Name: Imaging potentiel de membrane avec deux types de capteurs codés génétiquement tension fluorescentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez l'imagerie du potentiel de membrane avec des capteurs de tension fluorescents codés génétiquement. Cette méthode permet de visualiser l'activité neuronale en temps réel et d'évaluer les forces et faiblesses des différentes sondes FRET.

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Ce travail a été soutenu par le programme World Class Institute (WCI) de la Fondation nationale pour la recherche de Corée, financé par la subvention WCI 2009-003 du ministère de l’Éducation, des Sciences et de la Technologie de Corée et le projet de programme institutionnel 2E24210 de l’Institut coréen des sciences et de la technologie. Sungmoo Lee a été soutenu par le programme Global Ph.D. Fellowship program (NRF-2013H1A2A1033344) de la Fondation nationale pour la recherche (NRF) sous l’égide du ministère de l’Éducation (MOE, Corée).

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Le système nerveux utilise une tension de plusieurs manières différentes, l&#39;inhibition entraîne une légère hyperpolarisation, entrée synaptique provoque une légère dépolarisation et une action résultats potentiels d&#39;une variation relativement importante de tension. La capacité de mesurer les changements dans le potentiel de membrane par GeViS offre le potentiel prometteur de l&#39;analyse de plusieurs composants de circuits neuronaux simultanément. Dans ce rapport, nous démontrons une méthode fondamentale pour l...

L&#39;objectif principal de cet article est de démontrer l&#39;imagerie optique de l&#39;évolution des potentiels de membrane in vitro utilisant des protéines fluorescentes codées génétiquement. changements d&#39;imagerie du potentiel de membrane offre la possibilité intéressante de l&#39;étude de l&#39;activité des circuits neuronaux. Lorsque des changements dans la membrane résultat potentiel à un changement d&#39;intensité de fluorescence, chaque pixel de la caméra devient une électrode de substitution permettant des mesures non intrusives de l&#39;activité neuronale. Depuis plus de quarante ans, des colorants sensibles à la tension organiques ont été utiles pour observer les changements de potentiel 1-4 membrane. Cependant, ces colorants manquent de spécificité cellulaire. En outre, certains types de cellules sont difficiles à teindre. indicateurs de tension génétiquement codés (GeViS) à surmonter ces limitations en ayant les cellules à étudier spécifiquement expriment la sonde fluorescente sensible à la tension. Il existe trois classes de GeViS. La première classe de GEVI utilise la vodomaine de la phosphatase de détection de tension nsion détection soit avec une seule protéine fluorescente (FP) 5-9 ou un transfert d&#39;énergie par résonance Förster (FRET) paire 10-12. La seconde catégorie de capteurs utilise microbienne rhodopsine comme un indicateur fluorescent directement ou par l&#39;intermédiaire de 13 à 15 FRET électrochrome 16,17. La troisième classe utilise deux composantes, la composante génétique étant une membrane ancrée FP et un second composant étant une membrane lié trempe colorant 18-20. Tandis que les deuxième et troisième catégories sont utiles pour in vitro et trancher les expériences 19,20, seule la première classe de capteurs sont actuellement utile pour des analyses in vivo 6. Dans ce rapport, nous allons démontrer l&#39;imagerie du potentiel de membrane en utilisant la première classe de GeViS (Figure 1) in vitro. Cette première classe de capteurs de tension est le plus facile de faire la transition à l&#39;imagerie in vivo. Depuis GeViS utilizing un domaine de détection de tension fusionné à un FP sont environ 50 fois plus brillante que la classe de rhodopsine de capteurs, ils peuvent être imagés en utilisant un éclairage à lampe à arc au lieu d&#39;exiger un laser extrêmement puissant. Une autre conséquence de l&#39;écart de brillance qui est la première classe de GeViS peut facilement dépasser l&#39;auto-fluorescence du cerveau. Les sondes à base de rhodopsine ne peut pas. La troisième classe de capteur est tout aussi brillante que la première catégorie, mais nécessite l&#39;ajout d&#39;un extincteur chimique qui est difficile à administrer in vivo. Nous allons donc démontrer l&#39;acquisition d&#39;une sonde avec une seule FP (Bongwoori) 8 et une sonde constituée d&#39;une paire de FRET (Nabi 2) 12. Le FRET construit dans le présent rapport sont des versions de papillon de VSFP-CR (protéines fluorescentes sensibles à la tension - Clover-mRuby2) 11 consistant en un donneur fluorescente verte, Clover, et un accepteur de fluorescence rouge, mRuby2, nommé Nabi 2.242 et 2.244 Nabi <sjusqu&#39;à&gt; 12. L&#39;introduction de ces types d&#39;enregistrements devrait permettre aux chercheurs de mieux comprendre le type de GeViS d&#39;information peut fournir. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> Figure 1. Deux types d&#39;indicateurs codés génétiquement tension (GeViS) imagés dans le présent rapport (A) A __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ FP mono GEVI base ayant un domaine de détection de tension trans-membrane et une protéine fluorescente. (B) Un GEVI base de FRET composé d&#39;un domaine de détection de tension trans-membrane, un donneur de FRET et l&#39;accepteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Microscope inversé</td><td>Objectif Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X (ouverture numérique = 1,35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’excitation</td><td>Semrock</td><td>&nbsp ; FF02-472/30</td><td>Pour l’imagerie de tension de la pHluorin super écliptique dans le</td></tr><tr><td>miroir dichroïque</td> Bongwoori <td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’émission</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W Lampe à arc au xénon</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Illuminator</td><td>Les LED et les lasers sont également des sources lumineuses efficaces</td></tr><tr><td>Caméra CCD à vitesse lente</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de caméra à double port</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD haute vitesse</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur d’images</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’excitation</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>Pour l’imagerie de tension de GEVI basé sur une paire FRET composée de Clover et mRuby2)</td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtre anti-émission</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>Filtre anti-émission</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>Système d’isolation des vibrations</td><td>Systèmes cinétiques</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de brassage</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm de diamètre lamelle en verre</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Lipofection</td><td>agent Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de phosphate de calcium</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur à pince de patch</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 Amplificateur</td><td></td>USB</tr><tr><td>Logiciel d’acquisition de données multicanaux</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>Tabsheet Logiciel d’application</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td> <td>d’analyse de donnéesOriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Loupe</td><td>Qioptiq LINOS Optom</td><td>coupleur de caméra standard 0.38x SC38 J clamp</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R Réactif</td><td></td></tr><tr><td>anti-décoloration</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging potentiel de membrane avec deux types de capteurs codés génétiquement tension fluorescentes

