In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d'imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine

L’objectif global de l’imagerie bioluminescente est d’imager in vivo des transitoires calciques fonctionnels, un indicateur de l’activité, pendant de plus longues périodes et dans les structures cérébrales profondes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que à quoi ressemble l’activité basale du cerveau de la mouche pendant le sommeil. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas d’excitation à l’aide de votre laser.

Cela permet d’imager le calcium transitoire plus profondément dans les tissus, et pendant une période plus longue sans photoblanchiment et toxicité, par rapport à l’imagerie classique du calcium. Cette méthode peut donner un aperçu de l’activité cérébrale basale chez la drosophile, et peut également être utilisée avec d’autres organismes modèles, tels que la souris. Pour commencer, préparez la ligne d’intérêt de drosophila melanogaster et les solutions expérimentales, comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement.

Ensuite, la glace anesthésie une seule drosophile en la transférant dans un flacon en verre sur de la glace pendant deux minutes. Ensuite, déplacez la mouche dans une boîte de Pétri réfrigérée et utilisez une paire de pinces pour placer doucement la mouche à l’intérieur d’une pointe de pipette de 1000 microlitres, coupée de manière à ce que la pointe soit à un angle d’environ 35 degrés. À l’aide d’un pinceau, poussez et alignez doucement chaque mouche de sorte que la tête dépasse complètement le bord de la pointe et que la région dorsale soit partiellement exposée.

Ensuite, appliquez la colle dentaire préparée de la tête sur le bord de la pointe de la pipette. Faites très attention à éviter le sommet de la tête. Le collage de la tête est essentiel car il est essentiel de la fixer dans la bonne position pour une dissection et une imagerie réussies.

De plus, un mauvais collage entraînera une fuite de la solution de bague et la mort de l’échantillon avant l’imagerie. Ensuite, placez la pointe de la pipette, avec la braguette attachée, dans le trou de la chambre d’enregistrement et appuyez doucement pour la fixer en place. Utilisez ensuite une colle silicone préparée pour fixer le côté plat de la chambre à l’endroit où il rencontre la pointe de la pipette afin d’éviter toute fuite.

Fixez un morceau de robinet sur le canal de profusion, le bord court, et en s’étendant vers l’arrière de la chambre. Ensuite, placez la chambre avec la mouche sous le microscope et allumez la lampe fluorescente. Ensuite, pipetez un millilitre de solution de bague dans la chambre.

À l’aide d’un couteau chirurgical fin, faites des incisions parallèles de l’arrière de la tête de la mouche à la région anténale des deux côtés. Ensuite, coupez le long du bord de l’œil et faites une incision perpendiculaire au-dessus de l’antenne qui relie les incisions précédentes. Faites une dernière incision à l’arrière de la tête, puis utilisez une paire de pinces fines et pointues pour retirer la cuticule.

Saisissez doucement et éliminez tout tissu respiratoire exposé jusqu’à ce que le cerveau et le corps du champignon fluorescent soient clairement visualisés. Ensuite, utilisez des pinces ultra-tranchantes pour saisir et pincer soigneusement le tissu de l’épithélium neural recouvrant le cerveau afin de l’enlever et de permettre la perméation de la coelentérazine. À l’aide d’une pipette, lavez le tissu deux fois avec un millilitre de solution de ringer pour enlever tous les débris restants de la dissection, puis placez l’échantillon dans une boîte sombre.

Ensuite, pipetez un millilitre de solution de ringer, contenant cinq micromolaires de benzyl-coelenterazine dans la chambre. Fermez la boîte et incubez l’échantillon à température ambiante pendant au moins deux heures. Commencez par allumer le microscope dans l’ordinateur.

Refroidissez également l’appareil photo à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, installez le système de drainage et ajustez les contrôles environnementaux à 20 degrés Celsius. Ensuite, ouvrez l’imageur de photons, créez un nouveau dossier et nommez le premier enregistrement.

Ensuite, mettez en place le système de profusion en ajoutant la solution de chlorure de potassium, de nicotine et de sonnerie dans leurs réservoirs respectifs. Ajustez le débit de sorte que chaque solution se décharge à deux millilitres par minute. Ensuite, placez l’échantillon sur la monture sous le microscope et ajustez le grossissement à 5X.

Ensuite, insérez le tube de profusion dans le canal à travers la ponction. Réglez le microscope sur le mode fluorescent, puis centrez et faites la mise au point sur les corps des champignons. Une fois que les corps des champignons sont nets, réglez le grossissement sur 20X.

Recentrez l’image et ajustez la mise au point. Ensuite, positionnez l’appareil de drainage au-dessus de la piscine de drainage et ajustez la hauteur du shunt de drainage, de sorte que la pointe soit juste au-dessus de la piscine de drainage. Ensuite, rincez l’échantillon avec une solution de ringer pendant 30 secondes pour vérifier que le drainage est adéquat.

Enfin, abaissez le bouclier pour isoler l’appareil de toute lumière extérieure. À l’aide du système automatisé du programme d’imagerie de photons, ajustez finement la mise au point et prenez une image fluorescente de référence des corps de champignons. Ajustez la vitesse des photons à la vitesse d’enregistrement souhaitée, qui doit aller d’une image toutes les 50 millisecondes à une toutes les secondes, voire plus.

