Centrosomes d'imagerie dans Fly testicules

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des marqueurs Centro Somal génétiquement marqués pour dépister de nouvelles mutations génétiques et découvrir la fonction des gènes Centro Somal nouvellement identifiés. Cela peut être accompli par trois stratégies d’imagerie différentes. Imagerie de suivi A des testicules vivants, piste B, fixation chimique des testicules ou immunocoloration de la piste C.

La première étape de la procédure consiste à isoler les testicules de mouches exprimant des protéines centris somales génétiquement marquées, qui peuvent être suivies d’une imagerie immédiate. La deuxième étape consiste à fixer chimiquement les testicules, ce qui peut également être suivi d’une imagerie. Troisièmement, les testicules peuvent être immuno-marqués, puis imagés.

En fin de compte, les emplacements des protéines centri sont identifiés par microscopie à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la zone centrale, telles que la base moléculaire de la formation centrale, l’allongement central et la séparation centrale. Commencez par isoler les testicules de drosophile comme détaillé par la publication JoVE 2 6 4 1.

Après avoir isolé les testicules, plongez l’échantillon dans six microlitres de tampon de coloration dappy à température ambiante fraîchement préparé sur une lame de microscope en verre chargée positivement. Attendez 10 minutes, puis lavez doucement l’excès de DPI en remplaçant deux fois le tampon de coloration. Avec six microlitres de PBS.

Veillez à ne pas laver les testicules. Retirez les solutions de la lame à l’aide d’un morceau de papier filtre pour l’évacuer. Des volumes de six microlitres fonctionnent bien pour des lamelles de 18 millimètres carrés.

Il est maintenant utile d’utiliser un scalpel bien aiguisé pour percer les testicules près du type de cellule d’intérêt, ce qui minimise la pression sur ces cellules pendant l’étape d’écrasement. Ensuite, placez soigneusement une lamelle sur le spécimen et scellez-le avec du vernis à ongles. Marquez ensuite la position des testicules sur la lame avec un stylo et procédez à l’imagerie.

Après avoir isolé les testicules, immergez-les dans une goutte de six microlitres de PBS sur une lame de microscope en verre chargée positivement. Orientez manuellement les testicules de manière linéaire ou selon vos préférences. Ensuite, utilisez un morceau de papier filtre pour évacuer le PBS et remplacez-le par six microlitres de tampon fixe fraîchement préparé.

Après cinq minutes dans le tampon fixe, évacuez-le avec un morceau de papier filtre. Immergez maintenant l’échantillon dans six microlitres de tampon de coloration DPI fraîchement préparé pendant 10 minutes. Lavez le DPI en le remplaçant par deux volumes de six microlitres de PBS.

Ensuite, placez soigneusement une lamelle de 18 millimètres carrés sur le spécimen et scellez-le avec du vernis à ongles. Marquez ensuite l’emplacement des testicules sur la lame et procédez à l’imagerie. Pour cette procédure, préparez d’abord des lamelles siliconées.

Tout d’abord, plongez les lamelles dans un petit plateau de solution siliconée pendant une minute à température ambiante sous une hotte, assurez-vous que les lamelles sont entièrement exposées et ne sont pas empilées les unes sur les autres. Ensuite, lavez les lamelles de couverture trois fois dans l’eau pendant une minute par lavage. Poursuivez avec trois lavages d’une minute à l’éthanol à 70 % et un dernier lavage à l’eau d’une minute.

Laissez ensuite les lamelles siliconées sécher à l’air libre sous une hotte. Après avoir disséqué plusieurs testicules et gravé une lame avec le type d’échantillon, ajoutez cinq microlitres de PBS à la lamelle siliconée et transférez les testicules dans la gouttelette de PBS. Plusieurs lamelles avec chacune un seul testicule sont nécessaires pour assurer le succès.

Ensuite, sous un microscope de dissection, percez soigneusement chacun des testicules comme démontré précédemment. Maintenant, placez doucement un microscope en verre chargé positivement. Faites glisser sur la lamelle, permettant au PBS de se disperser uniformément entre la lamelle et la glissière.

