Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

L’objectif global de ce test immunofluorescent indirect est d’optimiser la localisation et la quantification des protéines centromère-kinétochore endogènes et exogènes, y compris la protéine centromère A et les protéines CENP-A exogènes marquées par drapeau dans les cellules humaines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon d’identifier et de quantifier les protéines centromère-kinétochore. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour quantifier différents niveaux d’expression du centromère-kinétochore en fonction de l’anaphase d’intérêt sélectionnée.

18 heures après l’ensemencement, lavez une fois les cellules cultivées avec du PBS et ajoutez 500 microlitres de milieu sérique réduit dans chaque puits de la plaque de culture en polystyrène à six puits. Ensuite, transfectez les cellules de chaque puits avec une solution de mélange A et B fraîchement préparée et incubez les cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après quatre heures et demie, changez le DMEM à glucose moyen à élevé complété par FBS et des antibiotiques et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.

48 à 72 heures plus tard, aspirez le milieu de culture cellulaire et rincez les cellules une fois avec du PBS, en ajoutant la solution saline sur les côtés des puits de culture pour éviter de déranger les cellules. Fixez ensuite les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. À la fin de la période de fixation, rincez deux fois les cellules avec le tampon Kb2 et perméabilisez les échantillons dans le tampon Kb1 pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, rincez une fois les cellules avec du tampon Kb2 et bloquez toute liaison non spécifique avec l’ajout d’un tampon Kb2 frais. Après cinq minutes à température ambiante, utilisez une pince pour retirer les verres de couverture ensemencés de chacun des puits et utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner des barrières hydrophobes autour de chaque échantillon de verre de couverture. Transférez les verres de protection dans une nouvelle plaque de polystyrène à six puits et immergez les échantillons dans l’anticorps primaire approprié pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, rincez les cellules trois fois avec un tampon Kb2 et marquez-les avec l’anticorps secondaire approprié pendant une autre heure à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, rincez les échantillons avec cinq lavages de 6 minutes dans un tampon Kb2. Ensuite, étiquetez les noyaux cellulaires avec un tampon Kb3 contenant du DapE pendant cinq minutes à température ambiante, suivis d’un à deux lavages dans un tampon Kb2 et d’un remplissage des puits avec du tampon Kb2.

Placez maintenant une goutte de support de montage au centre d’une lame de microscope pour chaque verre de couverture de cellules, et retirez tout liquide des échantillons de cellules. Enfin, placez soigneusement chaque échantillon au centre de l’une des lames de microscope préparées et retirez tout excès de support de montage avec une serviette en papier. Comme observé dans cette expérience représentative, les niveaux d’expression de la protéine endogène CENP-A dans les lysats cellulaires totaux des cellules transfectées par le siRNA CUL4A étaient similaires aux niveaux d’expression de CENP-A dans les cellules transfectées par le siRNA de la luciférase.

De plus, les niveaux de protéines de CENP-A endogène dans les lysats cellulaires totaux des cellules transfectées de RBX1 siRNA étaient similaires aux niveaux endogènes de CENP-A des cellules transfectées de luciferase siRNA, ce qui suggère que la ligase CUL4A RBX1 E3 est nécessaire pour la localisation de CENP-A dans les centromères. Les mutants de lysine CENP-A perdent leur capacité à se localiser dans les centromères, ce qui suggère que l’ubiquitylation de CENP-A K124 est essentielle pour la localisation de CENP-A dans les centromères. Il est important de noter que la fusion exogène de la monoubiquitine de la protéine CENP-A a sauvé le mutant de délocalisation CENP-A K124R, ramenant la protéine à son emplacement centromérique.

Une fois maîtrisées, les procédures de fixation cellulaire et de coloration immunofluorescente peuvent être réalisées en cinq à six heures si elles sont effectuées correctement. N’oubliez pas d’appliquer doucement toutes les solutions sur les côtés des puits afin que les cellules ne soient pas délogées de leurs verres de protection lors du rinçage ou de l’immersion des échantillons. N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde chauffé à l’extérieur d’une pièce ventilée ou que des matériaux inflammables à proximité d’un feu peuvent être extrêmement dangereux et que les précautions appropriées doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.