Microfluidique numérique pour le traitement automatisé protéomiques

La protéomique clinique est une discipline nouvelle et importante qui promet la découverte de biomarqueurs utiles pour le diagnostic précoce et le pronostic des maladies. Nous décrivons ici une nouvelle méthode de microfluidique numérique, ou DMF, intégrant plusieurs étapes de traitement utilisées en protéomique clinique, notamment l'extraction des protéines, la resolubilisation, la réduction, l'alkylation et la digestion enzymatique. La DMF utilise des microgouttelettes discrètes de protéines d'échantillon sur un réseau d'électrodes et peut être réalisée à température ambiante, permettant ainsi l'analyse automatisée parallèle d'échantillons.

Cette méthodologie représente une avancée significative par rapport aux méthodes conventionnelles et pourrait constituer un nouvel outil utile en protéomique clinique. Bonjour, je suis Steve Sche du laboratoire de la professeure Erin Wheeler du Département de chimie et de l'Institut des biomatériaux et du génie biomédical de l'Université de Toronto. Bonjour, je suis Gabriel du laboratoire Wheeler de l'Université de Toronto.

Et je suis Vivian Luke, également du laboratoire Wearer à l'Université de Toronto. Je suis Erin Wheeler. J'ai la chance de travailler avec Steve Mace et Vivian.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de traitement protéomique utilisant la microfluidique numérique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les protéines et les échantillons biologiques. Commençons donc.

Commencez la procédure sous hotte chimique en nettoyant les substrats en verre avec une solution de piranha. En portant une protection adéquate, la solution de piranha est composée, dans un rapport de trois pour un, d'acide sulfurique concentré et de peroxyde d'hydrogène à 30 %. Une grande prudence est donc requise lors de son utilisation.

Incuber les substrats en verre dans du piranha pendant 10 minutes, puis après le nettoyage, les rincer à l’eau déionisée ou à l’eau déminéralisée et sécher les substrats à l’aide de gaz azote. Placer les substrats à l’intérieur de la chambre d’évaporation par faisceau d’électrons pour un dépôt de chrome d’une épaisseur de 250 nanomètres. Retirer les substrats de la chambre une fois cette épaisseur atteinte, puis les rincer à l’isopropanol et les sécher sur une plaque chauffante pendant cinq minutes à 115 degrés Celsius.

Primer les substrats secs avec de l'hexa méthyl xylazine ou du HMDS par dépôt centrifugé pendant 30 secondes. Appliquer à nouveau par centrifugation à 3000 tr/min le photo-résist S 1811 de Shipley en utilisant des paramètres identiques.

Pré-cuire le substrat directement sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant des minutes. Ensuite, dessiner la résine photosensible par exposition aux ultraviolets ou rayonnement UV pendant cinq secondes à travers un masque photolithographique. Puis, développer les substrats exposés aux UV dans un révélateur Shipley MF 3 21 suffisant pour immerger le substrat pendant trois minutes après.

Rincez le substrat dans de l'eau désionisée après. Faites cuire directement sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant une minute. Gravez le chrome exposé en immergeant les substrats pendant 30 secondes dans une quantité suffisante de solution de gravure du chrome pour les recouvrir complètement.

Rincez les substrats avec de l'eau DI et immergez-les dans un décapant Z 300 T suffisamment pour recouvrir entièrement le substrat pendant 10 minutes, afin d'éliminer le photo-résist restant. Rincez à l'eau DI et séchez à l'aide de gaz azote.

Après ce dépôt, deux à cinq micromètres de Paraline C. Un polymère isolant sur le substrat par dépôt chimique en phase vapeur, déposer 50 nanomètres de Téflon AF pour rendre la surface hydrophobe par revêtement centrifuge d'une solution. 1 % en poids dans de la FC 40 de Flora Nerve à 2000 tr/min pendant 60 secondes sur le substrat.

Répéter avec un substrat en verre oxyde d'indium-étain ou ITO non utilisé pour créer le plot supérieur. Faire cuire les deux substrats sur une plaque chauffante à 160 degrés Celsius pendant 10 minutes afin de mettre en place le dispositif microfluidique numérique.

Retirez les revêtements polymères des plots de contact d'un substrat inférieur en grattant avec un scalpel. Connectez les plots exposés du substrat inférieur à des connecteurs 40 broches alimentés sur un ordinateur exécutant LabVIEW. Nous utilisons une boîte de commande conçue en interne qui contient des relais dont les signaux sont contrôlés par un dpad.

