Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

L'objectif général de ce test d'immunofluorescence indirecte est d'optimiser la localisation et la quantification des protéines endogènes et exogènes du centromère-kinétochore, notamment la protéine A du centromère et les protéines CENP-A exogènes marquées par un flag, dans les cellules humaines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'identification et la quantification des protéines du centromère-kinétochore. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de quantifier différents niveaux d'expression du centromère-kinétochore selon l'anaphase d'intérêt sélectionnée.

18 heures après l'ensemencement, laver les cellules cultivées une fois avec du PBS et ajouter 500 microlitres de milieu à faible teneur en sérum dans chaque puits de la plaque de culture en polystyrène à six puits. Ensuite, transfecter les cellules de chaque puits avec une solution fraîchement préparée du mélange A et B, puis incuber les cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après quatre heures et demie, remplacer le milieu par du DMEM à haute teneur en glucose supplémenté en FBS et en antibiotiques, puis remettre la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire.

48 à 72 heures plus tard, aspirez le milieu de culture cellulaire et rincez les cellules une fois avec du PBS, en ajoutant la solution saline le long des parois des puits de culture afin de ne pas perturber les cellules. Fixez ensuite les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. À la fin de la période de fixation, rincez les cellules deux fois avec le tampon Kb2 et perméabilisez les échantillons dans le tampon Kb1 pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, rincer les cellules une fois avec le tampon Kb2 et bloquer toute liaison non spécifique en ajoutant du tampon Kb2 frais. Après cinq minutes à température ambiante, utiliser des pinces pour retirer les lamelles ensemencées de chacun des puits, puis utiliser un stylo hydrophobe pour tracer des barrières hydrophobes autour de chaque échantillon de lamelle. Transférer les lamelles dans une nouvelle plaque polystyrène à six puits et immerger les échantillons dans l'anticorps primaire approprié pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, rincez les cellules trois fois avec le tampon Kb2 et étiquetez-les avec l'anticorps secondaire approprié pendant une heure supplémentaire à 37 degrés Celsius. À la fin de l'incubation, rincez les échantillons par cinq lavages de 6 minutes dans le tampon Kb2. Puis, marquez les noyaux cellulaires avec le tampon Kb3 contenant du DapE pendant cinq minutes à température ambiante, suivi d'un ou deux lavages dans le tampon Kb2 et de la reconstitution des puits avec le tampon Kb2.

Maintenant, déposez une goutte de milieu de montage au centre d'une lame de microscope pour chaque lame couvre-objet contenant des cellules, puis éliminez tout liquide des échantillons cellulaires. Enfin, placez délicatement chaque échantillon au centre de l'une des lames de microscope préparées et retirez l'excès de milieu de montage à l'aide d'un papier absorbant. Comme observé dans cette expérience représentative, les niveaux d'expression protéique endogène de CENP-A dans les lysats totaux de cellules transfectées avec un ARNi dirigé contre CUL4A étaient similaires aux niveaux d'expression de CENP-A dans les cellules transfectées avec un ARNi dirigé contre la luciférase.

En outre, les niveaux protéiques de CENP-A endogène dans les lysats totaux de cellules transfectées par un ARNi dirigé contre RBX1 étaient similaires aux niveaux de CENP-A endogène observés dans les cellules transfectées par un ARNi dirigé contre la luciférase, suggérant que le ligase E3 CUL4A-RBX1 est nécessaire pour la localisation de CENP-A aux centromères. Les mutants lysine de CENP-A perdent leur capacité à se localiser au niveau des centromères, ce qui indique que l'ubiquitylation de CENP-A au niveau de la lysine 124 est essentielle pour sa localisation aux centromères. De manière importante, la fusion exogène d'une monoubiquitine à la protéine CENP-A a permis de restaurer la localisation du mutant CENP-A K124R, ramenant la protéine à son emplacement centromérique.

Une fois maîtrisées, les procédures de fixation cellulaire et de coloration immunofluorescente peuvent être réalisées en cinq à six heures si elles sont effectuées correctement. N'oubliez pas d'appliquer délicatement toutes les solutions sur les parois des puits afin que les cellules ne se détachent pas de leurs lamelles lors du rinçage ou de l'immersion des échantillons. Souvenez-vous que manipuler du paraformaldéhyde chauffé en dehors d'une pièce ventilée ou des matériaux inflammables à proximité d'une flamme peut présenter un danger extrême, et que les précautions appropriées doivent toujours être prises lors de cette procédure.