un broyeur rotatif avec une lame de coupe de précision. </li><li> Alignement du capillaire de verre intérieure avec l&#39;extrémité du tube capillaire métallique (ce qui peut être facilité par visualisation au microscope optique). </li><li> Attacher ce mélangeur cinétique à une extrémité du mélangeur en T (Figure 2). </li><li> Fixer un capillaire en verre de silice fondue (ID: 75 pm, diamètre extérieur: 150 um) d&#39;environ 40 cm à l&#39;extrémité opposée du mélangeur cinétique sur le té de mélange. Ceci est utilisé pour fournir l&#39;acide (5% d&#39;acide acétique, pH 2,4) pour tremper la réaction. REMARQUE: Les réactifs sont fournis à l&#39;appareil avec des seringues étanches aux gaz à travers un tube de polytétrafluoroéthylène (PTFE) en utilisant des pompes à perfusion automatique. </li></ol></li><li> Activation de la pepsine <ol><li> Peser 20 mg de pepsine à partir de muqueuse gastrique de porc et de le suspendre dans 1 ml de tampon de couplage (0,1 M de phosphate de sodium, NaCl 0,15 M, pH 6,0). </li><li> Peser 50 mg de N - hydroxysuccinimide (NHS) des billes d&#39; agarose activées par , ajouter à la re-suspended protease et faire tourner doucement pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Centrifuger à 1000 g pendant 2 min à température ambiante pour recueillir la résine. </li><li> Aspirer la protéase non liée. </li><li> Incuber la gélose dans 1 ml de tampon de blocage (1 M Tris-HCl, pH 6,0) et faire tourner doucement à la température ambiante pendant 1 h. </li><li> Centrifuger à 1000 g pendant 2 min à température ambiante pour recueillir la résine. </li><li> Aspirer le tampon de blocage. </li><li> Incuber la pepsine-agarose avec 1 mL de 5% d&#39;acide acétique, pH 2,4 pendant 5 min. </li><li> Centrifuger à 1000 g pendant 2 min pour recueillir la résine. </li><li> Aspirer le surnageant. </li><li> Répétez les étapes 1.3.8 - 1.3.10 pour un total de trois lavages. </li><li> Stocker les billes dans de l&#39;acide acétique à 1 ml à 4 ° C pour une utilisation à long terme. </li></ol></li><li> Assemblée de l&#39;appareil <ol><li> Remplir la chambre de protéolyse avec la suspension de billes d&#39;agarose activées pepsine à 5% d&#39;acide acétique à l&#39;aide d&#39;une spatule stérile. </li><li> Placez le platfor microfluidique PMMAm entre deux blocs de PMMA blanc comme un couvercle pour sceller le dispositif, garni de caoutchouc de silicone pour créer un joint étanche aux liquides. </li><li> Utiliser des plaques de serrage métallique à la pression du dispositif d&#39;étanchéité. REMARQUE: La pince a été fait sur mesure afin d&#39;adapter la plate-forme microfluidique et se compose de deux plaques de mesure 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. </li><li> Couler 5% d&#39;acide acétique, pH 2,4 à un débit de 10 ul / min. L&#39;écoulement du tampon acétate d&#39;ammonium 50 mM (pH 6,9), même si la ligne de protéine à un débit de 1 pl / min. NOTE: Il est extrêmement important que l&#39;acide acétique circule en continu à travers le dispositif tout au long de l&#39;ensemble de l&#39;expérience. