Name: Appartement Mont Préparation pour lobservation et lanalyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne In situ Hybridation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Découvrez la technique de montage à plat d'embryons de zèbre colorés par hybridation in situ sur montage entier pour améliorer la visualisation des structures embryonnaires en biologie du développement.

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Ce travail a été financé en partie par le financement de RAW de chacun des éléments suivants: subventions des NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, et R01 DK100237; Mars of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar octroi d&#39;une subvention # 5 FY12-75; les fonds de démarrage de l&#39;Université de Notre Dame College of Science et Département des sciences biologiques. Nous tenons tout particulièrement à remercier Elizabeth et Michael Gallagher, avec toute la famille Gallagher, qui donnait un don généreux à l&#39;Université de Notre Dame de favoriser recherche de cellule souche. Les bailleurs de fonds n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous remercions le personnel du Département des sciences biologiques pour leur soutien, et le Centre pour la recherche de poisson zèbre à Notre-Dame pour leur dévouement exceptionnel dans le soin et le bien-être de notre colonie de poisson zèbre. Enfin, nous remercions les membres de notre laboratoire de recherche pour leurs commentaires, discussions et idées à propos de ce travail,ainsi que Marigold (Maripooka) et Zinnia Wingert pour fournir hangar naturellement moustaches félines à faire plus d&#39;excellents outils de cils pour notre recherche.

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Poisson zèbre se sont révélés être un organisme modèle très précieux pour toute la communauté de la recherche au cours des dernières années. Poisson zèbre présentent un degré élevé de conservation génétique avec celui des vertébrés supérieurs, et les avantages relatifs à leur anatomie, l&#39;élevage et cycle de vie font de cette espèce très prêtent à des analyses de laboratoire. Par ailleurs, la promotion des techniques moléculaires applicables au poisson zèbre a également encouragé l&#39;utilisation de cet organisme modèle dans la recherche scientifique. Par exemple, une grande variété de lignes de poisson zèbre transgénique a été générée pour étudier la progression de la maladie et à répondre à de nombreuses questions fondamentales qui sous-tendent les mécanismes clés du développement, y compris l&#39;organogenèse. En conséquence, sur la base de l&#39;utilisation dynamique de poisson zèbre à la fois la maladie et de la recherche développement, des méthodes de marquage des cellules et le signal de quantification sont un aspect crucial de l&#39;analyse des données. Bien que les méthodes qui emploient un fluorescenttibodies peuvent être utilisés pour détecter l&#39;expression de protéines dans le poisson-zèbre transgénique, les chercheurs s&#39;appuient généralement sur ​​les procédures standard comme WISH 12-16 à examiner la localisation spatio-temporelle de la transcription de gènes dans un échantillon de poisson zèbre transgénique non-fixe. En fait, WISH est l&#39;une des techniques les plus couramment utilisés en biologie 16, et est un outil essentiel utilisé pour caractériser le phénotype des mutations génétiques et des perturbations génétiques chimiques. Néanmoins, WISH est associé à un certain nombre de pièges et défis potentiels. Pour confirmer la spécificité de la ribroprobe antisens, ribosondes de détection peuvent être utilisés en tant que témoin pour évaluer la spécificité des motifs de coloration de ribosonde antisens. Alors que les articles 4 et 5 sont présentés dans l&#39;ordre de marquage et de détection d&#39;une sonde de digoxygenine marqué suivie par la sonde marquée à la fluorescéine, cet ordre peut être inversé. Typiquement, les signaux plus faibles (gènes dont les niveaux d&#39;expression plus faibles) sont mieux détectés avec des sondes marquées digoxygénine-et cette tachedéveloppée avec un premier substrat pourpre, suivie de la détection et de la coloration du signal plus fort (gène plus abondamment exprimée) en utilisant le substrat rouge. Cependant, si des réactions en deux couleurs vont être effectuées, il est recommandé que diverses combinaisons d&#39;étiquettes et de substrats sont testés pour trouver la procédure qui est le plus adapté pour la collecte et l&#39;analyse des données. En outre, les délais prévus pour le blocage, l&#39;incubation des anticorps et laver prévues aux articles 4-5 sont adaptés pour les embryons de moins de 24 heures après la fécondation; longs intervalles de ces mêmes étapes avec des embryons âgés peuvent conduire à l&#39;accumulation de sel sur l&#39;échantillon. Conseils étendus pour le dépannage embryon de poisson zèbre WISH norme ont déjà été documentées dans la littérature 12-16. Sans doute le problème le plus commun est une grande arrière-plan. Nous recommandons d&#39;augmenter le nombre de lavages MABT à l&#39;étape 4.7 à 15-20 lavages si nécessaire, même si, dans notre expérience la plus de la nuit MABT «super-lavage»donne d&#39;excellents résultats lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec 10 ou plusieurs lavages de MABT courts avant de procéder à l&#39;étape 4.8. Un autre exemple dilemme est mauvaise infiltration de la sonde, qui peut se produire avec de longues ribosondes. Cisaillement de la ribosonde suivant l&#39;étape 3.6 par hydrolyse alcaline peut contrecarrer cela. Dans notre expérience avec les jeunes des échantillons, la sonde