Microfluidique numérique pour le traitement automatisé protéomiques

La protéomique clinique est une nouvelle discipline importante qui promet la découverte de biomarqueurs qui seront utiles pour le diagnostic précoce et le pronostic de la maladie. Nous rapportons ici une nouvelle méthode de microfluidique numérique ou DMF intégrant plusieurs étapes de traitement utilisées en protéomique clinique, notamment l’extraction de protéines, la réduction de la resolubilisation, l’alkylation et la digestion enzymatique. Le DMF utilise des micro-gouttelettes discrètes de protéines d’échantillon sur un réseau d’électrodes et peut être exécuté à température ambiante, ce qui permet une analyse automatisée parallèle des échantillons.

Cette méthodologie représente une avancée significative par rapport aux méthodes conventionnelles et a le potentiel d’être un nouvel outil utile en protéomique clinique. Bonjour, je m’appelle Steve Sche et je travaille pour le professeur de laboratoire Erin Wheeler au Département de chimie et à l’Institut des biomatériaux et du génie biomédical de l’Université de Toronto. Bonjour, je suis Gabriel du Wheeler Lab de l’Université de Toronto.

Et je m’appelle Vivian Luke, je travaille également au laboratoire Wearer de l’Université de Toronto. Je m’appelle Erin Wheeler. J’ai la chance de travailler avec Steve Mace et Vivian.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de traitement protéomique à l’aide de la microfluidique numérique. Nous utilisons ce procédé dans notre laboratoire pour étudier des protéines et des échantillons biologiques. Alors commençons.

Commencez la procédure dans la hotte en nettoyant les substrats en verre dans la solution Piranha. Tout en portant une protection adéquate, la solution de piranha est composée de trois à un concentré d’acide sulfurique à 30 % de peroxyde d’hydrogène. Il faut donc faire attention lorsque vous travaillez avec.

Incuber les substrats en verre dans le piranha pendant 10 minutes et après le nettoyage, rincez-les et désionisez-les ou déminéralisez-les et séchez les substrats avec de l’azote gazeux. Placez les substrats à l’intérieur de la chambre d’évaporation par faisceau d’électrons pour le dépôt de chrome jusqu’à une épaisseur de 250 nanomètres. Retirez les substrats de la chambre une fois cette épaisseur obtenue et rincez-les à l’isopropanol, puis séchez-les sur une plaque chauffante pendant cinq minutes à 115 degrés Celsius.

Amorcez les substrats séchés avec de l’hexaméthyl xylazine ou du HMDS par revêtement par centrifugation à 30 secondes. Code de spin 3000 tr/min à nouveau avec photo Shipley S 1811. Résistez en utilisant des paramètres identiques.

Précuire le substrat directement sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius minutes. Ensuite, modelez la résine photosensible en l’exposant à une irradiation ultraviolette ou UV pendant cinq secondes à travers un masque photo. Ensuite, développez les substrats exposés aux UV dans le révélateur Shipley MF 3 21 Assez pour immerger le substrat pendant trois minutes après.

Rincez le substrat dans le poteau d’eau DI. Cuire directement sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant une minute. Découpez le chrome exposé en immergeant les substrats pendant 30 secondes dans juste assez de gravure au chrome pour les recouvrir complètement.

Rincez les supports à l’eau DI et plongez-les dans un décapant Z 300 T suffisamment pour immerger le support pendant 10 minutes. Pour retirer la résine photosensible restante. Rincer à l’eau DI et sécher à l’azote gazeux.

Suite à ce dépôt, deux à cinq micromètres Paraline C.Un polymère isolant sur le substrat par dépôt chimique en phase vapeur déposent 50 nanomètres de téflon AF pour rendre la surface hydrophobe par revêtement par spin une solution. 1 % poids par poids dans le nerf de la flore FC 40 à 2000 tr/min pendant 60 secondes. Sur le substrat.

Répétez l’opération avec un substrat en oxyde d’indium et d’étain ou en verre ITO non passé pour créer le montant de la plaque supérieure. Cuire les deux substrats sur une plaque chauffante à 160 degrés Celsius. 10 minutes pour configurer le dispositif microfluidique numérique.

Retirez les revêtements polymères des coussinets de contact d’un substrat inférieur en grattant avec un scalpel. Couplez les pastilles exposées du substrat inférieur avec des connecteurs à 40 broches pour alimenter un ordinateur exécutant une vue de laboratoire. Nous utilisons un boîtier de commande fait maison qui contient des relais avec des signaux contrôlés par dpad.