Ensuite, évacuez l’excès de tampon entre la glissière et la glissière, ce qui augmentera la pression sur les testicules et les écrasera. Déposez maintenant la diapositive préparée dans de l’azote liquide. D’autres toboggans peuvent maintenant être préparés et ajoutés au réservoir.

Avant de procéder à l’aide d’une grande pince, retirez l’une des lames de l’azote liquide et utilisez rapidement un scalpel pour retirer la lamelle. L’échantillon doit rester sur la lame pendant le retrait de la lamelle de l’échantillon. Attention à ne pas l’étaler sur la surface de la glissière en S.

Cela peut être réalisé en utilisant un scalpel pour casser le glissement du couvercle en un seul mouvement rapide. Maintenant, incubez les lames dans un bocal de coloration en verre rempli de méthanol. Réfrigéré à moins 20 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après l’incubation, transférez les lames dans un bocal contenant de l’acétone. Réfrigéré à moins 20 degrés Celsius après 30 secondes dans l’acétone. Lavez les lames pendant une minute dans du PBS à température ambiante.

Ensuite, incubez les lames pendant 10 minutes dans du PBST fraîchement préparé pour bloquer les sites non spécifiques Pendant l’incubation de la TB PBS, remplissez les puits d’une chambre d’humidité avec de l’eau Après 10 minutes, retirez les lames du PBST et séchez chaque lame autour de l’échantillon. Veillez à ne pas sécher l’échantillon lui-même. Au fur et à mesure que chaque lame est séchée.

Placez-le dans la chambre d’humidité. Il est important de sécher la zone de la lame entourant l’échantillon avant d’ajouter la solution d’anticorps. Cela permet de s’assurer que l’anticorps reste localisé sur l’échantillon, empêchant ainsi le dessèchement pendant l’étape d’incubation.

Ensuite, déposez doucement 100 microlitres d’anticorps primaires dilués dans du P-B-S-T-B-R fraîchement préparés sur les échantillons. Utilisez une dilution de un à 200 pour les anticorps non caractérisés. Placez ensuite un morceau de paraforme d’un centimètre carré sur l’échantillon pour étaler la solution d’anticorps et protéger la solution d’anticorps contre l’évaporation.

Laissez les spécimens incuber pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, à l’aide d’une pince, retirez délicatement la paraforme des lames. Ensuite, lavez les lames trois fois dans du PBST à température ambiante pendant cinq minutes par lavage.

Ensuite, transférez les lames dans la chambre d’humidité avec l’échantillon vers le haut, ajoutez doucement 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans PBST, BR sur les échantillons. Comme précédemment, appliquez Paraform et attendez une heure pour laver le secondaire avec trois lavages de cinq minutes dans PBST, puis trois lavages de cinq minutes dans PBS. Ensuite, épongez soigneusement les lames pour les sécher sans toucher les échantillons.

Ajoutez six microlitres de support de montage et appliquez une lamelle standard. Après avoir scellé la lamelle avec du vernis à ongles et marqué la position des testicules, procédez à l’imagerie. Les centrosomes subissent de multiples transformations morphologiques et fonctionnelles au cours de la spermatogenèse.

Un processus facilement observable est l’élongation des centrosomes dans les spermatogonie, le marqueur LAR ANA, UNE FGP marque l’ole de 0,6 micron de long que cette ole allonge pendant la spermatogenèse et atteint une longueur de 2,5 microns chez les spermatides presque matures. Étant donné que les huiles centrales des spermatozoïdes de drosophile sont particulièrement longues, l’imagerie peut être utilisée pour faire des déclarations quantitatives concernant l’élongation des centrosomes. Par rapport à la morphologie de type sauvage, diverses mutations qui modifient la croissance centrale ont été identifiées.

Deux exemples sont toujours des mutations précoces et en boulet de canon qui arrêtent la spermatogenèse avant le début de la méiose, mais ne bloquent pas l’élongation centielle chez ces mutants. Les huiles centogènes du spermatocyte mature atteignent environ 2,4 microns par rapport aux huiles centogènes des cellules témoins, qui atteignent une longueur maximale de 1,8 micron. Une fois masterisée, la piste A peut être réalisée en 20 minutes, la piste B en 30 minutes et la piste C en trois à cinq heures selon la taille de l’échantillon. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager le centrosome en vol.