Name: Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Apprenez à identifier les sites de phosphorylation spécifiques de Cdk1 par une analyse de kinase in vitro utilisant des protéines purifiées. Cette méthode fournit des informations mécanistiques sur la régulation du cycle cellulaire.

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Nous remercions le Dr David King, Howard Hughes Medical Institute, Université de Californie à Berkeley pour analyse par spectrométrie de masse et des commentaires utiles. Nous remercions m. Xuelian Zhu, Shanghai, instituts des Sciences biologiques, Académie chinoise des Sciences, Shanghai, en Chine, pour fournir une construction CENP-F pleine longueur. Enfin, nous remercions le Dr Susan Bane, Dr. Brian Callahan et Dr Christof Grewer à l’Université de Binghamton pour l’accès à l’équipement. Cette recherche a été financée par la Fondation de recherche pour la State University of New York et du département de chimie, State University of New York à Binghamton.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Notre analyse de kinase in vitro est une méthode très puissante pour identifier des cibles moléculaires pour la kinase Cdk1, qui est un contrôleur maître du cycle cellulaire et régule les nombreux processus cellulaires importants. La méthode détermine si une protéine purifiée est un substrat pour la Cdk1 et permet l’identification de sites de phosphorylation spécifiques. Ceci facilite les études mécanistiques pour régulation de processus cellulaires par phosphorylation par l’intermédiaire de Cdk1.
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Kinases sont des enzymes transfer groupements phosphate de l’ATP sur des substrats et de réguler les nombreux processus cellulaires. Cette phosphorylation est réversible, rapide, ajoute deux charges négatives et emmagasine l’énergie libre et est l’une des modifications post-traductionnelles couramment utilisées par les cellules. CDK1, qui est également connu sous le nom homologue de protéine 2 cycle de division cellulaire (cdc2) est un contrôleur maître du cycle cellulaire dans tous les eucaryotes1,2,3,4,5et phosphoryle une environ 8 à 13 % du protéome6,7.
Alors que les récentes études protéomiques ont identifié de nombreux sites de phosphorylation de protéines, dans la plupart des cas, la kinase responsable de ces modifications est inconnue. Le nombre de cibles Cdk1 connues, en particulier dans les cellules humaines est faible7. L’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique est importante, car elle permet des études mécanistes qui établissent comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire. Régulation du cycle cellulaire est importante pour la ségrégation des chromosomes fidèle et la division cellulaire, et une myriade de processus cellulaires doivent se produire à l’appui de cette importante fonction physiologique. Cela inclut les enrayer la transcription et la traduction avant le début de la mitose, ainsi qu’une réorganisation dramatique dans la structure cellulaire et l’organisation, comme le démontage de l’enveloppe nucléaire, condensation des chromosomes et assemblage du fuseau mitotique. Déréglementation et erreurs dans ces processus causent cancer, malformations congénitales ou mort cellulaire mitotique. Inhibiteurs spécifiques de Cdk1 tels que RO-3306 ont été développés8, qui fournissent des outils puissants pour des études fonctionnelles, et certains de ces inhibiteurs sont actuellement en essais cliniques pour le traitement du cancer (voir9 pour examen).
Nous décrivons ici une analyse de kinase in vitro qui permet l’identification de sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques. Dans ce test, disponible dans le commerce humain Cdk1/cycline B sert de phosphoryler une cible purifiée protéines in vitro. La phosphorylation du substrat augmente sa masse et ajoute deux charges négatives ; par conséquent, phosphorylation réussie est confirmée par un déplacement vers le haut de la bande de protéine gel SDS-page. Sites de phosphorylation de CDK1 spécifiques sont par la suite identifiés par analyse de spectrométrie de masse des protéines in vitro phosphorylée. Pour vous aider avec le plan expérimental, nous passons en revue également d’outils informatiques et de références pour la prédiction des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique de la séquence protéique. En outre, nous décrivons également les protocoles de purification qui donnent des préparations de protéines très pure et homogène pour l’analyse de la kinase. Enfin, les sites de phosphorylation identifiés doivent être vérifiées par des études fonctionnelles et un essai de liaison simple est décrit ici à cet effet. Combiné, c’est une approche très puissante qui donne des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques et permet des études mécanistes dans Comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire7,10,11. Étant donné que cette méthode s’appuie sur les protéines purifiées, il peut être appliqué à n’importe quel modèle organisme et rendements des résultats fiables. Toutefois, la vérification fonctionnelle de la phosphorylation obtenus sites in vitro est conseillée, car les cellules ont des mécanismes réglementaires supplémentaires mis en place, comme des modifications post-traductionnelles, partenaires d’interaction ou localisation cellulaire qui peut rendre les sites de phosphorylation accessibles ou inaccessibles pour la reconnaissance de Cdk1.
CDK1 reconnaît un site de phosphorylation de consensus qui consiste (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), où X est n’importe quel résidu et une sérine ou thréonine est le site de phosphorylation. Particulièrement importante pour la reconnaissance est la présence de la proline en position + 1. En outre, les résidus basiques sont préférés dans les positions + 2 ou + 3, avec la plupart sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique contenant un Lys ou Arg à la + 3 position6,12.
