Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse

L’objectif global de cet essai de kinase in vitro est d’identifier des sites de phosphorylation dans une protéine d’intérêt qui sont spécifiques de la kinase 1 dépendante de la cycline. L’identification des sites de phosphorylation spécifiques de CDK1 est importante car ils fournissent des informations mécanistes sur la façon dont CDK1 contrôle le cycle cellulaire. La régulation du cycle cellulaire est essentielle pour la ségrégation des chromosomes en phase complète et les défauts entraînent des aberrations chromosomiques et le cancer.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle repose sur des protéines purifiées, ce qui permet de l’appliquer à n’importe quel organisme modèle et de donner des résultats fiables, en particulier lorsqu’elle est associée à des études fonctionnelles dans les cellules. Cette méthode est importante car le nombre connu de cibles CDK1 est encore faible, malgré le fait que CDK1 phosphoryle environ 8 à 13 % du protéum. Bien que cette méthode identifie des sites de phosphorylation spécifiques à CDK1, elle peut être modifiée pour identifier des sites de phosphorylation pour d’autres kinases, à condition que la kinase purifiée soit disponible.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés car les conditions du dosage de la kinase doivent être optimisées pour chaque cible protéique afin d’obtenir une efficacité de phosphorylation élevée. De préférence à 100 %Utilisez le logiciel IGPS 3.0 et visitez le serveur Web pour prédire les sites de phosphorylation spécifiques de CDK1 dans la séquence de la protéine cible CENP-F. Vérifiez les sites de phosphorylation par rapport à la séquence consensus CDK1.

Démarrez l’expression des protéines en préparant une pré-culture. En suivant les instructions du fabricant, transformez un microlitre du plasmide d’expression en 50 microlitres de cellules compétentes pour E. coli. Après avoir ajouté le plasmide, incubez les cellules sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, incubez les cellules pendant 45 secondes à 42 degrés Celsius. Après l’incubation, placez les cellules sur de la glace pendant une minute, puis ajoutez 400 microlitres de LB aux cellules, puis incubez la culture pendant une heure à 37 degrés Celsius en secouant. Ensuite, plaquez 200 microlitres de la culture sur des plaques de gélose LB, complétées par les antibiotiques d’intérêt, selon la construction.

Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 à 20 heures sans secouer. Ensuite, prélevez une colonie dans la plaque de gélose LB et inoculez la colonie dans 50 millilitres de milieu LB complété par la combinaison d’antibiotiques souhaitée. Incuber la culture à 37 degrés Celsius tout en secouant à 160 à 180 tours par minute pendant 12 à 20 heures.

Pour chaque litre de milieu LB, ajoutez les antibiotiques et 10 millilitres de 40 % en poids par volume de solution de glucose filtrée stérile. À ce milieu, ajoutez 20 millilitres de la pré-culture densément cultivée. Ensuite, incubez la culture à 37 degrés Celsius tout en secouant à 160 à 180 tours par minute.

Vérifiez l’absorbance de la culture à 600 nanomètres à intervalles réguliers. Une fois que l’absorbance atteint 0,5 à 0,6, induire l’expression des protéines en ajoutant 0,2 millimolaire d’IPTG. Ensuite, incubez la culture à 37 degrés Celsius pendant trois heures en la secouant.

Après trois heures, récoltez les cellules par centrifugation à 4, 100 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, à l’aide d’un rotor pivotant. Après la centrifugation, expulser le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 20 millilitres de tampon de liaison GST pour CENP-F et ses six tampons de liaison pour la karyophérine alpha pour chaque litre de culture.

Stockez ensuite les cellules à moins 80 degrés Celsius. Pour purifier CENP-F, décongelez d’abord les cellules avec la construction CENP-F. Ajustez ensuite le volume à 20 millilitres à l’aide d’un tampon de liaison GST.

Une fois le volume ajusté, ajoutez tous les réducteurs et les inhibiteurs de protéase l’un après l’autre pour préparer la suspension cellulaire pour la lyse ultérieure. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un bécher en verre et plongez le bécher dans un bain d’eau glacée. Ensuite, sonifier la culture.

Après la sonication, ajoutez 250 micromolaires PMSF au lysat, puis inspectez le lysat, qui doit être transparent à ce stade. Ensuite, centrifugez le lysat à 12 000 à 40 000 fois G pendant 25 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez la colonne en ajoutant deux millilitres de glutathion agarose un à une boue dans une colonne de chromatographie jetable.

Pour équilibrer la colonne, lavez-la d’abord avec 25 millilitres d’eau ultra pure, puis 25 millilitres de tampon de liaison GST. Une fois la centrifugation terminée, décantez le surnageant puis filtrez-le à travers une coulée de 0,2 micromètre. Versez ensuite le lysat sur la colonne bouchée pour l’étape de liaison.

Boucher la colonne et l’incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes tout en nuttant doucement et en évitant la mousse. Après 30 minutes, transférez la colonne sur une grille et laissez la résine se déposer. Ensuite, récupérez le flux et lavez la colonne deux fois avec 25 millilitres de tampon de liaison GST.

Une fois le lavage terminé, branchez à nouveau la colonne. Ajoutez ensuite 400 microlitres de tampon de liaison GST et 250 microlitres de stock de protéase PS avec une activité de 1000 unités par milligramme à la colonne. Fermez à nouveau la colonne et faites tourner doucement la colonne pour remettre la résine en suspension dans le tampon, puis incubez la colonne à quatre degrés Celsius pendant 16 à 20 heures.