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites et que le fluide est sortie uniquement à partir du canal de sortie, qui servira comme source ESI. </li><li> Coupler le dispositif à l&#39;extrémité avant d&#39;un spectromètre de masse quadripolaire à temps de vol (Q-TOF) modifié à l&#39;aide d&#39;un étage isolé réglable pour obtenir des conditions optimales électronébulisation. REMARQUE: Un commutateur de dérivationest introduit afin de simuler la présence d&#39;une source commerciale ESI. 17 </li></ol></li></ol> 2. résolue en temps ElectroSpray Ionisation échange hydrogène-deutérium <ol><li> Acquisition de pepsine et de protéines seulement Spectra REMARQUE: acquisition ESI-MS est effectuée en mode d&#39;ions positifs à une tension de 4500 à 5000, le potentiel declustering 60-V, et la focalisation de 250 V potentiel. Les spectres sont acquis sur une plage de 350-1,500 m / z avec une vitesse de balayage de 1 s -1. <ol><li> Acquérir une seule pepsine spectre. Tous les pics apparaissant dans ce spectre sont soustraites une fois que la protéine est ajouté. </li><li> Introduire 50-100 uM tau / tau protéine phospho-(purifier et préparer de la manière décrite précédemment 13, 19) à un débit de 1 pl / min , où le tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium 50 mM a été précédemment circule. </li><li> L&#39;acquisition d&#39;une seule protéine spectre. </li></ol></li><li> acquisition of Points Temps <ol><li> Alors que 100 uM tau / tau protéine phospho-coule à 1 uL / min, introduire D 2 O à un débit de 3 ul / min au moyen d&#39; un raccord en T et permettre de réagir dans le mélangeur cinétique. Laisser le système se stabiliser pendant au moins 10 min avant l&#39;acquisition du spectre. REMARQUE: Après l&#39;échange, la réaction de marquage est arrêtée par l&#39;écoulement du pH de l&#39;acide acétique 2,4 à 10 ul / min et la digestion de la protéine marquée se produit dans la chambre protéolytique. </li><li> Afin d&#39;augmenter le temps d&#39;étiquetage, tirer manuellement en arrière de la position du capillaire en verre interne pour obtenir des temps de mélange de 42 ms à 8 s. Laisser le système se stabiliser pendant au moins 10 min entre chaque pull-back. </li></ol></li></ol> 3. Les données et l&#39;analyse statistique <ol><li> L&#39;identification et Peptides calcul du pourcentage de Deutérium échange <ol><li> Effectuer des analyses MS spectres en utilisant le logiciel mMass, la version 5.5.0 20 </sup&gt;. </li><li> Identifier les peptides en utilisant le ExPASy FindPept serveur protéomiques et confirmer par dissociation induite par collision (CID) en cas de besoin 21. REMARQUE: Ici, l&#39; incorporation de l&#39; absorption de deuterium a été mesurée à l&#39; aide d&#39; un logiciel développé FORTRAN en interne pour l&#39; analyse de la distribution isotopique 22, 23. </li><li> Calculer les taux intrinsèques théoriques basés sur la séquence primaire à l&#39; aide de l&#39;outil Web SPHERE 22, 24. </li><li> Ajuster les données en utilisant une régression non linéaire et exponentielle unique normaliser au moyen d&#39; un graphique et un logiciel statistique (par exemple, SigmaPlot). NOTE: Le rapport de k int / k obs donne le facteur de protection (PF), une mesure semi-quantitative du degré auquel une région donnée est structurée au sein de l&#39;ensemble conformationnelle. </li></ol></li></ol>