Activation de Cdk1 est étroitement contrôlée et conduit à l’apparition de la mitose1,2,3,4,5. L’activité des kinases cycline-dépendantes dépend en général de leur association avec les cyclines distinctes (cycline A, B, C, D et E chez les humains), qui sont expriment au oscillant niveaux tout au long du cycle cellulaire13. Expression de CDK1 est constante à travers le cycle cellulaire et la régulation de son activité s’appuie sur son association avec les sous-unités régulatrices cycline A et cycline B5,13,14,15, comme ainsi que les modifications post-traductionnelles. Formation du complexe Cdk1/cycline B est nécessaire pour la kinase activation5,14,15,16,17,18. Dans la phase G2, cycline B est traduit dans le cytosol et importée dans le noyau où il se lie à la Cdk15,14,15,16,17,18; Cependant, la Cdk1/cycline B se tient inactivé par phosphorylation aux résidus Thr14 et Tyr15 par les kinases Cdk1-inhibiteur humains Myt1 (kinase cdc2-inhibitrice associées aux membranes tyrosine et thréonine-spécifique) et Wee1, respectivement19, 20,21. Dans la dernière phase G2, déphosphorylation de Thr14 et Tyr15 par la phosphatase de 25 de cycle de division cellulaire (cdc25) permet d’activer l’activité kinasique du complexe Cdk1/cycline B et déclenche l’ouverture de la mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. la phosphorylation de Thr161 est également requise pour l’activation de Cdk1/cycline B et est véhiculé par Cdk7, le Cdk-activating kinase (CAK)18. Dégradation de la cycline B en anaphase inactive Cdk1, permettant la sortie de la mitose24,25. Activation de Cdk1/cycline B est donc un processus complexe. Le protocole présenté ici est exécuté avec commercialement disponible Cdk1/cycline B. Pendant l’expression recombinante de ce complexe dans des cellules d’insectes, il est activé en vivo par des kinases endogènes14,20 et reste actif à l’État purifié. La résultante active, recombinant humain Cdk1/cycline B convient à des essais in vitro kinase.
Nous décrivons ici un protocole pour l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique dans le centromère humaine protéines F (CENP-F)10. CENP-F est une protéine du kinétochore qui réside dans le noyau pendant la majeure partie de l’interphase (G1 et phase S) et qui est exportée vers le cytosol dans le G2 phase26,27,28 à un Cdk1-dépendante manière10, 11. localisation nucléaire est conférée par une bipartite cNLS26. cNLSs sont reconnus par le facteur de transport nucléaire IMPORTINE α, qui facilite, ainsi que l’IMPORTINE β et RanGDP, l’importation du cNLS-cargo, dans le noyau29. Les exportations nucléaires lors de la phase G2 sont facilitée via une exportation inconnu voie10. Une fois CENP-F se trouve dans le cytosol, il est recruté à l’enveloppe nucléaire et recrute à son tour la protéine motrice complexe dynéine30,31. Cette voie est importante de placer le noyau respectif à centrosome pendant les étapes initiales de l’assemblage du fuseau mitotique de manière dynéine-dépendante, ce qui est importante pour le bon timing d’entrée mitotique et un processus fondamental dans le cerveau développement30,31,32. À partir de la phase G2, CENP-F est aussi rassemblé dans le kinétochore où il a un rôle important pour les fidèles de chromosome ségrégation27,28,33,34,35 . Une étape clé de réglementation de ces voies est l’exportation nucléaire du CENP-F dans la phase G2, qui dépend de la Cdk110,11. Nous décrivons ici un protocole pour l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique dans le cNLS du CENP-F. Phosphomimetic mutations de ces sites ralentissent import nucléaire du CENP-F, ce qui suggère que la Cdk1/cycline B régule directement localisation cellulaire de CENP-F par la phosphorylation de la cNLS10.
Dans l’ensemble, cette analyse de kinase in vitro permet l’identification des substrats spécifiques pour les protéines cibles de kinase Cdk1. purifiée sont phosphorylées in vitro par Cdk1/cycline B complexe disponible dans le commerce et les sites de phosphorylation sont identifiés par la suite par spectrométrie de masse. L’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique prend en charge les études mécanistiques qui révèlent comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Fiole Fernbach à chicanes de 2800 mL</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de benzamidine</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>filtre à flacons</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>recombinant Cdk1/cycline B, humain 20 000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cycline B (source alternative)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cycline B (source alternative)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cycline B + 10x tampon PK</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (résidus 2987 &ndash ; 3065) plasmide pGEX6P1</td><td>Disponible sur demande.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifugeuse : Heraeus Multifuge X3R, refroidie, avec rotor pivotant TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration centrifuge : unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15, coupure 3 kDa, membranes Ultracel-PL</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L méthionine</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td></td><td></td>125650010</tr><tr><td>pointes de pipette de dessalage : Pointes zippées</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>colonnes de chromatographie jetables, Econo-Pac 1,5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS souche</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>ionisation par électronébulisation Ion à transformée de Fourier</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr>spectromètre <td></td><td></td><td></td>de<td>masse à résonance cyclotron</td></tr> par <tr><td>ionisation par électronébulisation Spectromètre de masse à piège ionique</td> Bruker Rotor <td>à</td> angle fixe personnalisé sur mesure <td></td><td>Bruker</td></tr><tr><td>F15-8x-50cy Thermo</td><td>Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>Système FPLC : &Auml ; kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de filtration gel : Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutathion agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutathion, réduit</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>agitateur d’incubation : agitateur multitron</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropyle &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyophérine &alpha ; pet-28a pres plasmide</td><td>Disponible sur demande.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugeuse 5418R, réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel affinity gel : His-Select Nickel affinity gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmide</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>fluorure de phénylméthylsulfonyle</td><td>Biotechnologie Or Biotechnologie</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS protéase : PréScission protéase</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag acrylamide</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>gluthathione réduit Millipore</td><td>Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>tubes à centrifuger à fond rond (tubes Oakridge)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>kit de mutagénèse dirigée par site : QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td><td></td><td></td><td></td>de mutagénèse dirigée par site</tr><tr><td>sonificateur : sonificateur Branson S-250D</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC membrane de dialyse (coupure 6-8 kDa)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>rotor pivotant TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identification de la kinase cycline-dépendante 1 sites de phosphorylation spécifique par une kinase in vitro d’analyse