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Les indicateurs de tension génétiquement codés (GEVI) se sont améliorés au point de commencer à être utiles pour les enregistrements in vivo. Alors que l’objectif ultime est d’imager l’activité neuronale in vivo, il faut être capable d’imager l’activité d’une seule cellule pour garantir le succès des préparations in vivo. Cette procédure décrira comment imager le potentiel membranaire d’une seule cellule afin de fournir une base pour une imagerie in vivo. Nous décrivons ici des méthodes d’imagerie des GEVI constituées d’un domaine de détection de tension fusionné à une seule protéine fluorescente (FP) ou à deux protéines fluorescentes capables de transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) in vitro. L’utilisation d’un séparateur d’images permet de projeter simultanément des images créées par deux longueurs d’onde différentes sur la même caméra CCD. Le séparateur d’image positionne un deuxième cube de filtre dans le chemin de la lumière. Ce second cube filtrant est constitué d’un filtre dichroïque et de deux filtres d’émission permettant de séparer les longueurs d’onde fluorescentes donneuses et accepteuses en fonction des FP du GEVI. Cette configuration permet l’enregistrement simultané des partenaires fluorescents accepteurs et donneurs tandis que le potentiel de membrane est manipulé via la configuration d’une pince de patch de cellule entière. Lors de l’utilisation d’un GEVI composé d’un seul FP, le deuxième cube de filtre peut être retiré, ce qui permet aux miroirs du séparateur d’image de projeter une seule image sur la caméra CCD.