Le boîtier de commande de l’ordinateur facilite le contrôle de l’utilisateur sur l’application de signaux de 100 volts RMS par 18 kilohertz à l’appareil via les connecteurs à 40 broches. Allumez également un générateur de fonctions et un amplificateur. Assemblez l’appareil en positionnant deux morceaux de ruban adhésif double face d’une épaisseur totale de 140 micromètres sur les bords du substrat inférieur.

Pipetez quatre microlitres d’eau DI dans l’un des réservoirs et enfermez l’appareil en positionnant la lame d’oxyde d’indium et d’étain non structurée sur le dessus de l’appareil avec le côté recouvert de téflon vers le bas. Fixez un connecteur de terre à la plaque supérieure. Le laboratoire a créé un programme d’initialisation en vue laboratoire pour calibrer le contrôle de rétroaction : l’appareil est maintenant prêt pour les expériences.

Dans ce protocole, nous utiliserons l’albumine sérique bovine ou BSA comme échantillon de protéine pour démontrer la conception et l’utilisation de notre microfluidique numérique. Le BSA est dilué dans un tampon de travail ou WB composé de 100 millimolaires de tris HCL pH 7,8 avec 0,08 % de poids onique F1 27 par volume. Préparez un millilitre de chaque échantillon et solution de réactif et indiquez le réservoir dans lequel il sera ajouté.

Après la préparation du réactif, retirez la plaque supérieure de l’appareil et pipetez quatre microlitres de solution dans le réservoir qui lui est attribué. Après avoir rempli les réservoirs, replacez la plaque supérieure sur l’appareil. Utilisez le programme interne de vue de laboratoire pour exécuter les étapes suivantes.

N’oubliez pas que l’interface de l’ordinateur permet à l’utilisateur de distribuer environ 600 gouttelettes de nanolitres à partir de réservoirs et de manipuler les gouttelettes sur le réseau d’électrodes. Tout d’abord, distribuez une gouttelette de protéine contenant un échantillon de R un et une gouttelette de précipitant de R deux. Fusionnez les deux gouttelettes et laissez les gouttelettes combinées incuber pendant cinq minutes afin que les protéines précipitent à la surface.

Actionnez le surnageant loin de la protéine précipitée vers le réservoir de déchets. R trois, pour laver la protéine précipitée, distribuez trois gouttelettes de tampon de lavage à partir de R quatre et conduisez-les à travers la protéine précipitée et dans le réservoir de déchets. Laissez sécher le précipité et distribuez une gouttelette de tampon de resolubilisation de R cinq sur la protéine.

Laissez le tampon incuber pendant 20 minutes jusqu’à ce que le précipité soit dissous. Ensuite, distribuez une gouttelette d’agent réducteur de R six et fusionnez-la avec la gouttelette de l’échantillon. Mélangez la gouttelette combinée en l’actionnant sur six électrodes selon un motif circulaire.

Laissez la gouttelette incuber pendant une heure à température ambiante. Distribuer une gouttelette d’agent alkylant de R sept et la fusionner avec la gouttelette d’échantillon, puis mélanger. Laissez la gouttelette incuber pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.

Enfin, distribuez une gouttelette de trypsine de R huit et fusionnez-la avec la gouttelette de l’échantillon, puis mélangez. Laissez la gouttelette incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius dans une boîte de Pétri sur une plaque chauffante. Pour mettre fin à la réaction, retirez la plaque supérieure et arrêtez la digestion par pipetage.

Pointez six millilitres d’acide trichloracétique à 2,5 % dans l’eau sur la gouttelette de réaction. Purifiez le produit de réaction trempé en siphonnant la gouttelette d’échantillon directement à partir de la plaque inférieure. À l’aide d’un embout à fermeture éclair C 18, selon les instructions du fabricant, les échantillons peuvent maintenant être dilués au besoin et évalués par spectrométrie de masse pour identifier les protéines de l’échantillon à l’aide de ce système.

Ensuite, les protéines de spécification de masse ont été identifiées avec des scores de probabilité inférieurs à un fois E à moins trois, ce qui équivaut à un intervalle de confiance de 99,9 % et à des couvertures de séquence d’au moins 30 %. Nous venons donc de montrer aujourd’hui comment nous utilisons la microfluidique numérique pour extraire et traiter les protéines de manière automatisée. Cette méthodologie fournit une solution potentielle pour la perte d’échantillons et la contamination lors de l’isolement et de l’identification des protéines.

Nous espérons appliquer cette méthode à l’avenir à d’autres applications biologiques, notamment les immunoessais et les tests cellulaires. Lorsque vous faites ce type d’expérience, le plus important est de ne pas oublier d’en profiter. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.