Imaging potentiel de membrane avec deux types de capteurs codés génétiquement tension fluorescentes

L’objectif global de cette procédure est de signaler optiquement les changements de potentiel de membrane à l’aide d’un indicateur de tension génétiquement codé. Cette méthode décrira les forces et les faiblesses de l’imagerie avec différentes sondes fluorescentes de tension génétiquement codées. Par exemple, les sondes basées sur FRET offriront l’avantage de l’imagerie ratiométrique mais donneront un signal plus faible.

Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons visualiser l’activité neuronale en temps réel. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal car le rapport signal/bruit n’est pas très important et il existe plusieurs sources de bruit et plusieurs étapes qui peuvent mal tourner. Les nouveaux utilisateurs sont souvent déroutés et les interférences sont considérées comme les vrais signaux.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour déterminer la validité des sondes utilisées et ce qu’elles indiquent réellement. Pour la configuration, un séparateur d’image est installé entre les caméras CCD lentes et rapides pour l’imagerie de GEVI basé sur FRET. Avant l’expérience, insérez un cube de filtre avec un miroir dichroïque et deux filtres d’émission dans le séparateur d’images.

Retirez ce deuxième cube de filtre lors de l’imagerie d’un GEVI avec une seule protéine fluorescente. Pour commencer l’expérience, localisez une cellule HEK293 saine qui présente une forte fluorescence membranaire localisée par rapport à la fluorescence interne et évitez de patcher les cellules circulaires pendant qu’elles se divisent ou meurent. Appliquez ensuite une impulsion de test pour vérifier la réponse actuelle.

Ensuite, abaissez la pipette patch clamp juste au-dessus de la surface de la cellule. Ensuite, abaissez lentement la pipette jusqu’à ce qu’elle touche doucement la membrane cellulaire. La résistance de la membrane doit augmenter à un à deux mégaohms.

Après cela, établissez un joint gigaohm en appliquant doucement une pression négative à travers la pipette. Une fois qu’une étanchéité gigaohm est obtenue, réglez le potentiel de la pipette à un potentiel de maintien souhaité. Ensuite, concentrez la caméra CCD à grande vitesse sur le corps de la cellule.

Pour l’enregistrement GEVI basé sur FRET, ajustez la taille des images divisées pour obtenir une vue uniformément espacée pour chaque longueur d’onde d’émission à l’aide des boutons du séparateur d’images. Ensuite, rompez la membrane cellulaire en appliquant une pression négative afin de former l’ensemble de la configuration cellulaire. Maintenant, ouvrez le logiciel d’imagerie.

Cliquez ensuite sur le menu d’acquisition de la caméra SciMeasure pour ouvrir la page d’acquisition CCD. Ensuite, créez un nouveau fichier de données pour sauvegarder l’enregistrement. Cliquez sur la sortie analogique, puis lisez un ASCII pour ouvrir un fichier de protocole d’impulsion afin d’effectuer l’imagerie.

Cliquez ensuite sur la moyenne des répétitions internes pour calculer la moyenne du nombre d’essais. Fermez ensuite la page de sortie analogique. Définissez les paramètres d’acquisition spécifiques sur la page d’acquisition CCD.

Ensuite, entrez les valeurs spécifiques pour le nombre de trames pour l’acquisition et le nombre d’essais. Ensuite, cliquez sur le bouton Prendre des données optiques plus BNC pour démarrer l’enregistrement. Pendant l’imagerie de tension, surveillez l’oscilloscope pour assurer une configuration stable de la cellule entière tout au long de l’enregistrement.

Pour calculer le changement de fluorescence fractionnaire, cliquez sur fichier, puis sur Lire le fichier de données pour ouvrir un fichier de données enregistré à l’étape précédente. L’image de la cellule dans son intensité lumineuse au repos doit être vue sur le côté droit. Ensuite, cliquez sur afficher les BNC pour afficher les valeurs de tension finale actuelle.

Changez le mode de page d’une image RLI à une soustraction d’image afin d’utiliser la fonction de soustraction d’image pour identifier les pixels avec des signaux optiques réactifs. Ensuite, sélectionnez deux points temporels pour la soustraction et identifiez la zone de la cellule qui affiche des signaux en réponse au changement de potentiel de membrane. Ensuite, désignez les pixels qui doivent être analysés en faisant glisser ou en cliquant sur chaque pixel.

La représentation graphique de l’intensité moyenne de fluorescence des pixels sélectionnés doit apparaître sur le côté gauche de la fenêtre du logiciel. Divisez les pixels soustraits avec l’intensité lumineuse au repos en cliquant sur le bouton diviser de RLI pour acquérir les valeurs de changement de fluorescence fractionnaire. Pour exporter les données, supprimez les graphiques de tension finale de courant en décliquant le menu Afficher BNC.

Allez à la sortie, enregistrez les traces comme ASCII affiché pour exporter la trace de fluorescence dans un format de fichier ASCII pour l’analyse de l’ajustement de la courbe. Dans cette procédure, dessinez le graphique de changement de fluorescence en fonction de la tension en traçant les changements de fluorescence fractionnés en réponse à la tension dans un programme d’analyse de données. Après cela, ajustez la courbe à une fonction de Boltzmann afin de déterminer la plage de tension du signal optique en cliquant sur analyse, ajustement, ajustement sigmoïdal puis ouvrir la boîte de dialogue.

Replacez les changements de fluorescence fractionnés normalisés en réponse à la tension à l’aide du programme d’analyse de données. Pour calculer la vitesse de la réponse optique, ouvrez le fichier ASCII et tracez la trace de changement de fluorescence fractionnée en fonction du temps. Cliquez ensuite sur le sélecteur de données dans le logiciel d’analyse de données et sélectionnez un point temporel correspondant au début d’une impulsion de tension échelonnée et un deuxième point temporel où le signal optique a atteint l’état stationnaire.

Ajustez cette plage à une fonction de décroissance exponentielle simple et double en cliquant sur analyse, ajustement, ajustement exponentiel, puis ouvrez la boîte de dialogue et signalez le meilleur ajustement. Cette figure montre le changement de fluorescence d’une cellule HEK exprimant un seul GEVI Bongwoori basé sur FP. Il s’agit d’un changement de fluorescence typique en réponse aux impulsions de tension échelonnées.

Ici, une cellule HEK293 a été filmée avec une caméra CCD à grande vitesse. Cette image montre l’intensité lumineuse au repos d’une cellule exprimant Bongwoori. Et il s’agit d’une image de soustraction de cadre indiquant les pixels où le changement de fluorescence a été observé.

L’enregistrement optique des potentiels d’action induits par les neurones primaires de l’hippocampe de la souris exprimant Bongwoori est illustré. Les potentiels d’action ont été évoqués sous le mode de pince des courants de la cellule entière. La trace de changement de fluorescence fractionnée a été sélectionnée à partir des pixels corrélés au soma.

Dans cette figure, le changement de fluorescence d’une cellule HEK exprimant le GEVI basé sur FRET montre les réponses aux impulsions de tension échelonnées dans deux longueurs d’onde. Enregistré à un kilohertz avec une caméra CCD haute vitesse. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de tester des niveaux de fluorescence variables, car la surexpression de la fluorescence peut affecter la santé de la cellule.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les codages de slicer peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires impliquant l’activité neuronale de divers circuits. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager le potentiel de membrane à l’aide de différents types de sonde.