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Bien que les méthodes de biologie structurale telles que cristallographie et RMN rayons X sont avantageux car ils fournissent des structures extrêmement détaillées des protéines, ces images sont souvent statiques. La caractérisation des espèces transitoires et les domaines faiblement structurés continue d&#39;être difficile à atteindre quand on l&#39;étudie par ces méthodes conventionnelles. Par conséquent, afin de mieux comprendre dynamiques sur ces types de systèmes, il est important de travailler à des échelles de te...

Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés dans le développement de techniques analytiques conçues pour mesurer la structure des protéines et de la dynamique 1, 2, 3, 4. Alors que la cristallographie aux rayons X reste le principal outil pour la détermination de la structure des protéines, des concentrations élevées de protéines sont nécessaires est nécessaire et l&#39;optimisation approfondie pour produire des cristaux de qualité de diffraction. Les protéines qui sont difficiles à cristalliser, telles que des protéines associées à la membrane et intrinsèquement désordonnées ont été étudiés de façon classique par échange hydrogène-deutérium (HDX) RMN 5. Toutefois, dans les dernières décennies, le couplage de la spectrométrie de masse à ionisation électrospray (ESI-MS) à HDX a rapidement gagné en popularité 6, 7. La spectrométrie de masse est une solutionà la plupart des restrictions posées par cristallographie aux rayons X et RMN. En particulier, MS est très sensible (nM à des concentrations uM) nécessaires, et il n&#39;y a pratiquement aucune limite sur la taille des protéines. En outre, le grand cycle de travail d&#39;analyse MS permet la possibilité d&#39;étudier les protéines qu&#39;ils subissent le chiffre d&#39;affaires enzymatique, misfolding, complexation et d&#39;autres processus biologiquement pertinents. Ces processus se produisent souvent sur la milliseconde à la seconde échelle de temps et nécessitent un mélange rapide des réactifs avant l&#39;analyse. Le développement du temps résolu ElectroSpray Ionisation (Trési) par Wilson et Konermann en 2003 des réactions autorisées à surveiller dans le temps pseudo-réel par ESI-MS. Leur configuration incorpore un mélangeur à capillaire avec un volume de chambre de réaction réglable en continu 8. Le dispositif est constitué de deux capillaires concentriques, avec le capillaire interne étanche et d&#39;une encoche découpée dans le côté pour permettre le mélange à l&#39;intérieur de l&#39;espace inter-capillaire étroity espace de l&#39;encoche à l&#39;extrémité du tube capillaire interne (typiquement 2 mm). Lorsqu&#39;il est appliqué à des expériences HDX, le capillaire interne porte la protéine d&#39;intérêt, le capillaire externe porte la solution étiquetage D 2 O, qui subit ensuite le mélange avec la protéine avant d&#39; entrer dans la chambre de réaction réglable permettant d&#39;étiquetage HDX avant le transfert direct dans l&#39;ESI la source. En bref, HDX repose sur squelette hydrogènes d&#39;amide subissant l&#39; échange avec des atomes de deutérium dans la solution 9, 10. L&#39;échange est catalysée par une base à un pH physiologique, avec catalyse acide devenant répandue à un pH inférieur à environ 2,6. Le taux de conversion est basé sur quatre facteurs principaux: pH, température, solvant et de l&#39;accessibilité liaison hydrogène intramoléculaire. Alors que les deux premiers facteurs sont maintenus constants tout au long de l&#39;expérience, le taux de conversion, en particulier au squelette peptidique positions amide, est principalement dependent sur la structure des protéines 11. Régions étroitement pliée avec de vastes réseaux de liaison hydrogène stables dans des hélices a et des feuillets bêta prendra deuterium à des taux sensiblement plus lents par rapport à des boucles et des régions désordonnées (et parfois pas du tout) 12. Cela permet une analyse globale de la protéine, où des perturbations dans la structure (par exemple., Sur l&#39; agrégation ou la liaison au substrat) conduisent à différents absorption de deutérium (Figure 1). Le mélangeur capillaire cinétique peut être incorporé dans une plate-forme microfluidique contenant une chambre protéolytique pour la localisation de l&#39;absorption de deutérium. Cette chambre protéolytique est maintenue à un faible pH afin d&#39;étancher efficacement la réaction d&#39;échange, et nécessite une protéase acide immobilisé afin de digérer la protéine en peptides localisées (figure 2). échange fédérateur de surveillance à milliseconde seconde échelles de temps est particulièrement important pour lala caractérisation des changements conformationnels au sein difficile de caractériser les régions de boucle, des globules fondus, et des protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) de 13, 14. En variante, Trési-HDX peut également être utilisée pour caractériser les protéines qui ne disposent pas de structure atomique résolu par les procédés de cristallographie aux rayons X et RMN, en utilisant l&#39; échange de deutérium couplé à l&#39;algorithme COREX d&#39;approche (DX-COREX) 15, 16. Ce protocole détaillé appliquera Trési-HDX pour étudier la protéine tau, un PCI, tant sa forme native, ainsi que son état hyperphosphorylée pathogène. Alors que la protéine tau native est l&#39; une des personnes déplacées les plus bien étudiés, on sait peu sur son homologue amyloidogène 13.

