Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l'ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

L’objectif global de cette procédure de clonage et de transformation est de générer efficacement des vecteurs CRISPR et d’éliminer les racines de tomates mutantes qui peuvent être utilisées dans des études génomiques fonctionnelles. Cette méthode est un outil utile dans le domaine de la génomique végétale car elle peut générer un grand nombre de mutants knock-out qui peuvent être utilisés dans une variété de processus racinaires. Le principal avantage de cette technique est que la procédure de clonage peut être accomplie en une seule étape, ce qui permet d’obtenir des matériaux de groupe en quelques semaines seulement.

Tout d’abord, guidez la conception d’ARN ou d’oligonucléotides d’ARNg pour inclure la partie GN19 des motifs cibles flanquée des cinq séquences de nucléotides premiers et des trois premiers séquences nucléotidiques 20 nécessaires à l’assemblage de l’ADN. Digérez un à cinq microgrammes de plasmide de caznine P201N avec l’enzyme de restriction Spe1 à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après la purification en colonne du digest selon les instructions du fabricant, remettre en suspension dans 15 microlitres de 10 millimolaires de TRS HCL.

Quantifier la quantité d’ADN par spectrophotométrie UV. Effectuez une deuxième digestion avec une enzyme de restriction Swa1 à 25 degrés Celsius pendant deux heures. Vérifiez 100 à 200 nanogrammes sur un gel d’agarose à huit pour cent pour confirmer une digestion complète.

Un plasmide correctement digéré aura une seule bande à 14 313 paires de bases. Pour amplifier la PCR le medicago truncatula, utilisez six promoteurs et l’ADN d’échafaudage du plasmide de la navette de l’ARNg. Utilisez l’amorce Swa1 et Mtu6F et MTU6R, et l’échafaudage F dans l’échafaudage Spe1 R, dans une polymérase haute fidélité.

Visualisez trois aliquats d’un microlitre de produits PCR sur un gel d’agarose à un pour cent pour confirmer l’amplification. L’amplicon MTU6 est de 377 paires de bases et l’amplicon d’échafaudage est de 106 paires de bases. La colonne purifie les produits PCR restants selon les instructions du fabricant.

Quantifier par spectrophotométrie UV comme précédemment et stocker à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, remettez en suspension l’ensemble du tube d’oligonucléotides d’ARNg à 100 micromolaires dans de l’eau de qualité laboratoire. Ajoutez un microlitre d’oligos à 500 microlitres de tampon 1xNEB deux points un et mélangez bien.

Programmez un thermocycleur avec un couvercle chauffant pour qu’il maintienne à 50 degrés Celsius. Combinez 100 nanogrammes du vecteur linéarisé, 50 nanogrammes de promoteur MtU6, 12 nanogrammes d’échafaudage et un microlitre d’oligo d’ARNg dilué dans de l’eau jusqu’à un volume final de cinq microlitres. Ajoutez cinq microlitres de 2X haute-fidélité DNA Assembly Mastermix.

Mélangez bien et tournez. Incuber la réaction pendant 60 minutes dans le thermocycleur à 50 degrés Celsius. Après l’heure à 50 degrés Celsius, placez la réaction sur de la glace, puis utilisez deux microlitres pour transformer les cellules E.Coli compétentes en utilisant des techniques standard.

Placez la transformation sur LB Agar complété par 50 milligrammes par millilitre de Kanamycin et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Criblez les colonies par PCR avec l’amorce StUb3p 218R et 1Sce1R. Diluez un alequat de la réaction d’assemblage de l’ADN restante avec de l’eau de un à cinq, et utilisez un microlitre comme contrôle positif pour le dépistage de la colonie.

Incluez également un nanogramme de plasmide de casnine circulaire P201N comme témoin sans insertion. Après amplification par PCR à l’aide des paramètres contenus dans la partie écrite du protocole, visualisez le produit de PCR sur un gel d’agarose à un pour cent. Les insertions correctes ont une bande de 725 paires de bases et les vecteurs sans inserts auront une bande de 310 paires de bases.

Cultivez des colonies positives dans des cultures liquides LB Can50 pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, purifiez les plasmides à l’aide d’un kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant. Après le séquençage des plasmides purifiés par Sanger avec l’amorce StuB3P218R, alignez les chromatogrammes sur les séquences du promoteur MtU6, de la cible et de l’échafaudage pour vous assurer qu’aucune erreur n’a été introduite lors du clonage.

Effectuez une digestion diagnostique en digérant un microgramme de plasmide avec EcoR5 et Sti1. Lorsqu’il est visualisé sur un gel d’agarose à point zéro, ce motif de bande devrait être vu. Enfin, transformez les plasmides en souche ARqua1 d’Agrobacterium rhizogenes en ajoutant un microlitre de préparation plasmidique à 50 microlitres de cellules électrocompétentes et en électroporant dans une cuvette limiteur d’un millimètre.

Ajoutez environ 500 microlitres de média SOC et agitez à 28 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, plaquez sur des plaques LB Can50 et cultivez à 28 degrés Celsius pendant deux jours. Commencez cette section de la procédure en stérilisant les graines de tomates dans un agent d’eau de Javel domestique à 20 % pendant 15 minutes avec un mélange constant.