Ensuite, sélectionnez le mode photon et ouvrez l’obturateur. Ensuite, entrez le génotype, le sexe, l’âge et le numéro d’échantillon dans les entrées du journal. Ajustez la position des zones de région d’intérêt sur le calice, les corps cellulaires et les lobes médiaux, en cliquant sur les zones et en les faisant glisser en position tout en maintenant le contrôle enfoncé.

Maintenant, enregistrez les valeurs de référence pendant environ cinq à dix minutes. Ensuite, allumez l’interrupteur pour commencer l’écoulement de la nicotine. En même temps, appuyez sur Entrée et ajoutez une note pour signifier que le flux de nicotine a commencé.

Au bout d’une minute, arrêtez le flux et notez une autre fois dans le journal indiquant que le flux a été arrêté. Ensuite, lavez l’échantillon avec une solution de sonnerie pendant cinq minutes. Pendant que l’échantillon récupère, éteignez le lavage, réglez la minuterie sur cinq minutes supplémentaires et préparez-vous à commencer l’écoulement du chlorure de potassium.

Lorsque vous êtes prêt à commencer, démarrez l’écoulement de chlorure de potassium et entrez 100 millimolaires de chlorure de potassium dans le registre d’échantillons. Au bout d’une minute, arrêtez le débit et entrez l’arrêt du chlorure de potassium dans le registre d’échantillonnage. Ensuite, lavez l’échantillon avec une solution de bague pendant une minute et passez le microscope en mode fluorescent.

Prenez une dernière image fluorescente, puis éteignez la solution de sonnerie et retirez l’échantillon. Dans le programme d’analyse, ouvrez le premier fichier, sélectionnez l’onglet « contrôle d’affichage » et cliquez sur ROI. Ensuite, maintenez le contrôle enfoncé et sélectionnez une région qui vous intéresse.

Ensuite, ajustez la taille, l’orientation et la forme des zones d’intérêt pour englober le calice et les corps cellulaires éclairés par la GFP, ainsi que les lobes médiaux. Une fois que toutes les régions d’intérêt ont été ajoutées, sélectionnez l’onglet « film » pour lire la vidéo photon. Ajustez la deuxième largeur et les deuxièmes marches comme vous le souhaitez.

Réajustez ensuite l’emplacement du retour sur investissement si nécessaire, afin qu’il reste dans les régions actives de la vidéo. Sélectionnez des captures d’écran représentatives de la fluorescence de la GFP, de la réponse nicotinique et de la réponse chlorure de potassium. Ensuite, recadrez les captures d’écran et collez les images représentatives dans une diapositive de présentation pour une analyse et une comparaison ultérieures.

Ajustez à la fois la deuxième largeur et le deuxième pas à la vitesse d’enregistrement en quelques secondes. Sélectionnez également la durée de l’analyse en déplaçant les marqueurs gris du panneau supérieur vers la région entre crochets, avant le lancement du stimulus et juste après la fin de la réponse. Ensuite, sélectionnez suspendre les vues"pendant la lecture, puis appuyez sur le bouton de rembobinage pour réinitialiser la lecture vidéo au début, puis sur le bouton de lecture.

Ensuite, sélectionnez le graphique des taux de comptage d’onglets" afin d’ajuster les unités et d’ajuster également la couleur des régions d’intérêt, ainsi que les couleurs des lignes comme vous le souhaitez. Une fois l’analyse terminée, sélectionnez Exporter les données de taux de comptage. Ensuite, sélectionnez les enregistrements combinés du calice et des corps cellulaires, ainsi que ceux des régions du lobe médial de chaque côté et collez ces images dans une diapositive avec les images de réponse.

L’un des moyens les plus simples de stimuler les corps des champignons est d’activer les récepteurs ionotropes nicotiniques de l’acétylcholine. La réponse typique à la nicotine à 25 micromolaires, illustrée ici, commence par l’activation rapide du calice et des corps cellulaires, ainsi que des lobes médiaux, et utilise la construction GFP-aequorin fusionnée, qui se lie au calcium et émet de la lumière. En général, la réponse dans le calice et les corps cellulaires dure plus longtemps et présente une réponse bioluminescente plus importante que celle des lobes, comme le montrent les panneaux séquentiels de la réponse.

Un exemple d’enregistrement de la réponse bioluminescente à l’activation nicotinique au fil du temps est décrit par ce graphique, où le nombre de photons dans la région d’intérêt contenant le calice et les corps cellulaires est représenté en noir, et le nombre de photons dans la région du lobe médian est indiqué en rouge. À partir de ce graphique, la longueur de la réponse, la valeur maximale des photons pendant la réponse et l’aire totale sous chaque courbe peuvent toutes être déterminées. Une fois maîtrisée, la phase de préparation ne devrait prendre que deux heures avant l’incubation, en fonction du nombre de mouches.

De plus, chaque enregistrement peut être complété en aussi peu que vingt minutes, s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de bien vieillir et conserver le stock de mouches pour assurer la reproductibilité des échantillons. Suite à cette procédure, d’autres tests comportementaux peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l’impact de l’activité de la structure sur un comportement spécifique.

Le développement de cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer l’activité neuronale à long terme dans le cerveau de la drosophile. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons pour l’imagerie bioluminescente dans le cerveau de la mouche. N’oubliez pas que la nicotine peut être dangereuse pour la santé.

Des précautions telles que des gants doivent être prises lors de la préparation des solutions ou du nettoyage de cette procédure.