cisaillement n&#39;est généralement pas nécessaire. Cependant, il faut garder à l&#39;esprit que les paramètres de ce genre peut être des facteurs contributifs dans le résultat d&#39;une expérience de WISH, et nous suggérer l&#39;examen de ces instructions de dépannage utiles déjà disponibles publiquement dans la communauté afin d&#39;affiner les paramètres expérimentaux pour la WISH dans votre propre recherche 12. En plus des techniques traditionnelles WISH 12-16, il ya eu une émergence continue de progrès dans les méthodes de WISH et protocoles alternatifs qui ont été formulées. Il s&#39;agit notamment de nouvelles façons de détection de signal, comme par l&#39;utilisation de fluorescencecence 17-19, les méthodes qui permettent la localisation des microARN 20. Même si, en dépit des nombreuses améliorations qui ont été apportées aux méthodes de marquage des cellules actuelles, l&#39;efficacité de ces procédures sont annulées si la tache (s) ne peut pas être facilement visualisés dans l&#39;échantillon d&#39;intérêt à un point de temps souhaité. Cette limitation est problématique pour les chercheurs en particulier quand il se rapporte à des stades embryonnaires de l&#39;ontogenèse du poisson zèbre, ce qui pourrait entraîner des lacunes dans notre compréhension des différents processus de développement qui se posent à ces moments. Au cours du développement de poisson zèbre normal, le sac jaune diminuera progressivement à mesure que les embryons de 11 ans. Par conséquent, à ces stades de développement ultérieurs (&gt; 24 heures après la fécondation), WISH coloration est assez simple à analyser car l&#39;embryon est plus grande par rapport à sa attenant jaune sac. Cependant, ce n&#39;est pas le cas de la scène queue de bourgeon de somitogenèse tôt (lorsque le embryonnairemasse est positionné autour du jaune) lorsque le sac vitellin opaque peut parfois occulter la visualisation de la tache. Par conséquent, la méthode de montage à plat a été conçu pour aider à alléger les problèmes d&#39;imagerie et d&#39;analyse de données associées à la caractérisation d&#39;échantillons d&#39;embryons de poisson zèbre précoces (schématisés à la Figure 1 et Figure 2), et a été largement utilisé depuis le phénotypage systématique des mutations génétiques isolés des premiers grands écrans génétiques 21. Depuis l&#39;avènement de la technique de montage à plat, l&#39;analyse des premiers stades de développement a été considérablement renforcée. Une fois que le jaune d&#39;oeuf est retiré de l&#39;embryon, il est possible de fixer la plate embryonnaire sur une lame de verre dans l&#39;orientation souhaitée pour l&#39;imagerie. Cette position bidimensionnelle permet la visualisation de l&#39;ensemble de l&#39;embryon à la fois, ce qui élimine la nécessité de faire tourner l&#39;échantillon. De nombreux tissus sont situées dans de larges domaines de l&#39;embryon, tels queles précurseurs qui forment le sang et les reins. En outre, on peut avoir besoin de comparer plusieurs différents tissus en développement à la fois. Montage à plat permet au chercheur de visualiser simultanément l&#39;ensemble du domaine de ces groupes de cellules, et peut donc grandement aider quantifications telles que des mesures d&#39;aire pour un tissus ou de cellules chiffres. Cette technique a finalement contribué à faire de nombreuses découvertes concernant une variété de mécanismes de développement importants qui sous-tendent l&#39;hématopoïèse, la neurogenèse et l&#39;organogenèse. Ainsi, une fois maîtrisé, les applications de cette technique simple pour les chercheurs sont très importantes. Par exemple, dans une étude sur le choix de la lignée au cours de l&#39;hématopoïèse, monter plat préparations d&#39;embryons de poisson zèbre à des étapes 14 et 18 somites (ss) ont été utilisés pour illustrer les changements survenus dans le profil d&#39;expression de la PU.1 zinc facteur doigt de transcription entre de type sauvage et GATA1 morpholino injecté embryons 22.Cette méthode a permis la détection d&#39;un domaine de PU.1 élargi à 18 ss, indiquant que GATA1 est probablement régulation de l&#39;expression de PU.1 dans la masse cellulaire intermédiaire (ICM) autour de ce point de temps. Embryons plat supplémentaires montés colorées pour différents gènes érythroïdes y compris gtpbp1 et Epsin démontré une perte de l&#39;expression de ces gènes mutants vlt qui étaient GATA1 - / -. D&#39;autres analyses ont montré aucun changement dans l&#39;expression de gènes tels que erythoid biklf testhymin et qui étaient connus pour être indépendante de l&#39;activité de gata. Par conséquent, conjointement avec leurs autres résultats expérimentaux, il a été révélé que GATA1 est essentiel dans la régulation de la différenciation des cellules au sein de la lignée de myélo-érythroïdes. Dans une étude du développement de la crête neurale, supports plats ont été utilisés pour examiner l&#39;expression de Crestin à Mont Blanc (mob) M610 mutants dans une étudel&#39;examen des rôles du Mont-Blanc et de la fonction du gène TFAP2A 23. À 10 et 20 ss, l&#39;expression de Crestin a été entièrement abrogé dans la tête et a diminué dans la région de tronc de mutants M610 mob par rapport à l&#39;expression normale de type sauvage, en fin de compte aider ce groupe à conclure sur l&#39;importance du Mont-Blanc et TFAP2A règlement pendant la formation de la crête neurale. En outre, en termes de l&#39;organogenèse, montures plates ont permis la découverte de la présence de domaines distincts dans le champ de progéniteur rénale précoce au cours du développement du rein embryonnaire du poisson zèbre, connu sous le nom