Gradient de déformation puce pour des comportements cellulaires stimulants en Hydrogel chargés de cellule

L’objectif global de cette puce de déformation de gradient est de fournir une approche simple pour générer des contraintes statiques à gradient non continu sur un hydrogel 3D pour l’étude des comportements cellulaires dans une série de conditions de déformation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la bio-ingénierie, telles que les stimulations de la différenciation d’une cellule souche et la régulation de l’alignement cellulaire pour le développement d’organes tissulaires artificiels. Le principal avantage de cette technique est que différentes souches peuvent être appliquées sur la couche cellulaire et les hydrogels dans le même micro-environnement pour comparer le comportement cellulaire.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation de la puce sont difficiles à apprendre car la lumière doit être terminée en trois à quatre heures pour la base de l’expérience afin d’assurer une grande variabilité cellulaire. Pesez 10 grammes de poudre de gélatine et ajoutez-la dans un flacon en verre avec 100 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS. Placez un barreau d’agitation magnétique dans le ballon et placez le ballon sur une plaque chauffante à agiter.

Couvrez le ballon d’une feuille d’aluminium pour éviter l’évaporation de l’eau. Réglez la température de la plaque chauffante sur 50 à 60 degrés et l’agitateur à 100 tr/min pendant une heure pour dissoudre la poudre de gélatine. Une fois la gélatine dissoute, ajoutez très lentement huit millilitres d’anhydride méthacrylique à l’aide d’une pipette.

Laissez-le réagir à 60 degrés Celsius pendant trois heures. Ajoutez ensuite le DPBS préchauffé dans le ballon jusqu’à un volume final de 500 millilitres. Laissez la solution bien mélanger pendant 15 minutes pour arrêter la réaction.

Pendant ce temps, coupez une membrane de dialyse en plusieurs tubes de 25 millimètres de long. Plongez-les dans de l’eau déminéralisée pendant 15 minutes. Et faites un nœud pour fermer une extrémité des tubes de dialyse.

Chargez la quantité appropriée de solution polymère dans les tubes de dialyse et fermez l’autre extrémité. Placez ensuite les tubes remplis dans un bécher en plastique de cinq litres avec de l’eau déminéralisée pendant une semaine. Renouvelez l’eau déminéralisée deux fois par jour et maintenez la solution à 40 à 50 degrés Celsius pendant le processus de dialyse.

Après la dialyse, prélever la solution des tubes dans une bouteille en verre de 500 millilitres. Versez environ 450 à 500 millilitres de solution dans une coupelle filtrante de 500 millilitres. Et appliquez un vide pour forcer la solution à passer à travers la membrane filtrante pour la stérilisation.

Transférez ensuite le polymère stérilisé dans plusieurs tubes stérilisés de 50 millilitres. Transférez le polymère stérilisé dans plusieurs tubes stérilisés de 50 millilitres et conservez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant trois à cinq jours. Lyophilisez le polymère à moins 80 degrés Celsius pendant une semaine à l’aide d’un lyophilisateur pour former GelMA qui peut ensuite être conservé dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Pour la fabrication de la puce, préparez d’abord le polyméthacrylate ou PMMA, joué et moulé comme décrit dans le protocole texte. Préparez ensuite le couvercle PTMS et la prise PTMS en mélangeant correctement 30 grammes d’élastomère PTMS et trois grammes d’agent de durcissement PTMS. Dégazez le mélange sous une chambre à vide pendant une heure.

Coulez 1,8 à deux grammes du mélange dans le moule en PMMA pour le couvercle PTMS. Utilisez également la quantité appropriée pour remplir chaque cavité du moule en PMMA pour la prise PTMS. De plus, coulez 10 grammes de mélange PTMS non durci dans une plaque en plastique vierge de 10 centimètres.

Mettez ces moules dans une chambre à vide pour dégazer pendant 30 minutes. Durcissez le PTMS pendant deux heures à 80 degrés Celsius. Après avoir refroidi le PTMS durci sur le moule, détachez les couvercles PTMS et les bouchons PTMS des moules en PMMA.

Ensuite, percez deux trous d’un diamètre d’environ trois millimètres aux extrémités des canaux d’écoulement des couvercles PTMS. Coupez la feuille PTMS moulée à partir de la plaque de plastique de 10 centimètres en plusieurs cubes d’un centimètre sur un centimètre. Et percez un trou de trois millimètres dans chaque cube PTMS.

Collez deux cubes PTMS non durcis d’un centimètre sur un centimètre sur les ouvertures du couvercle PTMS pour servir de réservoirs moyens et pour faciliter le processus de durcissement des motifs d’hydrogel circulaires dégradés. Puis durcissez pendant une heure à 80 degrés Celsius. Ensuite, collez les couvercles PTMS avec les deux réservoirs PTMS sur une glissière revêtue de TMSPMA.

