Name: Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Découvrez l'immunofluorescence indirecte pour localiser et quantifier les protéines centromère-kinétochores endogènes et exogènes dans les cellules humaines. Cette méthode optimise la détection de CENP-A et s'adapte à divers besoins expérimentaux.

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Ce travail a été soutenu par le NIH subvention GM68418.

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Au cours des dernières années , de nombreuses études ont développé différents tests de microscopie quantitative pour les cellules fixes. 42 Progrès dans centromère-kinétochore biologie nécessite souvent une compréhension de la fonction centromère spécifique ou spécifique à kinétochore de protéines de laquelle la régulation spatio-temporelle subcellulaire reflète l&#39;évolution des fonctions de ces protéines au cours du cycle cellulaire. Par conséquent, nous avons développé ici des procédés de coloration IIF ...

&quot;centromères&quot; ont été classiquement définis comme régions de recombinaison méiotique supprimée en génétique et plus tard reconnu comme la constriction primaire des chromosomes mitotiques, qui joue un rôle essentiel dans la ségrégation des chromosomes lors de la mitose précise. &quot;cinétochores&quot; ont été décrits comme des structures à couches multiples qui se lient aux microtubules à la surface de centromères, telle qu&#39;elle est révélée par microscopie électronique; &quot;cinétochores&quot; ont ensuite été définis comme étant le complexe macromoléculaire qui se localise au niveau du centromère des chromosomes mitotiques. En dépit d&#39;une divergence considérable de séquences d&#39;ADN centromériques parmi les vertébrés, la structure et la composition kinétochore sont hautement conservées. Une interaction dynamique entre microtubules du fuseau et kinétochore est nécessaire pour la ségrégation fidèle des chromosomes lors de la mitose, et les défauts de centromère-kinétochore fonction conduisent à une aneuploïdie et ainsi le cancer. Centromère dans la plupart des eucaryotesa pas de séquence d&#39;ADN définie, mais est composé de grands réseaux (0,3-5 Mo) d&#39;ADN alphoïde répétitif constitué d&#39;ADN α-satellite de 171 pb. Sauf dans la levure bourgeonnante, l&#39; identité de centromère est obtenue non pas par la séquence d&#39;ADN , mais par la présence d&#39;un nucléosome spécial qui contient le variant de l&#39; histone H3 CENH3 (centromère protéine A [CENP-A] chez l&#39; homme). 5 nucléosomes CENP-A localisent au plaque intérieure de kinétochores mammifères 7 et se lient à l&#39;ADN α-satellite de 171 pb. centromères actifs exigent CENP contenant A-nucléosomes pour diriger le recrutement d&#39;un réseau constitutif centromère-associé (CCAN) et les protéines kinétochoriens, qui régulent ainsi l&#39;attachement des chromosomes au fuseau mitotique et la progression du cycle suivant à travers le point de contrôle de la broche. À la lumière de la preuve ci - dessus, CENP-A a été proposé d&#39;être la marque épigénétique du centromère 8; toutefois, le processus par lequel CENP-A est incorporé into ADN centromérique et les facteurs responsables de cette incorporation ont pas encore été bien caractérisée. Un domaine de centromère ciblage courte (DTAC) réside dans le histone fold région CENP-A, et le remplacement de la région correspondante de H3 avec le CATD est suffisante pour H3 directe du centromère. 9 Plusieurs études ont suggéré des rôles fonctionnels pour post-traductionnelle modification (PTM) de CENP-A 12-16; Cependant, les mécanismes moléculaires de ces PTM de CENP-A dans le recrutement à centromères n&#39;a pas encore été élucidé. Nous avons déjà indiqué que l&#39; activité de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 est nécessaire pour CENP-A K124 ubiquitylation et la localisation de CENP-A à centromères 17. La découverte et la caractérisation des protéines kinétochoriens ont conduit à de nouvelles connaissances en ce qui concerne la ségrégation des chromosomes. 18 Plus de 100 éléments kinétochoriens ont été identifiées dans les cellules de vertébrés par diverses approches. Une sous 19,20méthodes permanentes de la façon dont cinétochores assemblent et la fonction vient également de la caractérisation des fonctions cellulaires de chaque réseau centromère-kinétochore protéines et protéine-protéine dans les cellules. 19 visualisation directe et d&#39; imagerie de pointe en microscopie de fluorescence fournissent remarquable résolution de composants centromère-kinétochore et permettent l&#39;observation directe des composants moléculaires spécifiques des centromères et kinétochores. En outre, les méthodes d&#39;immunofluorescence indirecte (IIF) coloration en utilisant des anticorps spécifiques sont cruciaux pour ces observations. Cependant, en dépit de nombreux rapports sur les protocoles IIF, peu abordés dans les problèmes de détail de protéines centromériques-kinétochore spécifiques. 