pronephros. L&#39;embryon de poisson zèbre fournit un système conservé et encore anatomiquement simple pour étudier comment les progéniteurs rénaux donnent lieu à des unités fonctionnelles de néphrons qui composent les pronephros, un processus connu sous le nom néphrogenèse 6,7 (figure 4). Appartement monter analyse a été utile pour documenter les domaines de la reprogéniteurs internes et à disséquer le résultat de changements dans la signalisation de RA pendant pronephros structuration 6,7 (figure 5), qui était auparavant inconnu. Pris ensemble, ces exemples montrent qu&#39;il existe effectivement de nombreuses applications générales pour cet appartement protocole de montage dans l&#39;étude des divers processus qui se produisent au cours du développement normal et états pathologiques. Conceptuellement, cette procédure de montage plat est assez simple dans son ensemble. Cependant, les manipulations et le degré de finesse requis pour maîtriser cette méthode peut être assez difficile à maîtriser en l&#39;absence de démonstration visuelle. Par conséquent, ce protocole a été établi pour permettre aux chercheurs, en particulier ceux qui découvrent le modèle de poisson zèbre, la possibilité de mieux comprendre comment effectuer cette technique et partagez nos conseils sur les réactifs qui permettent d&#39;optimiser le traitement des tissus. Nous espérons que ce protocole permettra à terme d&#39;autres dans la communauté pour affiner les conditions d&#39;échantillonnage les plus idéal pour être used pour l&#39;imagerie haut de gamme, l&#39;analyse des données et la communication de leurs résultats dans les publications. En fin de compte, ce qui devrait permettre aux chercheurs de surmonter les obstacles anatomiques du poisson zèbre au cours de l&#39;embryogenèse précoce, qui peut obscurcir la présentation des résultats expérimentaux, et les résoudre grâce à l&#39;utilisation de cette technique simple mais importante.

Le poisson zèbre, Danio rerio, est devenu un organisme largement utilisé dans l&#39;étude de la biologie du développement. Poisson zèbre sont une tropicales, les espèces d&#39;eau douce de vertébrés appartenant à la famille des cyprinidés. Poisson zèbre ont été initialement utilisées pour la recherche environnementale pour obtenir des informations sur les dangers des polluants potentiels de l&#39;eau, car ils étaient faciles à obtenir, peu coûteux et facile à entretenir 1. Au cours des trente dernières années, le poisson zèbre a été reconnue comme un système de modèle vertébré génétiquement docile pour une foule de raisons. Poisson zèbre montrent un niveau élevé de conservation anatomique et physiologique avec les vertébrés supérieurs, y compris les mammifères 2,3. Récente annotation de la séquence du génome ont révélé qu&#39;environ 70% des gènes humains ont au moins un homologue de poisson-zèbre 4. Par exemple, de nombreux gènes orthologues qui jouent un rôle important au cours du développement du rein ont été identifiés entre ces espèces 5-7. Cette dradegré de conservation matic en ce qui concerne la biologie cellulaire et moléculaire ont permis aux chercheurs de créer des modèles pour un large éventail de maladies humaines chez le poisson zèbre 8, et le poisson zèbre sont devenus un outil précieux pour identifier les thérapies médicamenteuses potentielles en utilisant des écrans génétiques chimiques 9. En outre, le modèle de poisson zèbre est non seulement capable de récapituler une variété de processus complexes de développement et d&#39;états pathologiques qui sont vus dans l&#39;homme, mais plusieurs attributs supplémentaires accroître également son appel comme un organisme modèle pour les études embryologiques. Poisson zèbre sont ovipares et reproduire par la ponte de diffusion, qui fournit aux chercheurs un accès facile aux embryons dès le début de la fécondation 10. D&#39;autres avantages comprennent la taille de l&#39;embryon, la transparence, et le développement rapide externe 10. En outre, les adultes de poisson zèbre possèdent une fécondité élevée et produisent généralement des tailles relativement importantes d&#39;embrayage qui peut varier entre 200-500par semaine, en fin de compte permettre aux chercheurs de réaliser des expériences à haut débit, tels que les écrans chimiques phénotype base, avec la facilité 9. Même si, malgré la pléthore d&#39;avantages qui sont présentés par le modèle de poisson zèbre, il ya des défis qui se rapportent à l&#39;analyse et la communication des résultats expérimentaux obtenus à partir des stades de développement précoces. Dans certains cas, l&#39;anatomie inhérente de l&#39;embryon de poisson zèbre pourrait occulter la visualisation des données de l&#39;une. Après la fécondation, la cellule initiale subit de multiples événements de clivage au cours du développement 11. À la suite de la gastrulation, l&#39;axe embryonnaire émerge au stade de bourgeon caudal (10 hpf) de telle sorte qu&#39;elle est enroulée autour du jaune 11. Comme le développement ultérieur progresse à travers la période de segmentation, le tronc va croître en masse et aussi de prolonger par allongement axial de telle sorte que la queue le long d&#39;une partie du sac vitellin se prolonger à partir de la masse de jaune central11. Entre le bourgeon caudal et 20 stade de somites (19 HPF), les tentatives d&#39;observer les caractéristiques spécifiques de développement après l&#39;utilisation de différents protocoles de coloration, comme WISH, peut être difficile à la fois de visualiser et de photographier en raison de la géométrie de l&#39;embryon et de l&#39;opacité de le sac vitellin. Une façon d&#39;éliminer