Pour ce faire, prétraitez le côté collage du couvercle PTMS et la lame revêtue TMSPMA sous une machine à plasma d’oxygène pendant 90 secondes de traitement au plasma d’oxygène. Contactez la surface traitée au plasma des couvercles PTMS et de la lame TMSPMA et pressez-les étroitement pour une liaison permanente grâce à la formation de la liaison silicium-oxygène-silicium. Imprimez un photomasque en imprimant la mise en page établie sur un film transparent.

Coupez ensuite le photomasque imprimé à 25 millimètres sur 37,5 millimètres. Pesez 25 milligrammes de GelMA lyophilisé dans 0,3 millilitre de milieu de culture cellulaire préchauffé dans un tube de microcentrifugation noir de 1,5 millilitre. Placez le tube de microcentrifugation sur une plaque chauffante d’agitateur de laboratoire jusqu’à ce que le GelMA se dissolve dans le fluide.

Ajoutez 50 milligrammes de photo-initiateur à un millilitre de DPBS dans un tube de microcentrifugation. Et placez-le dans un four à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que le photo-initiateur soit dissous. Ajoutez 25 microlitres de photoinitiateur à 10 % dans le tube de la microcentrifugeuse.

Pipeter plusieurs fois pour bien mélanger. Ensuite, comptez trois millions de cellules NIH3T3 à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Après avoir centrifugé la suspension à 200 G pendant cinq minutes, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 175 microlitres de milieu de culture cellulaire.

Ajoutez la solution cellulaire dans le tube de microcentrifugation pour obtenir une solution cellulaire prépolymère de 5 % de GelMA, 0,5 % de photo-initiateur et environ six millions de cellules 3T3 par millilitre. Après le mélange, chargez 100 microlitres de prépolymère cellulaire dans une microseringue de 100 microlitres. Alignez manuellement un morceau du photomasque sur la lame inférieure de la puce de contrainte à gradient stérilisée.

Et fixez simplement la position à l’aide d’une petite goutte d’eau déminéralisée entre les deux. Connectez la microseringue de 100 microlitres, chargée de solution cellulaire prépolymère à l’entrée de la puce. Placez ensuite 50 microlitres de solution cellulaire de prépolymère dans le canal d’écoulement à l’aide de la microseringue et bouchez la sortie à l’aide d’une prise PTMS.

Injectez 40 microlitres supplémentaires de solution pour créer un renflement convexe dans la membrane circulaire PTMS. Déplacez la puce avec le photomasque, la microseringue et la prise PTMS sous une lampe UV. Et exposez-le pendant 30 à 45 secondes pour réticuler l’hydrogel circulaire concentrique dans la chambre fluidique.

Après la réticulation, retirez la fiche PTMS et la microseringue pour relâcher la pression du liquide. À l’aide d’une seringue d’un millilitre remplie de DPBS préchauffé, il faut laver trois fois les résines non réticulées en rinçant de l’entrée à la sortie. Remplissez ensuite le canal d’écoulement avec environ 100 microlitres de milieu de culture cellulaire.

Placez la puce dans une boîte de culture stérilisée et cultivez dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % à 37 degrés Celsius pendant une semaine. Rafraîchissez le support tous les jours. Prenez des images de trois puces le jour zéro après quatre heures d’incubation en tant que groupe témoin.

Et trois puces le troisième jour comme dispositif expérimental à l’aide d’un microscope avec un objectif 20x. Mesurez la largeur de chaque hydrogel de la ligne un à la ligne 12 à l’aide d’un logiciel pour calculer les taches de compresse. Voici des résultats représentatifs de modèles d’hydrogel avec zéro microlitre et 40 microlitres sur l’injection, après réticulation UV et incubation de quatre heures.

La largeur de ligne de l’hydrogel 3D dans le contrôle sans surinjection semble uniforme comme prévu. Cependant, les motifs d’hydrogel avec 40 microlitres de surinjection donnent une largeur de ligne dégradée des hydrogels diminuant de la ligne un à la ligne 12. Après trois jours d’incubation, les cellules de l’hydrogel s’étendent dans différentes directions.

Les cellules de la première ligne s’alignent le long de la direction radiale en raison de la stimulation de l’allongement de l’hydrogel. Au contraire, les cellules de la ligne 12 s’alignent le long de la forme de l’hydrogel, où le repère géométrique domine l’alignement cellulaire. Il n’y a pas d’alignement cellulaire spécifique à la ligne 7 où les deux indices d’alignement cellulaire de la première ligne et de la ligne 12 s’équilibrent.

Une fois que la mesure du micro-environnement des déformations de gradient sur l’hydrogel 3D peut être effectuée par la puce de déformation de gradient en deux heures si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de stériliser la puce de déformation à gradient avant de charger la solution de prépolymère cellulaire. Essuyez également soigneusement la surface de la puce avec de l’éthanol à 75 % avant de placer les puces dans l’incubateur de culture cellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon de générer une puce de contrainte à gradient pour étudier les comportements cellulaires sous différentes souches impériales.