<table><tbody><tr><td>Poly(méthacrylate de méthyle) ou PMMA</td><td>Plastiques professionnels</td><td>SACR.250CCP</td><td>8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm</td></tr><tr><td>Verre de silice fondue capillaire</td><td>Polymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>ID : 75 &micro ; m, OD : 150 & micro ; m</td></tr><tr><td>Capillaires métalliques</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &ndash ; 89875K97 30 ga&nbsp ; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>Tube en éthylène-propylène fluoré (FEP)</td><td>IDEX</td><td>1477 1548</td><td>ID : 0.007 », OD : 1/16 » ID : 0.020 », OD : 1/16 »</td></tr><tr><td>Coupe-tube polymère standard</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>pour 1/16 » et 1/8 » Tube OD</td></tr><tr><td>Micro Statique Mélange Té</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>pour 1/16" Tube OD</td></tr><tr><td>ou</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>té en acier inoxydable, 0,25 &nbsp ; alésage</td><td>millimétrique Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td><td>ZT1C</td><td>pour 1/16" Tube OD PEEK</td></tr><tr><td>Tee pour 1/16" Tube OD</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 Femelle à Femelle Luer</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK Écrou à deux ailes</td><td>Embout IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>pour 1/16" OD Tubing</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>Série 100 Outil rotatif</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>Disques à tronçonner Jobmate</td><td></td><td>1/64" d’épaisseur</td><td>Stereomaster</td></tr><tr><td>Digital Zoom Microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>Fer à souder</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VersaLaser Universel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>500&nbsp ; et micro ; </td></tr><tr><td>Pompes à seringue</td> d’une capacité L <td>Appareil Harvard</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Activated</td><td>Agarose Fisher Scientific</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>Pepsine de la muqueuse gastrique porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-10X0.6ML</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software/Online Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calculateur</td><td></td> de poids moléculaire CorelDraw X3 Corel <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Version 6.49</td><td>Outil MS open source</td>mMass Version 5.5.0 Outil MS open source ExPASy FindPept Institut suisse de bioinformatique Logiciel Systat SigmaPlot Version 11.0 PyMOL Schr&ouml ;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> dinger</td><td>Version 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

résolue en temps d&#39;échange hydrogène ionisation electrospray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) ont longtemps été un défi pour les biologistes structurels en raison de leur manque d&#39;éléments de structure secondaire stable. Hydrogène-deutérium Exchange (HDX) mesurée à des échelles de temps rapide est particulièrement bien adapté pour détecter des structures et des réseaux de liaison hydrogène qui sont brièvement peuplées, permettant la caractérisation de conformères transitoires ensembles natifs. Le couplage de HDX à la spectrométrie de masse offre plusieurs avantages clés, notamment une sensibilité élevée, une faible consommation d&#39;échantillon et aucune restriction sur la taille des protéines. Cette technique a beaucoup progressé au cours des dernières décennies, y compris la possibilité de surveiller HDX temps d&#39;étiquetage à l&#39;échelle de temps de milliseconde. De plus, en intégrant le flux de travail HDX sur une plate-forme microfluidique logeant un microréacteur de protéase acide, nous sommes en mesure de localiser les propriétés dynamiques au niveau du peptide. Dans cette étude, en temps résolu spectrométrie de masse électrospray (Trési-MS) couplé à HDX was utilisé pour fournir une image détaillée de la structure résiduelle de la protéine tau, ainsi que les changements conformationnels induits sur hyperphosphorylation.

des profils de digestion de la protéine tau-phospho native et étaient similaires, ce qui donne une couverture de séquence de 77,1 et 71,7%, respectivement. Les valeurs d&#39;absorption de deutérium de chaque peptide a été déterminée en ajustant les distributions isotopiques observées avec les distributions théoriques générés en utilisant un logiciel développé FORTRAN en interne. Les meilleures distributions de montage sont représentés (figure 3a) ainsi que les valeurs d&...

flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l&#39;échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

La flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines, et l'objectif global de la spectrométrie de masse par échange hydrogène-deutérium avec ionisation électrospray résolue en temps est d'explorer les changements structuraux rapides qui sous-tendent la fonction des protéines ordonnées et désordonnées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale, telles que la caractérisation de conformations protéiques transitoires, inaccessible aux techniques classiques de haute résolution comme l'électroencéphalographie et la RMN. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de suivre les réactions à l'échelle du milliseconde, ce qui est crucial pour caractériser les boucles, les molten globules et les protéines intrinsèquement désordonnées.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des troubles neurodégénératifs, qui impliquent souvent le mauvais repliement ou l'agrégation de régions protéiques intrinsèquement désordonnées. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les protéines faiblement structurées, elle peut également être appliquée à d'autre

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conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l'échange d'hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques.

Analyser la dynamique des protéines en utilisant l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse

Ici, nous présentons des protocoles détaillés pour la spectrométrie de masse par échange d’hydrogène/deutérium amide à l’état solide (ssHDX-MS) et la spectrométrie de masse de marquage photolytique à l’état solide (ssPL-MS) pour les protéines dans les poudres solides. Les méthodes fournissent des informations à haute résolution sur la conformation et les interactions des protéines à l’état solide amorphe, ce qui peut être utile dans la conception de formulations.

Spectrométrie de masse approches pour étudier la structure des protéines et interactions dans lyophilisées Poudres

L’architecture des complexes protéiques est essentiel pour leur fonction. Combinant différentes techniques de spectrométrie de masse s’est avérée puissante pour étudier leur assemblage. Nous fournissons des protocoles pour la réticulation chimique et spectrométrie de masse native et montrer comment ces techniques complémentaires contribuer à élucider l’architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques.

Combinant la réticulation chimique et spectrométrie de masse des Complexes de protéine intacte pour étudier l’Architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques

Spectrométrie de masse (MS) est devenue un outil important pour l’enquête de structure et la dynamique des assemblages macromoléculaires. Ici, nous intégrons les approches axées sur les MS pour interroger la formation de complexes protéiques et de liaison du ligand.

Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Les synthetases de lanthipeptide catalysent les réactions en plusieurs étapes pendant la biosynthèse des produits naturels peptidiques. Ici, nous décrivons un flux de travail continu, ascendant, de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) qui peut être employé pour étudier la dynamique conformationnelle des synthetases de lanthipeptide, aussi bien que d’autres enzymes semblables impliquées dans la biosynthèse de produit naturel de peptide.

Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

Présenté ici est un protocole pour une approche d’échange hydrogène/deutérium (HDX) basée sur l’électrophorèse capillaire couplée à une spectrométrie de masse descendante. Cette approche caractérise la différence dans les structures d’ordre supérieur entre différentes espèces de protéines, y compris les protéines dans différents états et différentes protéoformes, en effectuant une séparation différentielle simultanée HDX et électrophorétique.

Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante

La spectroscopie de rétrodiffusion neutronique offre un accès non destructif et sans marquage à la dynamique ps-ns des protéines et de leur eau d’hydratation. Le flux de travail est présenté avec deux études sur les protéines amyloïdes: sur la dynamique résolue dans le temps du lysozyme pendant l’agrégation et sur la dynamique de l’eau d’hydratation de tau lors de la formation de fibres.

La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation

L’ensemble structurel de l’alpha-synucléine monomérique affecte sa fonction physiologique et ses propriétés physico-chimiques. Le présent protocole décrit comment effectuer une spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde et des analyses de données ultérieures pour déterminer des informations conformationnelles sur le monomère de cette protéine intrinsèquement désordonnée dans des conditions physiologiques.

Spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde pour l’étude de la dynamique structurelle de l’alpha-synucléine dans des conditions physiologiques

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.

Isolation Lipid Droplet pour l&#39;analyse quantitative de spectrométrie de masse

Découvrez la spectrométrie de masse par échange hydrogène-deutérium résolue en temps pour étudier la dynamique structurale des protéines ordonnées et désordonnées. Cette méthode permet de surveiller les réactions à l'échelle de la milliseconde.

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Résolue en temps d'échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l'étude de la structure des protéines et dynamique

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