Une fois la période d’incubation terminée, ajoutez quatre millilitres de tampon de liaison GST pour éluer le fragment CENP-F de la colonne qui a été clivée protéolytiquement. Ensuite, pour éluer à nouveau l’étiquette GST, branchez à nouveau la colonne. Ajoutez ensuite quatre millilitres de tampon d’élution GST contenant du glutathion dans la colonne.

Ensuite, incubez la colonne pendant 10 minutes pour éluer l’étiquette GST liée. Après 10 minutes, récupérez l’éluat. Effectuez ensuite une électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS pour analyser les fractions d’élution de la protéase PS et du glutathion.

Ensuite, pour concentrer l’échantillon de protéines, pipetez l’éluat de protéase PS dans le compartiment supérieur d’une unité de filtration centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons. Ensuite, centrifugez l’éluat à 4, 100 fois G par incréments de 10 à 15 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor pivotant, pour concentrer l’échantillon. Après chaque incrément, mélangez l’échantillon de protéines dans le filtre de concentration en pipetant doucement de haut en bas pour éviter la formation d’un gradient de concentration.

Pour purifier le CENP-F par filtration sur gel, fixez une colonne de filtration sur gel à un système de chromatographie liquide rapide des protéines. Ensuite, équilibrez la colonne avec un volume de colonne de tampon de filtration de gel. Ensuite, centrifugez le fragment CENP-F dans un tube de microcentrifugation à 21, 700 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Une fois la centrifugation terminée, injectez l’échantillon dans la colonne, puis éluez la colonne avec un tampon de filtration sur gel et collectez des fractions de 0,6 millilitre du fragment CENP-F. Ensuite, analysez le profil de filtration du gel et exécutez une SDS-PAGE des fractions de pointe. Fractions de pool contenant du CENP-F pur.

Concentrez ensuite le fragment de CENP-F purifié à 3,3 milligrammes par millilitre. Pour déterminer la concentration en protéines, diluez le fragment CENP-F dans un rapport de un à 100 avec de l’eau ultra-pure. Ensuite, enregistrez le spectre de 220 à 300 nanomètres de longueur d’onde dans le spécrophotomètre.

Ensuite, préparez des aliquotes de 50 microlitres de CENP-F purifié dans des microtubes de 0,5 millilitre, puis congelez les tubes dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour le dosage de la kinase, mélangez le fragment CENP-F avec de l’ATP et de la cycline B CDK1 ainsi que d’autres tampons dans un microtube de 0,5 millilitre. Préparez ensuite un deuxième échantillon sans la cycline B CDK1 comme témoin négatif.

Ensuite, incubez les échantillons dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant une à 16 heures. Pour réussir l’identification des sites de phosphorylation par spectrométrie de masse, il est essentiel que l’efficacité de phosphorylation soit aussi élevée que possible, de préférence 100 %Pour augmenter l’efficacité de phosphorylation, ajoutez plus de kinase et augmentez le temps d’incubation à 16 heures. Ajoutez ensuite des volumes égaux de solution de chlorhydrate de guanidine à six molaires à la réaction de dosage de kinase restante et au témoin négatif et effectuez une spectrométrie de masse pour identifier le site de phosphorylation.

Pour obtenir des données de spectrométrie de masse de haute qualité, il est également important que l’échantillon de protéines purifiées soit très pur et homogène. La première analyse SDS-PAGE est effectuée qui montre un net décalage vers le haut de la bande sur le gel pour le CENP-F phosphorylé par rapport au contrôle négatif sans CDK1, indiquant que le cNLS de CENP-F est un substrat CDK1. Ensuite, la spectrométrie de masse est effectuée pour analyser le nombre et l’efficacité des sites de phosphorylation CENP-F.

Le spectre de masse du piège à ions ESI de la CENP-F phosphorylée in vitro intacte montre qu’il y a cinq pics, indiquant quatre sites de phosphorylation et le cinquième pic est la protéine non phosphorylée. Ensuite, ce profil d’élution d’exclusion stérique montre que le volume d’élution du pic alpha de la karyophérine passe à une masse plus élevée lors de l’ajout du CENP-F de type sauvage, ce qui n’est pas observé lors de l’ajout du mutant CENP-F. Cela indique que la version phosphomimétique S3048D de CENP-F affaiblit l’interaction de la cNLS CENP-F avec la karyophérine alpha.

Enfin, l’analyse SDS-PAGE réalisée montre que le fragment CENP-F de type sauvage avec des coélués cNLS intacts avec la karyophérine alpha, indiquant une forte interaction. Cependant, le mutant S3048D de CENP-F et la karyophérine alpha éluent en pics séparés. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier les sites de phosphorylation obtenus par rapport à la séquence de phosphorylation consensuelle de CDK1 et de vérifier que le substrat identifié se localise dans le même compartiment cellulaire que CDK1.

Suite à cette procédure, une vérification fonctionnelle doit être effectuée dans les cellules ou les modèles animaux afin de confirmer que les sites de phosphorylation identifiés ont une fonction physiologique. Un certain nombre d’outils sont disponibles pour la vérification fonctionnelle, tels que des inhibiteurs spécifiques de CDK1 et des mutations phosphomimétiques. En raison du grand nombre de substrats de CDK1 dans le protée, de nombreux substrats de CDK1 humains restent à découvrir et le test de kinase in vitro sera un outil important pour identifier, cartographier et vérifier ces sites.

L’identification de ces sites de phosphorylation permet d’étudier mécaniquement la façon dont CDK1 contrôle le cycle cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les sites de phosphorylation spécifiques de CDK1 et les protéines cibles par un test de kinase in vitro.