De manière transitoire des cellules transfectées peuvent présenter une variation significative de l&#39;intensité de fluorescence et le degré d&#39;expression de la membrane plasmique. Même sur le même lamelle certaines cellules auront divers niveaux de fluorescence interne. Ceci est probablement dû à la quantité d&#39;agent de transfection absorbé par la cellule. Parfois, trop expression provoque la cellule de connaître la réponse de la protéine dépliée résultant de l&#39;apoptose ...

Une méthode d’imagerie des changements de potentiel membranaire à l’aide d’indicateurs de tension génétiquement codés est décrite.

Imaging potentiel de membrane avec deux types de capteurs codés génétiquement tension fluorescentes

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

L'objectif général de cette procédure est de rendre compte optiquement des changements de potentiel membranaire à l'aide d'un indicateur génétiquement codé de la tension. Cette méthode décrira les avantages et les inconvénients de l'imagerie réalisée avec différents sondes fluorescentes génétiquement codées de la tension. Par exemple, les sondes basées sur la FRET offriront l'avantage d'une imagerie ratiométrique, mais produiront un signal plus faible.L'avantage principal de cette technique est que nous pouvons visualiser l'activité neuronale en temps réel. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car le rapport signal sur bruit n'est pas très élevé et plusieurs sources de bruit ainsi que plusieurs étapes peuvent entraîner des erreurs. Les nouveaux utilisateurs sont souvent confus et interprètent les interférences comme étant de véritables signaux.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour s'assurer de la validité des sondes utilisées et de ce qu'elles indiquent réellement. Pour le montage, un diviseur d'image est installé entre les caméras CCD lente et rapide afin d'acquérir des images de l'indicateur génétique de variation de potentiel fondé sur la FRET. Avant l'expérience, insérez un bloc filtre contenant un miroir dichroïque et deux filtres d'émission dans le diviseur d'image.Retirez ce deuxième cube de filtre lors de l'imagerie d'un GEVI avec une seule protéine fluorescente. Pour commencer l'expérience, repérez une cellule HEK293 saine présentant une fluorescence membranaire forte et localisée par rapport à la fluorescence interne, et évitez de patcher les cellules circulaires car elles sont soit en cours de division, soit en voie de mort. Appliquez ensuite une impulsion test pour vérifier la réponse en courant.Ensuite, abaissez la micropipette de patch-clamp juste au-dessus de la surface de la cellule. Puis, abaissez lentement la micropipette jusqu'à ce qu'elle touche délicatement la membrane cellulaire. La résistance de la membrane doit augmenter jusqu'à atteindre un à deux mégohms.Ensuite, établir un scellement gigaohm en appliquant doucement une pression négative à travers la pipette. Une fois le scellement gigaohm obtenu, régler le potentiel de la pipette à un potentiel de maintien souhaité. Ensuite, focaliser la caméra CCD haute vitesse sur le corps cellulaire.Pour l'enregistrement du GEVI basé sur la FRET, ajustez la taille des images divisées afin d'obtenir une vue uniformément espacée pour chaque longueur d'onde d'émission à l'aide des molettes du diviseur d'image. Ensuite, rompez la membrane cellulaire en appliquant une pression négative afin d'obtenir la configuration en tout-élément. Ouvrez maintenant le logiciel d'imagerie.Ensuite, cliquez sur acquérir dans le menu caméra SciMeasure pour ouvrir la page d'acquisition CCD. Créez ensuite un nouveau fichier de données pour enregistrer l'enregistrement. Cliquez sur sortie analogique, puis lisez un fichier ASCII afin d'ouvrir un protocole d'impulsion pour réaliser l'imagerie.Ensuite, cliquez sur « moyenne » pour les répétitions internes afin de faire la moyenne du nombre d'essais. Fermez ensuite la page de sortie analogique. Réglez les paramètres spécifiques d'acquisition sur la page d'acquisition CCD.Ensuite, saisissez les valeurs spécifiques pour le nombre d'images à acquérir et le nombre d'essais. Cliquez ensuite sur le bouton d'acquisition de données optiques plus BNC pour commencer l'enregistrement. Pendant l'imagerie voltage-dépendante, surveillez l'oscilloscope afin de garantir une configuration en cellule entière stable tout au long de l'enregistrement.Pour calculer la variation