1-4 Ainsi, le développement et les méthodes de déclaration de IIF coloration et un dosage quantitatif IIF pour analyser spécifiquement chaque protéine centromère-kinétochore est extrêmement important. Dans IIF coloration, il faut procéder avec le protocole de coloration pour éviter la perte de la protéine d&#39;intérêt oule reste de la cellule. Cependant, la fixation détruit les sites antigéniques de temps en temps, et des combinaisons anticorps-antigène fonctionne mal avec un fixatif, mais très bien avec les autres, 21 et le choix de fixatif dépend en grande partie de la protéine (s) d&#39;intérêt. Par conséquent, les différentes méthodes de fixateur sont cruciales dans IIF coloration des protéines centromériques-kinétochore. Méthodes ici optimisées immunofluorescence indirecte (IIF), la coloration et un essai pour résoudre la localisation des protéines centromère kinétochore endogènes, y compris CENP-A et les protéines CENP-A exogènes étiquetée FLAG, et la quantification de ces protéines dans des cellules humaines ont été développées. Ces procédés peuvent être appliqués à l&#39;analyse des protéines centromériques-kinétochore dans d&#39;autres espèces.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>réactif de transfection I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>réactif de transfection II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Milieu sérique réduit, chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>DMEM à haute teneur en glucose (Dulbecco' Eagle modifié' s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM à haute teneur en glucose, chaud à 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, certifié, inactivé par la chaleur, origine américaine</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (sérum de veau fœtal)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Eau stérile de qualité culture tissulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Verre Micro Cover (22 mm x 22 mm)</td>Verre de protection <td>Surgipath</td><td>105</td><td>(22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>Grappe de culture cellulaire à 6 puits</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>Plaque de polystyrène à 6 puits&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pénicilline, Streptomycine ; Liquide</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Pénicilline-streptomycine</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp ;</td><td>Site de liaison</td><td>AD100.1</td><td>Stylo barrière hydrophobe (pour une barrière hydrofuge dans la coloration immunofluorescente)</td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>Taxol pour l’analyse des cellules mitotiques</td></tr><tr><td>TN-16, inhibiteur des microtubules (TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 pour l’analyse des cellules mitotiques</td></tr><tr><td>BSA (albumine sérique bovine)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>Réactif bloquant</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>Détergent pour perméabilisation</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>Fixation reagant</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Pour la coloration nucléaire</td></tr><tr><td>p-phénylènediamine</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Pour le montage de</td></tr><tr><td>micro-lames VWR moyennes, dépoli</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro-diapositives&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Anticorps monoclonal de souris ; rapport de dilution de 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CENP-B</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Anticorps monoclonal de souris ; rapport de dilution de 1:200 (IIF, fixation du méthanol/acétone)-1:400 (IIF, fixation du paraformaldéhyde)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CENP-B&nbsp ;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; rapport de dilution de 1:200 (IIF, fixation du méthanol/acétone)-1:400 (IIF, fixation du paraformaldéhyde)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-centromère (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>Antisérum du centromère humain ; taux de dilution de 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CENP-H</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CENP-H</td><td>BD</td><td>612142</td><td>Anticorps monoclonal de souris ; taux de dilution de 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CENP-I</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:1000 (IIF) ; Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-KNL1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Hec1</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Anticorps monoclonal de souris ; taux de dilution de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Hec1</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Ska1</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-drapeau</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Anticorps monoclonal de souris ; rapport de dilution de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-drapeau</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CUL4A anticorps</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; rapport de dilution de 1:3000 (WB) ; Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-RBX1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4397</td><td>Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GAPDH</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Anticorps monoclonal de souris ; taux de dilution de 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anticorps secondaire purifié par affinité)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anticorps</td> secondaire conjugué au fluorophore <td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>(anticorps secondaire purifié par affinité)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anticorps secondaire purifié par affinité)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anticorps secondaire purifié par affinité)</td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre (substitution approuvée du lait en poudre d’œillet)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Réapprovisionnement n° 190915 ; Lot# 90629)</td><td>Lait écrémé</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 microscope à fluorescence motorisé</td>.Microscope à fluorescence motorisé <td>Leica</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x objectif à immersion dans l’huile</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X objectif à immersion dans l’huile</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x objectif à immersion dans l’huile</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X objectif à immersion dans l’huile</td></tr><tr><td>Leica EL6000 source lumineuse compacte</td><td>Leica</td><td></td><td>Source lumineuse externe compacte pour l’excitation fluorescente</td></tr><tr><td>Caméra numérique CCD ORCA-R2&nbsp ;</td><td>Caméra CCD numérique</td><td></td> <td>Hamamatsu C10600-10B</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie scientifique Openlab version 5.5.2</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Pour l’observation, l’acquisition, la quantification et l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Velocity version 6.1.1 Logiciel d’analyse d’images 3D&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Pour l’observation, l’acquisition, la quantification et l’analyse d’images Cocktail</td></tr><tr><td>complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>Comprimés cocktail d’inhibiteurs de protéase</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>Réactif de dosage des protéines commercial I pour la mesure de la concentration en protéines (compatible avec 2 % SDS)</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Réactif de dosage des protéines commercial II pour la mesure de la concentration en protéines (compatible avec 0,1 % SDS)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>membrane PVDF pour le transfert</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>Anticorps secondaire conjugué au colorant fluorescent IR (anticorps secondaire purifié par affinité) ; taux de dilution de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 IgG anti-lapin de chèvre</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>Anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (anticorps secondaire purifié par affinité) ; taux de dilution de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>Anticorps secondaire conjugué à DyLightAnticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (anticorps secondaire purifié par affinité) ; taux de dilution de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-lapin DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>Anticorps secondaire conjugué à DyLightAnticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (Anticorps secondaire purifié par affinité) ; rapport de dilution de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr>Anticorps secondaire conjugué à <td>la souris IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2005</td><td>Anticorps secondaire conjugué à HRP DyLightAnticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (Secondaire purifié par affinité anticorps) ; taux de dilution de 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>IgG-HRP anti-lapin</td><td>de chèvre Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Anticorps secondaire conjugué à la HRPDanticorps secondaire conjugué à DyLightAnticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (anticorps secondaire purifié par affinité) ; taux de dilution de 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab version 5.5.2. Logiciel d’imagerie scientifique&nbsp ;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>Software A</td></tr><tr><td>Volocity version 6.3 Logiciel d’analyse d’images 3D (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity version 6.3 Logiciel d’analyse d’images 3D (quantification de la volocité)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Branson Sonicator à ultrasons Microtip Step, Solide, Fileté 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp ; 33995-325</td><td>Disrupteur pavillon pour sonication</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp ; 33996-185</td><td>Micropointe pour sonication</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Système d’imagerie infrarouge</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Système d’imagerie infrarouge pour la détection d’immunoblot</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse Image Studio Ver 4.0&nbsp ;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Software C</td></tr><tr><td>Imageur moléculaire Versadoc MP4000 System&nbsp ;</td>Imageur de chimiluminescence <td>Bio-Rad</td><td></td><td>pour la détection d’immunoblot</td></tr><tr><td>Quantité Un logiciel d’analyse 1D&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Substrat à sensibilité maximale</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Substrat chimiluminescent amélioré (ECL) ultra-sensible</td></tr></tbody></table>