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) est un contrôleur maître du cycle cellulaire chez tous les eucaryotes et phosphoryle environ 8 à 13 % du protéome ; Toutefois, le nombre de cibles identifiées pour Cdk1, particulièrement dans les cellules humaines est encore faible. L’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique est importante, car elles donnent des indications mécanistes sur comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire. Régulation du cycle cellulaire est cruciale pour la ségrégation des chromosomes fidèle, et défauts dans ce complexe processus conduisent à des aberrations chromosomiques et le cancer.
Nous décrivons ici une analyse de kinase in vitro qui est utilisée pour identifier les sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques. Dans ce test, une protéine purifiée est phosphorylée in vitro par disponibles dans le commerce humain Successful Cdk1/cycline B. phosphorylation est confirmée par SDS-PAGE et sites de phosphorylation sont par la suite identifiés par spectrométrie de masse. Nous décrivons également les protocoles de purification qui donnent des préparations de protéines très pure et homogène qui conviennent à l’analyse de la kinase et un essai de liaison pour la vérification fonctionnelle des sites de phosphorylation identifiés, qui sonde l’interaction entre un signal de localisation nucléaire classique (cNLS) et son récepteur de transport nucléaire IMPORTINE α. Pour vous aider avec le plan expérimental, nous passons en revue les approches pour la prédiction des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique de séquences protéiques. Ces protocoles présentent ensemble une approche très puissante qui donne des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques et permet des études mécanistes dans Comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire. Étant donné que cette méthode s’appuie sur les protéines purifiées, il peut être appliqué à n’importe quel modèle organisme et rendements des résultats fiables, surtout lorsqu’il est combiné avec des études fonctionnelles cellulaire.

Nous avons récemment utilisé un dosage in vitro kinase (Figure 1) pour identifier les sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques dans un fragment de CENP-F qui contenait un cNLS10. Ce signal confère une localisation nucléaire de CENP-F pendant la majeure partie de l’interphase. Dans la phase G2, CENP-F est exporté du noyau vers le cytosol de manière Cdk1-dépendante. Pour obtenir des perspicacités mécanistes sur comment Cdk1 ...

Kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) intervient dans la phase G2 du cycle cellulaire et régule les nombreuses voies cellulaires. Ici, nous présentons un protocole de test in vitro kinase Cdk1, qui permet l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques pour l’établissement de cibles cellulaires de cette kinase importante.

Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

L’objectif global de cet essai de kinase in vitro est d’identifier des sites de phosphorylation dans une protéine d’intérêt qui sont spécifiques de la kinase 1 dépendante de la cycline. L’identification des sites de phosphorylation spécifiques de CDK1 est importante car ils fournissent des informations mécanistes sur la façon dont CDK1 contrôle le cycle cellulaire. La régulation du cycle cellulaire est essentielle pour la ségrégation des chromosomes en phase complète et les défauts entraînent des aberrations chromosomiques et le cancer.Le principal avantage de cette technique est qu’elle repose sur des protéines purifiées, ce qui permet de l’appliquer à n’importe quel organisme modèle et de donner des résultats fiables, en particulier lorsqu’elle est associée à des études fonctionnelles dans les cellules. Cette méthode est importante car le nombre connu de cibles CDK1 est encore faible, malgré le fait que CDK1 phosphoryle environ 8 à 13 % du protéum. Bien que cette méthode identifie des sites de phosphorylation spécifiques à CDK1, elle peut être modifiée pour identifier des sites de phosphorylation pour d’autres kinases, à condition que la kinase purifiée soit disponible.En général

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