Transférez ensuite les graines dans une hotte à flux laminaire. Retirez l’eau de Javel et lavez-la trois fois dans de l’eau stérile de laboratoire. Plaquez 30 graines dans une boîte GA7 contenant la moitié de MS Media.

Laisser germer environ deux jours dans l’obscurité. Une fois que les graines ont germé, déplacez les boîtes GA7 à la lumière La veille de la transformation, straitez des cultures d’A.rhizogenes sur des LB solides contenant Can50 et cultivez à 28 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour de la transformation, travaillez dans la hotte à flux laminaire pour ajouter 25 microlitres d’Acetosyringone à 50 millilitres d’un demi-MS et versez six millilitres dans chaque tube de culture.

À l’aide d’une pointe pliée de 200 microlitres, grattez les cellules d’A. rhizogenes de la plaque et mettez-les en suspension dans les six millilitres d’un demi-liquide MS. Vortex le tube pour remettre complètement les cellules en suspension. Après avoir remis en suspension les cellules de chaque vecteur, prenez un millilitre de cellules et mesurez la densité optique à une longueur d’onde fixe de 600 nanomètres.

Ajoutez deux millilitres d’un demi-liquide MS dans une boîte de Pétri avec un papier filtre stérile. Excisez les cotylédons des semis et placez-les sur le papier filtre humidifié. Une fois que tous les cotylédons ont été collectés, coupez le centimètre le plus distal des cotylédons, ce qui donne des morceaux de cotylédon à deux extrémités coupées.

Ajouter les plantes ex aux solutions d’A. rhizogenes et mélanger. Incuber pendant 20 minutes avec inversion occasionnelle. Pendant l’incubation d’A. rhizogenes, ajoutez un morceau de papier filtre dans une boîte de Pétri pour chaque transformation de construction.

De plus, mettez à sécher la moitié d’un milieu solide MS sans antibiotiques dans la hotte à flux laminaire. À l’aide d’une pince stérile, prélever les cotylédons de la solution d’A. rhizogenes et les placer sur du papier filtre sec. Couvrir avec un couvercle de boîte de Pétri pour s’assurer que les mouchoirs ne se dessèchent pas lors de la transformation suivante.

Ensuite, épongez les cotylédons sur le papier filtre et transférez le côté abaxial jusqu’à la moitié du média MS. Enveloppez les plaques avec du ruban chirurgical et co-cultivez dans l’obscurité à température ambiante pendant deux jours. Après la co-culture, transférez les cotylédons du côté abaxial vers le haut dans un demi-milieu MS supplémenté.

Enveloppez avec du ruban chirurgical. Conservez les cultures sous des lampes fluorescentes à température ambiante avec une photopériode de 16 heures. Après un point de cinq à deux semaines, utilisez une pince stérile et un scalpel pour exciser les racines d’au moins deux centimètres de longueur des cotylédons et transférez-les dans un milieu de musculation de sodium composé d’acide ticarcillon/clavularate et de kanamycine complété par la moitié de la sclérose en plaques.

Transférez dix à 15 racines dans une seule assiette. Marquez la position des pointes des racines avec un marqueur. Enveloppez avec du ruban chirurgical et conservez-le dans la salle de culture.

Au bout d’une semaine, on voit des racines transformées pousser sur le milieu sélectif. Récoltez un sous-échantillon de racines transformées pour l’extraction de l’ADN à l’aide de la méthode d’extraction d’ADN préférée. Des racines poilues peuvent être observées émergeant des cotylédons 11 jours après la transformation.

Les racines sont sélectionnées avec de l’acide ticarcillon/clavulanate et de la kanamycine supplémentée à la moitié du MS Media pendant environ une semaine. Les barres grises indiquent la position des extrémités des racines au moment du placage. Il s’agit d’un exemple de clonage et de séquençage de produits PCR pour déterminer des mutations de l’ADN avec deux cibles génétiques différentes dans quatre événements de racines poilues différents.

La case grise indique la séquence cible GN20 GG et delta indique le type de mutation. Le nombre de clones avec la mutation indiquée est indiqué à droite. Il s’agit d’un exemple de gel de polyacrylamide pour déterminer les mutations de l’ADN.

De grandes délétions et des bandes heterduplex indiquent la présence de mutations de l’ADN au niveau des séquences cibles. Six des 12 événements indépendants ont été notés comme mutants, comme l’indique le symbole delta. WT indique le contrôle de type wild et NT le contrôle sans modèle.

Une fois maîtrisés, des dizaines à des centaines de vecteurs CRISPR peuvent être produits en une seule semaine et des matériaux de groupe tendance peuvent être obtenus en quelques semaines. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’éliminer et d’inhiber la croissance de tout Agrobacterium résiduel. La prolifération d’Agrobacterium inhibera et tuera tout matériel racinaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des vecteurs CRISPR à l’aide de l’assemblage de l’ADN, et de la façon de tester ces vecteurs à l’aide d’un système de modèle de racine poilue et de tomate.