ces défis est d&#39;enlever le jaune puis aplatissez l&#39;embryon dans un échantillon à deux dimensions qui peut être analysée de manière plus simple. Les ressources de protocole et vidéo suivants fournissent un guide pour savoir comment deyolk succès et plat monter un embryon après fixation et coloration, en utilisant l&#39;exemple d&#39;une ou deux couleurs WISH coloration. WISH est une technique largement utilisée qui permet la détection d&#39;acides nucléiques spécifiques dans des échantillons conservés et permet pour le site (s) de l&#39;expression du gène à détecter au sein des tissus ainsi. techniques WISH ont été largement décrits et peuvent être réalisées avec différents substrats de couleurs ainsi que la grippesystèmes de détection orescent 12-20. Ici, nous offrons notre protocole de WISH modifié utilisé pour les embryons de poisson zèbre entre les étapes de bourgeon caudal et la segmentation de développement. Protocoles WISH alternatifs, cependant, sont compatibles avec la procédure plat montage décrit ici, comme indiqué au début du protocole ci-dessous. En outre, montage à plat pourrait être utilisé en conjonction avec un certain nombre de techniques de visualisation existants, comme tout immunohistochimie de montage, ou des étiquettes de suivi de la lignée cellulaire, qui ne sont pas décrites dans ce protocole. Dans l&#39;ensemble, la technique de montage à plat peut mieux permettre une meilleure analyse et la présentation des données obtenues à partir d&#39;expériences avec les premiers stades du développement embryonnaire chez le poisson zèbre.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 dans de l’eau distillée. Compléter avec du bleu de méthylène (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) pour inhiber la contamination.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Diluer 50 X E3 dans de l’eau distillée.</td></tr><tr><td>Passoire à thé en maille</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Plat d’incubation d’embryons</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation à fond plat</td><td>VWR</td><td>87003-300 ; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>0,1 % de détergent Tween-20 dans 1x PBS, fabriqué en diluant 10x PBS dans de l’eau distillée.</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4 % PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissoudre 4 % PFA (w/v) dans 1x PBS, porter à ébullition sur une plaque chauffante dans une hotte. Refroidir et congeler les aliquotes pour les conserver à -20 °C. Décongeler juste avant utilisation et ne pas recongeler les stocks.</td></tr><tr><td>Unité de stérilisation par filtre</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>système de filtration 1 L, 0,45 &mu ; m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Dissoudre dans de l’eau distillée pour former un stock de protéinase K (10 mg/ml) et stocker les aliquotes à -20 °C.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50 % formamide, 5x SSC, 0,1 % Tween-20, 5 mg/ml d’ARN de torula de levure, 50 &mu ; g/&mu ; l héparine</td></tr><tr><td>DIG/FLU labellisée riboprobe in vitro réactifs de réaction</td><td>de transcription Roche</td><td>11175025910 ; 11685619910</td><td>Reportez-vous aux instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>ARN polymérase SP6</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>ARN polymérase T7</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td>ARN</tr><tr><td>polymérase T3</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de la RNase 1</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de la DNase 1, 10x tampon de DNase 1</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Aliquote 50 ml aliquotes de 100 % EtOH et 70 % EtOH (diluées avec de l’eau de qualité moléculaire) et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Eau distillée de qualité moléculaire</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>Modèle 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L formule : Dans 1,5 L d’eau distillée, mélanger 23,2 g d’acide maléique, 17,5 g de NaCl, 55,0 g de base Trisma, puis ajouter 8 ml de 1M Tris-HCl pH 9,5, puis remplir jusqu’à 2 L. Autoclave.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0,1 % (v/v) Tween-20</td></tr><tr><td>Block solution</td><td></td><td></td><td>Nous fabriquons dans 50 ml d’aliquotes fraîches : 10 ml de BSA (à partir de 10 % de stock de laboratoire), 5 ml de FCS (à partir de stock) et 35 ml de MABT. Enregistrer le bloc inutilisé à 4 &deg ; C à utiliser pour la solution d’anticorps. Note : Dégeler les stocks BSA et FCS à 37 &deg ; C&ndash ; Si vous décongelez à une température plus élevée, ils deviennent un gel épais (ne pas utiliser).</td></tr><tr><td>FCS (sérum de veau fœtal) stocker</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquot en portions de 5 ou 10 ml et conserver à -20 °C.</td></tr><tr>Stocker des flocons de <td>BSA (albumine sérique bovine)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Réaliser un stock de 10 % dilué dans du MAB en dissolvant les flocons de BSA à température ambiante en agitant rapidement, puis stocker 10 ml d’aliquotes à -20 °C. Stocker les flocons de BSA non dissous à 4 °C.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-digoxigénine</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Magasin à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-fluorescéine</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Boîte de coloration 12 puits</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>de précoloration</td><td>100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween-20. Faites toujours frais : il précipitera au cours de quelques jours.