protéines immunofluorescence analyse des endogènes et exogènes centromere-kinétochoriens

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromères » et « kinétochores » désignent le site où les chromosomes s’associent au fuseau lors de la division cellulaire. La visualisation directe des protéines centromère-kinétochore au cours du cycle cellulaire reste un outil fondamental dans l’étude du ou des mécanismes de ces protéines. Les méthodes d’imagerie avancées en microscopie à fluorescence offrent une résolution remarquable des composants centromère-kinétochore et permettent l’observation directe de composants moléculaires spécifiques des centromères et des kinétochores. De plus, les méthodes de coloration immunofluorescente indirecte (IIF) utilisant des anticorps spécifiques sont cruciales pour ces observations. Cependant, malgré de nombreux rapports sur les protocoles IIF, peu ont discuté en détail des problèmes de protéines centromères-kinétochores spécifiques. 1-4 Ici, nous rapportons des protocoles optimisés pour colorer les protéines centromères-kinétochores endogènes dans les cellules humaines en utilisant la fixation du paraformaldéhyde et la coloration IIF. De plus, nous rapportons des protocoles pour détecter les protéines CENP-A exogènes marquées Flag-Tag-Tag dans les cellules humaines soumises à une fixation à l’acétone ou au méthanol. Ces méthodes sont utiles pour détecter et quantifier les protéines centromères-kinétochores endogènes et les protéines CENP-A marquées par Flag, y compris celles présentes dans les cellules humaines.

L&#39; analyse par immunofluorescence de CENP-A endogène soutient l&#39;hypothèse que CUL4A-ligase E3 est nécessaire pour la localisation de CENP-A centromères Nos études récentes ont montré que l&#39; activité de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 est nécessaire pour ubiquitylation de la lysine 124 (K124) sur CENP-A et la localisation de CENP-A à centromères. 17 Initialement, le complexe interphase-centromère (ICEN) a été isolé par anti-CENP-a...

Ici, nous rapportons des protocoles pour détecter les protéines centromères-kinétochores endogènes et exogènes dans les cellules humaines et quantifions ces niveaux de protéines au niveau des centromères-kinétochores par coloration immunofluorescente indirecte par l’utilisation de la fixation (fixation du paraformaldéhyde, de l’acétone ou du méthanol).

Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

L'objectif général de ce test d'immunofluorescence indirecte est d'optimiser la localisation et la quantification des protéines endogènes et exogènes du centromère-kinétochore, notamment la protéine A du centromère et les protéines CENP-A exogènes marquées par un flag, dans les cellules humaines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'identification et la quantification des protéines du centromère-kinétochore. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de quantifier différents niveaux d'expression du centromère-kinétochore selon l'anaphase d'intérêt sélectionnée.18 heures après l'ensemencement, laver les cellules cultivées une fois avec du PBS et ajouter 500 microlitres de milieu à faible teneur en sérum dans chaque puits de la plaque de culture en polystyrène à six puits. Ensuite, transfecter les cellules de chaque puits avec une solution fraîchement préparée du mélange A et B, puis incuber les cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après quatre heures et demie, remplacer le milieu par du DMEM à haute teneur en glucose supplémenté en FBS et en antibiotiques, puis remettre la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire.48 à 72 heures plus tard, aspirez le milieu de culture cellulaire et rincez les cellules une fois avec du PBS, en ajoutant la solution saline le long des parois des puits de culture afin de ne pas perturber les cellules. Fixez ensuite les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. À la fin de la période de fixation, rincez les cellules deux fois avec le tampon Kb2 et perméabilisez les échantillons dans le tampon Kb1 pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, rincer les cellules une fois avec le tampon Kb2 et bloquer toute liaison non spécifique en ajoutant du tampon Kb2 frais. Après cinq minutes à température ambiante, utiliser des pinces pour retirer les lamelles ensemencées de chacun des puits, puis utiliser un stylo hydrophobe pour tracer des barrières hydrophobes autour de chaque échantillon de lamelle. Transférer les lamelles dans une nouvelle plaque polystyrène à six puits et immerger les échantillons dans l'anticorps primaire approprié pendant une heure à 37 degrés Celsius.Ensuite, rincez les cellules trois fois avec le tampon Kb2 et étiquetez-les avec l'anticorps secondaire approprié pendant une heure supplémentaire à 37 degrés Celsius. À la fin de l'incubation, rincez les échantillons par cinq lavages de 6 minutes dans le tampon Kb2. Puis, marquez les noyaux cellulaires avec le tampon Kb3 contenant du DapE pendant cinq minutes à température ambiante, suivi d'un ou deux lavages dans le tampon Kb2 et de la reconstitution des puits avec le tampon Kb2.Maintenant, déposez une goutte de milieu de montage au centre d'une lame de microscope pour chaque lame couvre-objet contenant des cellules, puis éliminez tout liquide des échantillons cellulaires. Enfin, placez délicatement chaque échantillon au centre de l'une des lames de microscope préparées et retirez l'excès de milieu de montage à l'aide d'un papier absorbant. Comme observé dans cette expérience représentative, les niveaux d'expression protéique endogène de CENP-A dans les lysats totaux de cellules transfectées avec un ARNi dirigé contre CUL4A étaient similaires aux niveaux d'expression de CENP-A dans les cellules transfectées avec un ARNi dirigé contre la luciférase.En outre, les niveaux protéiques de CENP-A endogène dans les lysats totaux de cellules transfectées par un ARNi dirigé contre RBX1 étaient similaires aux niveaux de CENP-A endogène observés dans les cellules transfectées par un ARNi dirigé contre la luciférase, suggérant que le ligase E3 CUL4A-RBX1 est nécessaire pour la localisation de CENP-A aux centromères. Les mutants lysine de CENP-A perdent leur capacité à se localiser au niveau des centromères, ce qui indique que l'ubiquitylation de CENP-A au niveau de la lysine 124 est essentielle pour sa localisation aux centromères. De manière importante, la fusion exogène d'une monoubiquitine à la protéine CENP-A a permis de restaurer la localisation du mutant CENP-A K124R, ramenant la protéine à son emplacement centromérique.Une fois maîtrisées, les procédures de fixation cellulaire et de coloration immunofluorescente peuvent être réalisées en cinq à six heures si elles sont effectuées correctement. N'oubliez pas d'appliquer délicatement toutes les solutions sur les parois des puits afin que les cellules ne se détachent pas de leurs lamelles lors du rinçage ou de l'immersion des échantillons. Souvenez-vous que manipuler du paraformaldéhyde chauffé en dehors d'une pièce ventilée ou des matériaux inflammables à proximité d'une flamme peut présenter un danger extrême, et que les précautions appropriées doivent toujours être prises lors de cette procédure.

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Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

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Présenté ici est un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes de super-résolution dans le tissu intact. Nous avons normalisé les conditions d’imagerie d’une population de cellules souches adultes très sensibles dans son environnement tissulaire natif. Cette technique consiste à équilibrer la résolution temporelle et spatiale pour permettre l’observation directe des phénomènes biologiques dans les tissus vivants.

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L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

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Le mouvement des chromosomes au cours de la prophase méiotique est un phénomène mal compris qui est fondamental pour la formation des spores. Ce protocole décrit une méthode pour acquérir, analyser et quantifier les mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique chez les méiocytes mâles d’Arabidopsis thaliana .

Caractérisation par imagerie en direct des mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique mâle chez Arabidopsis thaliana

Découvrez l'immunofluorescence indirecte pour localiser et quantifier les protéines centromère-kinétochores endogènes et exogènes dans les cellules humaines. Cette méthode optimise la détection de CENP-A et s'adapte à divers besoins expérimentaux.

Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

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