fractionnelle de la fluorescence, cliquez sur fichier, puis sur lire le fichier de données afin d'ouvrir un fichier de données enregistré à l'étape précédente. L'image de la cellule avec son intensité lumineuse au repos doit apparaître sur le côté droit. Ensuite, cliquez sur afficher les BNC pour visualiser les valeurs actuelles de tension de fin.Changer le mode de page du cadre RLI à la soustraction d'image afin d'utiliser la fonction de soustraction d'image pour identifier les pixels présentant des signaux optiques réactifs. Ensuite, sélectionner deux points temporels pour la soustraction et identifier la zone cellulaire qui montre des signaux en réponse au changement de potentiel membranaire. Ensuite, désigner les pixels à analyser en les sélectionnant par glissement ou en cliquant sur chaque pixel.La représentation graphique de l'intensité de fluorescence moyenne provenant des pixels sélectionnés doit apparaître sur le côté gauche de la fenêtre du logiciel. Divisez les pixels soustraits par l'intensité lumineuse au repos en cliquant sur le bouton diviser par l'intensité lumineuse au repos pour obtenir les valeurs de variation fractionnelle de la fluorescence. Pour exporter les données, supprimez les graphiques actuels de tension finale en désactivant le menu afficher les BNC.Accédez à la sortie et enregistrez les tracés tels qu'affichés en format ASCII pour exporter le tracé de fluorescence dans un fichier ASCII destiné à l'analyse par ajustement de courbe. Dans cette procédure, tracez le graphique de variation de la fluorescence en fonction de la tension en représentant les variations fractionnelles de fluorescence en réponse à la tension dans un logiciel d'analyse de données. Ensuite, ajustez la courbe à une fonction de Boltzmann afin de déterminer la plage de tension du signal optique en cliquant sur Analyse, Ajustement, Ajustement sigmoïde, puis ouvrez la boîte de dialogue.Représentez à nouveau les variations fractionnelles normalisées de la fluorescence en fonction de la tension à l'aide du programme d'analyse de données. Pour calculer la vitesse de la réponse optique, ouvrez le fichier ASCII et tracez l'évolution de la variation fractionnelle de la fluorescence en fonction du temps. Cliquez ensuite sur le sélecteur de données dans le logiciel d'analyse et sélectionnez un premier point temporel correspondant au début d'une impulsion de tension en palier, puis un second point temporel auquel le signal optique a atteint un état stable.Adapter cette plage à une fonction de décroissance exponentielle simple et double en cliquant sur Analyse, Ajustement, Ajustement exponentiel, puis en ouvrant la boîte de dialogue et en indiquant l'ajustement le plus approprié. Ce graphique montre la variation de fluorescence d'une cellule HEK exprimant un indicateur génétique de voltage basé sur une protéine fluorescente unique, Bongwoori. Il s'agit d'une variation typique de fluorescence en réponse à des impulsions de tension en escalier.Ici, une cellule HEK293 a été imagée à l'aide d'une caméra CCD haute vitesse. Cette image montre l'intensité lumineuse au repos d'une cellule exprimant Bongwoori. Et ceci est une image de soustraction d'images indiquant les pixels où un changement de fluorescence a été observé.On voit ici l'enregistrement optique des potentiels d'action induits provenant de neurones primaires hippocampiques de souris exprimant Bongwoori. Les potentiels d'action ont été déclenchés en mode de blocage des courants en configuration whole-cell. Le tracé de variation fractionnelle de fluorescence a été sélectionné à partir des pixels corrélés au soma.Dans cette figure, le changement de fluorescence d'une cellule HEK exprimant un GEVI basé sur la FRET montre les réponses à des impulsions de tension en escalier à deux longueurs d'onde. Enregistré à un kilohertz à l'aide d'une caméra CCD haute vitesse. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de tester les niveaux variables de fluorescence, car une surexpression de la fluorescence peut affecter la santé de la cellule.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, telles que les codages par tranches, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'activité neuronale de divers circuits. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'imager le potentiel membranaire en utilisant différents types de sondes.

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