</td></tr><tr><td>Solution colorante-violet</td><td></td><td></td><td>Pour chaque 10 ml nécessaire : ajouter 45 &#956 ; l de NBT et 35 &#956 ; l de BCIP dans un tampon de précoloration frais (non utilisé sur les échantillons d’embryons).</td></tr><tr><td>Solution colorante-rouge</td><td></td><td></td><td>Pour chaque 10 ml nécessaire : ajouter 31,5 &#956 ; l de INT et 35 &#956 ; l de BCIP dans un tampon de précoloration frais (non utilisé sur les échantillons d’embryons).</td></tr><tr><td>Stock NBT</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Stocké à -20 &deg ; C; poudre diluée à 50 mg/ml dans 70 % de DMF, 30 % d’eau.</td></tr><tr><td>Stock INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Stocké à -20 &deg ; C; poudre diluée à 55 mg/ml dans 70 % de DMF, 35 % d’eau.</td></tr><tr><td>Stock BCIP</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Stocké à -20 &deg ; C; poudre diluée à 50 mg/ml dans 100 % DMF.</td></tr><tr><td>DMF (diméthylformaldéhyde)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0,1 M glycine, pH 2,2</td></tr><tr><td>Petite boîte de Pétri en plastique</td><td>Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55</td></tr><tr><td>Outil</td><td></td> de cils<td></td><td>Construit en fixant un cil approprié à une pointe de pipette (des tailles allant de P10 à P1000 peuvent être utilisées) à l’aide de superglue. Nous utilisons un cil humain naturellement perdu, une moustache d’animal naturellement perdue ou des poils de fourrure filiformes, ou un cil naturel ou synthétique acheté au rayon beauté d’un magasin pharmaceutique ou de détail (les cils extra longs se prêtent mieux à un montage stable sur la pointe de la pipette). La pointe de la pipette est fixée sur une tige droite (de 8 à 10 cm de longueur) telle qu’un porte-aiguille ( par exemple , Fisher 08-965-A) pour une manipulation facile. Voir Figure 3 pour des images de ces outils faits maison.</td></tr><tr><td>Diapositive en verre</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost</td></tr><tr><td>Couvre-objet en verre</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Pâte à modeler</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>D’autres produits artisanaux en pâte à modeler peuvent être remplacés.</td></tr><tr><td>Porte-diapositives</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Plateau en carton pour ranger les diapositives à plat.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope composé</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

appartement mont préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; in situ</em&gt; hybridation

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

L&#39;embryon de poisson zèbre est maintenant couramment utilisé pour la recherche fondamentale et biomédicale pour étudier le contrôle génétique des processus de développement et de modéliser les anomalies congénitales. Au cours de la première journée de la vie, l&#39;embryon de poisson zèbre progresse dans de nombreux stades de développement, y compris la fertilisation, le clivage, la gastrulation, la segmentation et la organogenèse de structures tels que les reins, le coeur et le système nerveux central. L&#39;anatomie d&#39;un jeune embryon de poisson zèbre présente plusieurs défis pour la visualisation et l&#39;analyse des tissus impliqués dans un grand nombre de ces événements parce que l&#39;embryon se développe en association avec une masse jaune rond. Ainsi, pour une analyse précise et l&#39;imagerie des phénotypes expérimentales dans des spécimens embryonnaires fixes entre le bourgeon caudal et 20 stade de somite (10 et 19 heures après fertilisation (hpf), respectivement), telles que celles colorées en utilisant l&#39;ensemble de montage d&#39;hybridation in situ (WISH) dans, il est souvent souhaitable d&#39;éliminer l&#39;embryon à partir du jaune btout et pour le positionner à plat sur une lame de verre. Cependant, l&#39;exécution d&#39;une procédure de montage à plat peut être fastidieux. Par conséquent, la réussite et l&#39;efficacité de montage plat préparation est grandement facilitée par la mise en évidence visuelle de la technique de la dissection, et ont également contribué à l&#39;aide de réactifs qui facilitent la manipulation optimale des tissus. Ici, nous offrons notre protocole de souhaits pour la détection d&#39;une ou deux couleurs de l&#39;expression du gène dans l&#39;embryon de poisson zèbre, et montrons comment la procédure de montage à plat peut être effectuée sur cet exemple d&#39;un échantillon fixe colorées. Ce protocole de montage plane est largement applicable à l&#39;étude de nombreuses structures embryonnaires qui se dégagent au cours du développement précoce du poisson zèbre, et peut être mis en œuvre conjointement avec d&#39;autres méthodes de coloration effectués sur des échantillons d&#39;embryons fixes.