La boîte de commande informatique permet à l'utilisateur de contrôler l'application de 100 volts RMS par signaux de 18 kilohertz à l'appareil via les connecteurs 40 broches. Allumez également un générateur de fonctions et un amplificateur. Assemblez l'appareil en positionnant deux morceaux de ruban adhésif double face d'une épaisseur totale de 140 micromètres sur les bords du substrat inférieur.

Prélvez quatre microlitres d'eau désionisée et déposez-les dans l'un des réservoirs, puis fermez l'appareil en plaçant la lame d'oxyde d'indium-étain non gravée par-dessus, côté revêtement en téflon orienté vers le bas. Fixez un connecteur de masse sur la plaque supérieure. Le programme d'initialisation conçu au laboratoire dans LabVIEW permet de calibrer la commande par rétroaction ; l'appareil est désormais prêt pour les expériences.

Dans ce protocole, nous utiliserons l'albumine sérique bovine ou BSA comme échantillon protéique afin de démontrer la conception et l'utilisation de notre microfluidique numérique. La BSA est diluée dans un tampon de travail ou WB composé de tris HCl 100 millimolaire, pH 7,8, contenant 0,08 % de Tween F127 en poids par volume. Préparez un millilitre de chaque solution d'échantillon et de réactif, et indiquez le réservoir dans lequel il sera ajouté.

Après la préparation des réactifs, retirez la plaque supérieure du dispositif et pipetez quatre microlitres de solution dans le réservoir qui lui est attribué. Une fois les réservoirs remplis, remettez la plaque supérieure sur le dispositif. Utilisez le logiciel interne de visualisation du laboratoire pour exécuter les étapes suivantes.

N'oubliez pas que l'interface informatique permet à l'utilisateur de distribuer environ 600 nanolitres de gouttelettes à partir de réservoirs et de manipuler les gouttelettes sur un réseau d'électrodes. Commencez par distribuer une gouttelette d'échantillon contenant la protéine depuis R1 et une gouttelette de précipitant depuis R2. Fusionnez les deux gouttelettes et laissez la gouttelette combinée incuber pendant cinq minutes afin que les protéines précipitent à la surface.

Éliminer le surnageant, en le dirigeant vers le réservoir de déchets, en prenant soin de ne pas perturber le culot protéique précipité. Pour rincer ce culot, verser trois gouttes de tampon de lavage provenant de R quatre, puis les faire passer sur le précipité protéique avant de les diriger vers le réservoir de déchets. Laisser le précipité sécher, puis ajouter une goutte de tampon de resolubilisation provenant de R cinq directement sur la protéine.

Laisser le tampon incuber pendant 20 minutes jusqu'à ce que le précipité soit dissous. Ensuite, dispenser une goutte d'agent réducteur provenant de R six et la combiner avec la goutte d'échantillon. Mélanger la goutte combinée en l'activant à travers six électrodes selon un motif circulaire.

Laisser le gouttelet incuber pendant une heure à température ambiante. Distribuer un gouttelet d'agent alkylant provenant de R sept et le fusionner avec le gouttelet d'échantillon, puis mélanger. Laisser le gouttelet incuber pendant 15 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière.

Enfin, délivrez une goutte de trypsine à partir du puits R et fusionnez-la avec la goutte d'échantillon, puis mélangez. Laissez la goutte incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius dans une boîte de Pétri sur un bloc chauffant. Pour arrêter la réaction, retirez la plaque supérieure et arrêtez la digestion par pipetage.

Appliquez 0,6 millilitre d'acide trichloroacétique à 2,5 % dans l'eau sur la goutte de réaction. Purifiez le produit de réaction après arrêt en aspirant directement la goutte d'échantillon depuis la plaque inférieure. À l'aide d'une pointe C 18 zip, conformément aux instructions du fabricant, les échantillons peuvent désormais être dilués selon les besoins et analysés par spectrométrie de masse afin d'identifier les protéines présentes dans l'échantillon à l'aide de ce système.

Les protéines analysées par spectrométrie de masse ont été identifiées avec des scores de probabilité inférieurs à 1 × 10⁻³, ce qui correspond à un intervalle de confiance de 99,9 %, et des taux de couverture des séquences d'au moins 30 %. Ainsi, la DMF constitue une méthodologie très utile pour le traitement automatisé des échantillons en protéomique. Nous avons simplement montré aujourd'hui comment nous utilisons la microfluidique numérique pour extraire et traiter des protéines de manière automatisée. Cette méthodologie offre une solution potentielle aux pertes d'échantillons et aux contaminations survenant lors de l'isolement et de l'identification des protéines.

Nous espérons appliquer cette méthode à l'avenir à d'autres applications biologiques, notamment des dosages immunologiques et des dosages cellulaires. Lorsque vous réalisez ce type d'expérience, la chose la plus importante est de vous rappeler de prendre du plaisir. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.