La procédure de protocole de montage plate implique la transformation de l&#39;embryon de poisson zèbre à partir de son anatomie normale, dans laquelle l&#39;axe du corps est enroulé autour d&#39;un ballon de jaune d&#39;oeuf situé au centre, dans une préparation à deux dimensions (Figure 1A). Tout le montage imagerie du jeune embryon de poisson zèbre est limitée par la nature de la façon dont l&#39;axe embryonnaire est enroulé autour du jaune. En conséquence, une vue latérale ou dorsale de l&#39;ensemble de montage des spécimens d&#39;embryons colorés ne peuvent capter une partie de l&#39;axe ou des tissus particuliers obscurs (figure 1B). Par comparaison, deyolking et aplatissement de l&#39;embryon permet l&#39;ensemble de l&#39;axe embryonnaire de visualiser à la fois (figure 1B). Ces limitations sont mises en évidence par l&#39;examen d&#39;un embryon de WISH souillé qui a été marqué avec ribosondes antisens pour détecter irx3b (violet), qui marque un sous-ensemble des progéniteurs rénaux situés à côté de somites 7 à 13, et MyoD1 (rouge) qui marque lasomites (figure 1B). Le champ de irx3b + rénales progéniteurs est obscurci dans l&#39;ensemble du montage vue latérale car transcriptions de irx3b sont abondants dans le système nerveux central, ce qui rend le domaine rénale pratiquement impossible à visualiser avec l&#39;angle de caméra latérale; en outre, le domaine de irx3b + progéniteurs rénales n&#39;est que partiellement visible lorsque l&#39;embryon est mis en rotation dans une vue de caméra dorsale parce que le champ est enroulé autour du jaune (figure 1B). Cependant, une vue dorsale du même embryon suivante montage à plat permet l&#39;ensemble du champ de irx3b + progéniteurs rénaux à analyser de manière simple par rapport aux somites sur le tronc et d&#39;autres structures embryonnaires (figure 1B). Ainsi, les domaines spatiaux élaborés peuvent être idéalement documentés avec cette méthode. Plusieurs étapes majeures sont impliqués dans l&#39;exécution réussie de la procédure de montage plat. Pour effectuer cette technique, la balle de jaune d&#39;oeuf doit être d&#39;abord détaché de l&#39;embryon proprement dit (figure 2A), ce qui peut être fait avec des instruments tels que des fines d&#39;une paire de pinces fines tandis que l&#39;embryon est visualisé en utilisant un stéréomicroscope. Après l&#39;élimination brut de la balle de jaune, un outil de cils amende est utilisé pour gratter granules de jaune qui sont restés attachés à l&#39;embryon (figure 2B). La suppression de granules de jaune d&#39;oeuf restantes permet de faciliter la visualisation des tissus embryonnaires. Enfin, l&#39;embryon deyolked est manipulé pour positionner de manière stable sur une lame de verre (figure 2C), ce qui permet l&#39;observation et des aides à la documentation de l&#39;échantillon en utilisant un logiciel de formation d&#39;image et une caméra fixée au microscope. Les outils cils sont des appareils faits maison qui peuvent être construits par l&#39;apposition d&#39;un coup de fouet adapté à une pointe de pipette à l&#39;aide colle, qui peuvent être montés sur une poignée si vous le souhaitez (figure 3A, table Matériaux). Échantillons de cils différents peuvent être obtenus à produirelash outils avec des caractéristiques légèrement différentes en termes de longueur et conique (figure 3B), qui chaque utilisateur peut avoir différentes préférences pour une fois qu&#39;ils commencent à expérimenter avec la procédure de montage plat. Des exemples d&#39;échantillons cils sont naturellement hangar cils humains, naturellement hangar cheveux ou moustaches nerveux animal, et enfin de variétés synthétiques de cils disponibles dans le commerce ont trouvé dans les départements cosmétiques détail. La région entourant et contenant l&#39;échantillon (s) placée sur une lame de verre (figure 4A) peut être imagée pour l&#39;analyse à haute résolution. Une combinaison de sondes ont été utilisés pour étiqueter les progéniteurs rénaux développement qui donnent naissance au rein dans le type sauvage embryon à des stades précoces du développement avec deux couleurs WISH, puis plat monter préparations ont été effectuées pour voir les échantillons (figure 4B, 4C ). Au cours des phases précoces des somites, les progéniteurs rénaux sont délimitées dans une courbe en forme de U par eexpression leu de transcriptions (pourpre) de PAX2A entourant le mésoderme paraxial qui exprime de façon concomitante delta C (dlc) (rouge) (colonne de gauche, figure 4B) 6,7. En comparaison, lorsque la transcription de DLC ont été détectées avec un substrat pourpre, et ont été marquées en combinaison avec la Krox20 marqueur cerveau postérieur (rouge), un sous-domaine rostrale des progéniteurs du rein a été visualisée qui exprime dlc (colonne de droite, la figure 4B), comme indiqué précédemment 6,7. Appartement monter préparations peuvent être utilisées de manière similaire à étudier les étapes de somitogenèse plus tard. Au stade de la somite 14, nous avons analysé l&#39;expression de marqueurs rénaux PAX2A, slc4a4, et slc12a3 (violet) avec smyhc1 (rouge), qui marque les somites (figure 4C). Ces combinaisons permettent la cartographie de l&#39;ensemble du domaine de progéniteurs avec PAX2A rénale, tout en révélant que un sous-ensemble de cellules dans une sous-domaine expr rostralEssed slc4a4a et se distinguaient par une caudale sous-domaine non-chevauchement des progéniteurs rénaux qui ont exprimé slc12a3. WISH deux couleurs et le montage préparation plat sont également précieux pour l&#39;étude des domaines cellulaires pendant l&#39;organogenèse chez le poisson zèbre à des mutations génétiques ou d&#39;autres perturbations de l&#39;exposition environnementale à de petites molécules 6,7 (figure 5). Les nls poisson zèbre et mutants lib abritent des mutations dans l&#39;aldéhyde déshydrogénase 1a2 (aldh1a2, anciennement connu sous le nom raldh2), qui code pour une enzyme nécessaire à la biosynthèse de l&#39;acide rétinoïque (RA). RA est essentielle pour le bon développement de plusieurs types de cellules rénales, y compris la formation de cellules de podocytes qui contribuent à rendre le filtre de sang du rein embryonnaire, appelée le glomérule 6,7. WISH a été réalisée pour marquer les progéniteurs podocytes avec wt1a en concomitance avec la démarcation de til somites développement avec smyhc1 cerveau postérieur et avec Krox20 dans des embryons de type sauvage, nls embryons mutants, des embryons mutants lib, et les embryons traités avec un inhibiteur de l&#39;enzyme ALDH chimique, DEAB (Figure 5). Embryons avec l&#39;expression de aldh1a2 déficient montré une expression de wt1a réduite par rapport aux embryons de type sauvage, alors que les embryons DEAB-traités ont montré une abrogation de transcriptions de wt1a (Figure 5, colonne de droite). Pris ensemble, ces résultats représentatifs montrent comment la technique de montage à plat peut être utilisé pour analyser et documenter les différences anatomiques avec précision dans l&#39;embryon précoce, et donc être mis en œuvre pour les études de développement de valeur. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la monter préparation platration pour embryons de poisson zèbre. A) La procédure de montage à plat permet l&#39;affichage simultané de tissus le long de l&#39;axe embryonnaire parce que la masse de jaune central est enlevé et l&#39;embryon positionnée de manière stable sur une surface plane. B) Images de toute une montagne SOUHAITENT embryon teinté en vue latérale et dorsale, et puis, après une préparation montage plat a été menée. L&#39;embryon a été coloré avec des sondes antisens pour détecter des transcrits de gènes codant irx3b (violet) et MyoD1 (rouge). <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma de la procédure de montage plat pour embryons de poisson zèbre. A) L&#39;embryon est d&#39;abord grossièrement deyolked pour enlever la majorité de la masse de jaune, puis (B) la surface ventrale est finement deyolked pour enlever restants granules de jaune, etaprès lavage de l&#39;embryon est (C) monté côté dorsal vers le haut sur ​​une lame de verre pour analyse visuelle et / ou une image photographique. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figure 3. Photographies de cils exemple les outils par rapport à une pince fine. A) les outils de cils faits maison ont été imagées à côté d&#39;une paire norme de pinces fines, positionnée adjacente à une règle métrique pour fournir une référence. B) La vue agrandie d&#39;outils cils à côté de la pince fine, avec la référence de millimètre prévu le long du haut de la vue . Deux outils de cils différents sont présentés, avec l&#39;astérisque (*) utilisé pour marquer le fouet obtenu à partir d&#39;un hangar naturellement cils humaine, et double astérisque (**) utilisé pour marquer un coup de fouet qui a été obtenu à partir d&#39;un hangar naturellement félin favori et coupé à faire une fin quelque peu émoussé. Dans chaque casoi, le fouet a été enfilé à travers la pointe de la pipette et fixée à l&#39;aide de plusieurs couches de colle de créer progressivement un joint solide pour stabiliser / ancrer le fouet à la pipette attaché à un dispositif de manipulation. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figure 4. Caractérisation des changements développementaux dans le domaine de l&#39;ancêtre rénale chez le type sauvage embryon de poisson zèbre. A) Faites glisser schématique indiquant la zone imagée pour analyse (B, C). B) des embryons de type sauvage à la 1, 3 et 5 stade de somites ont été colorées par deux couleurs souhaitent évaluer la composition du champ progénitrices rénale qui donne relever le rein embryonnaire, ou pronephros. (Colonne de gauche) transcrits codant pour le facteur de transcription PAX2A (teinté en violet) marquent plusieurs populations dans l&#39;embryon, dont le p rénalechamp rogenitor qui se dégage du mésoderme intermédiaire. Transcrits codant pour le ligand de Notch dlc marquent les somites qui se forment à partir du mésoderme paraxial (teinté en rouge). (Colonne de droite) Lorsque l&#39;expression des transcrits de dlc (colorées en violet) et le cerveau postérieur rhombomère marqueur Krox20 (teinté en rouge) sont examinées dans les mêmes embryons, expression dlc peut être observé dans un sous-domaine rostrale des progéniteurs rénaux situés à côté de somites 1-5, qui a été occulté pendant la co-coloration de dlc avec PAX2A. C) embryons de type sauvage au stade 14 somites sont double ou triple teinté avec une combinaison d&#39;un marqueur rénale (violet), le marqueur smyhc1 somites (rouge) , et le cerveau postérieur rhombomère marqueur Krox20 (aussi rouge). (Panneau supérieur) A ce stade, les transcriptions de PAX2A continuer à délimiter les progéniteurs rénaux. (Moyen-Orient, les panneaux inférieurs) Sur le territoire de l&#39;ancêtre rénale, un sous-domaine rostrale est marquépar slc4a4 et transcriptions qui codent slc12a3 marquer un sous-domaine caudale. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;utilisation de préparations montées à plat pour caractériser les phénotypes causés par des mutations génétiques ou de perturbations génétiques chimiques qui modulent la biosynthèse de l&#39;acide rétinoïque. Le motif de souhaits expression au stade 15 somites de wt1a (violet) et smyhc1/krox20 (rouge) ont été comparées entre les types sauvages et les embryons présentant des anomalies dans l&#39;acide rétinoïque (RA) de production en raison de défauts de l&#39;aldéhyde déshydrogénase 1a2 (nls et mutations lib) ou l&#39;inhibition chimique de retinaldehyde déshydrogénase avec diéthylaminobenzaldéhyde (DEAB). La réduction de la production de RA dans lib est légèrement plus sévère que nls, commeque les embryons lib expriment légèrement réduit la coloration des transcriptions de wt1a de mise en scène de la même nls embryons mutants, tandis que le traitement DEAB de types sauvages est associée à l&#39;abrogation complète de l&#39;expression wt1a.

L&#39;embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l&#39;embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d&#39;embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

L'objectif général de cette procédure est d'améliorer la visualisation d'embryons de poisson zèbre fixés et colorés à des stades précoces du développement. Cette amélioration est obtenue en colorant d'abord l'embryon de poisson zèbre à l'aide d'une hybridation en C deux avec montage maison. Ensuite, on sélectionne un embryon pour le monter à plat et on effectue une incision centrale dans le vitellus à l’aide d’une paire de fines pinces, puis on utilise des outils en cils pour gratter délicatement et enlever les granules de vitellus restants.Enfin, l'embryon est monté dans du glycérol sur une lame afin de permettre l'observation adéquate de l'échantillon. En définitive, le montage à plat permet une meilleure visualisation des embryons colorés en vue dorsale, en éliminant le vitellus et en positionnant l'embryon dans une préparation bidimensionnelle. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'observation d'embryons intacts à des stades de développement plus précoces, est que le montage à plat supprime la vésicule vitelline, ce qui permet d'observer l'embryon en entier.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement, comme la caractérisation du domaine du champ précurseur rénal selon le sexe dans un embryon. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car cette technique exige une manipulation délicate de l'embryon, et aussi parce qu'il faut du temps pour apprendre la pression appropriée nécessaire pour retirer la poche vitelline. Cette procédure sera démontrée par moi-même, Zoe, et Amanda, qui sommes étudiantes diplômées dans le laboratoire de Winger.Après avoir collecté, fixé et coloré les embryons selon le protocole décrit, sélectionnez un embryon pour une monture à plat à l’aide d’un X-P-B-S-T. Transférez l’embryon dans une boîte de Pétri en plastique ou en verre. Ensuite, avec la boîte placée sous un microscope stéréo, utilisez une pince fine pour faire rouler l’embryon de manière à obtenir une vue latérale où les extrémités céphalique et caudale sont visibles.Ensuite, utilisez une pince fine pour maintenir l'embryon immobile et une deuxième paire pour pratiquer une incision dans le vitellus à un emplacement situé au centre entre la tête et la queue de l'embryon. Puis, à l’aide de la pince fine, retirez le vitellus de la cavité de la cellule de chêne. Utilisez un X-P-B-S-T pour rincer les résidus de vitellus sur l’embryon en appliquant une à deux gouttes d’un XPBS.Transférez l'embryon sur une lame en verre plate. Déplacez l'embryon vers le bord du tampon afin qu'il reste en position plane contre la lame en verre. Tout en maintenant l'embryon fixe, utilisez un outil en forme de cil pour gratter doucement la surface ventrale et éliminer les granules de vitellus.Si la solution de PBST devient encombrée par un excès de vitellus ou commence à s'évaporer, ajoutez une à deux gouttes fraîches et déplacez l'embryon dans ce tampon frais. Une fois que le vitellus a été correctement éliminé, transférez délicatement l'embryon dans une boîte de Pétri contenant du PBST pour un rinçage final. Ensuite, transférez l'embryon dans une boîte de Pétri contenant du glycérol à 100 % et incubez pendant cinq minutes.Pour monter l'embryon sur une lame en verre, transférez-le sur une lame propre. Déposez une à deux gouttes de glycérol à 100 % et positionnez l'embryon avec le côté ventral du jaune tourné vers la lame. À l'aide d'un outil en forme de pinceau, déplacez l'embryon vers le bord de la goutte de glycérol afin qu'il reste à plat contre la lame.Si l'axe embryonnaire est courbé, utilisez la pince fine pour effectuer de petites incisions dans le reliquat de vitellus afin de relâcher la tension, permettant ainsi de le positionner à plat. Sur la lame. Placez de petits morceaux de pâte à modeler aux quatre coins d'un couvre-objet en verre de 18 sur 18.Placer lentement la lame couvre-objet sur l'embryon, en inclinant celle-ci afin de minimiser les bulles d'air dans le glycérol. Enfin, ajouter une goutte supplémentaire de glycérol à 100 % sur le côté de la lame couvre-objet pour combler l'espace entre les verres et éviter tout déplacement ; utiliser un microscope stéréo ou un microscope composé pour l'observation illustrée ici. Une combinaison de sondes a été utilisée, avec une double coloration, afin de marquer les progéniteurs rénaux en développement responsables de la formation du rein, et les embryons ont été montés à plat au stade précoce.Ainsi, à ce stade, les progéniteurs rénaux sont délimités selon un motif en forme de U par leur expression de transcrits PAX2a entourant le mésoderme pariétal qui exprime simultanément delta C, indiqué en rouge. Lorsque delta C a été marqué conjointement avec Ccrox20, un sous-domaine rostral des progéniteurs rénaux a été mis en évidence, exprimant delta C. L'analyse de l'expression de PAX2a, SLC4a4, SLC12a3 et S-M-Y-H-C1 au stade 14 a permis de cartographier tout le domaine des progéniteurs rénaux à l'aide de PAX2a, et a révélé qu'un sous-ensemble de cellules du sous-domaine rostral exprimait SLC4a4.Cela ne chevauchait pas le sous-domaine coddle des progéniteurs rénaux exprimant SLC12A3. Dans cette figure, les embryons porteurs de mutations dans le gène de la rétinaldéhyde déshydrogénase deux (Retinaldehyde dehydrogenase two), nécessaire à la biosynthèse de l'acide rétinoïque, ou les embryons traités avec l'inhibiteur DEAB et ALDH, se développent avec une expression respectivement réduite ou abolie de WT1A, démontrant que la technique de double coloration WISH combinée à la préparation en monture totale est utile pour l'étude des domaines cellulaires durant l'organogenèse. Chez le poisson zèbre porteur de mutations génétiques ou exposé chimiquement à des petites molécules, cette technique, une fois maîtrisée, peut prendre de 10 à 15 minutes si elle est correctement réalisée.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que l'imagerie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'emplacement des limites des segments rénaux. Après avoir visionné la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon monter à plat un embryon de poisson zèbre coloré afin de mieux visualiser les structures souhaitées par l'élimination du vitellus.

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