Appartement Mont Préparation pour l'observation et l'analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne In situ Hybridation

L’objectif global de cette procédure est de mieux visualiser les embryons de poissons-zèbres fixes colorés aux premiers moments de développement. Ceci est accompli en colorant d’abord l’embryon de poisson zèbre à l’aide d’un support domestique dans l’hybridation C deux. Ensuite, un embryon est sélectionné pour être monté à plat et une incision centrale est pratiquée dans le jaune à l’aide d’une paire de pinces fines, puis les outils pour cils sont utilisés pour gratter doucement et retirer les granules de jaune restants.

Enfin, l’embryon est monté dans du glycérol sur une lame pour permettre l’imagerie appropriée de l’échantillon. En fin de compte, le montage à plat permet une meilleure visualisation des embryons colorés depuis une vue dorsale en retirant le jaune et en positionnant l’embryon dans une préparation bidimensionnelle. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’imagerie d’embryons intacts à des stades de développement plus jeunes est que le montage à plat enlève le sac vitellin, ce qui permet de voir l’embryon entier.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement, telles que la caractérisation du domaine du domaine rénal pré-sexué chez un embryon. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont du mal parce que cette technique nécessite une manipulation délicate de l’embryon, et aussi parce qu’apprendre la quantité appropriée de pression nécessaire pour retirer le sac vitellin peut prendre du temps. Moi-même, Zoe et Amanda, qui sommes des étudiants diplômés dans le laboratoire winger, ferons la démonstration de cette procédure.

Après avoir collecté, fixé et coloré les embryons, conformément au protocole textuel, sélectionnez un embryon pour un montage à plat avec un X-P-B-S-T. Transférez l’embryon dans une boîte de Pétri en plastique ou en verre. Ensuite, avec la boîte sous un stéréomicroscope, utilisez des pinces fines pour rouler l’embryon de manière à obtenir une vue latérale avec la tête et les extrémités de la queue visibles.

Ensuite, utilisez des pinces fines pour maintenir l’embryon stable et une deuxième série pour faire une incision dans le jaune à une position centrale située entre la tête et la queue de l’embryon. Ensuite, à l’aide d’une pince fine, retirez le jaune de la cavité cellulaire du chêne. Utilisez un X-P-B-S-T pour rincer le jaune errant de l’embryon en utilisant une à deux gouttes d’un XPBS.

Transférez l’embryon sur une lame de verre plat. Faites glisser l’embryon vers le bord du tampon de manière à ce qu’il reste à plat contre la lame de verre. Lors de l’ancrage de l’embryon, utilisez un outil à cils pour gratter doucement la surface ventrale afin d’éliminer les granules de vitellus.

Si la solution de PBST est encombrée d’un excès de jaune ou commence à s’évaporer, ajoutez une à deux gouttes fraîches et faites glisser l’embryon dans ce tampon frais. Une fois que le jaune a été retiré de manière satisfaisante, transférez doucement l’embryon dans une boîte de Pétri de PBST pour un rinçage final. Transférez ensuite l’embryon dans une boîte de Pétri contenant 100 % de glycérol et incubez pendant cinq minutes.

Pour monter l’embryon sur une lame de verre, transférez-le dans un verre propre. Glissez-y une à deux gouttes de glycérol à 100 % et positionnez-le avec le côté jaune ventral face à la lame de verre. À l’aide d’un outil à cils, faites glisser l’embryon vers le bord de la goutte de glycérol afin qu’il reste en position plate contre la lame.

Si l’axe embryonnaire est incurvé, utilisez la pince fine pour faire doucement de petites incisions dans le jaune restant afin de soulager la tension et de le positionner à plat. Sur la diapositive. Placez de petits divots de pâte à modeler sur les quatre coins d’une lamelle en verre de 18 par 18.

Placez lentement la lamelle sur l’embryon, en l’inclinant afin de minimiser les bulles d’air dans le glycérol. Enfin, ajoutez une goutte supplémentaire de 100 % glycérol sur le côté de la lamelle pour remplir l’espace entre le verre et pour éliminer la dérive, utilisez un microscope stéréo ou composé pour obtenir l’image présentée ici. Une combinaison de sondes a été utilisée avec deux couleurs pour marquer les progéniteurs rénaux en développement qui donnent naissance au rein et les embryons ont été montés à plat au début.

Ainsi, les stades de l’acarien, les progéniteurs rénaux sont délimités en forme de U par leur expression de PAX deux transcrits A entourant le mésoderme parial qui exprime concomitamment le delta C indiqué en rouge. Lorsque le delta C a été co-marqué avec le C crox 20, un sous-domaine rostral des progéniteurs rénaux a été révélé qui exprime le delta C en analysant l’expression de PAX deux a, SLC quatre A quatre, SLC 12 A trois et S-M-Y-H-C un au 14. Ainsi, le stade de l’acarien permet de cartographier l’ensemble du domaine progéniteur rénal avec PAX deux A, et a révélé qu’un sous-ensemble de cellules du sous-domaine rostral exprimait SLC quatre A quatre.

Cela ne chevauchait pas le sous-domaine du coddle des progéniteurs rénaux qui exprimait SLC 12 A trois. Dans cette figure, des embryons présentant des mutations dans le gène de la rétine rétinaldéhyde déshydrogénase deux nécessaire à la biosynthèse de l’acide rétinoïque ou des embryons traités avec DEAB et un inhibiteur de l’ALD H se sont développés avec une expression réduite ou abrogée respectivement de WT un A, démontrant que le souhait de deux couleurs avec la préparation à montage plat est précieux pour l’étude des domaines cellulaires au cours de l’organogenèse. Chez le poisson-zèbre présentant des mutations génétiques ou lorsqu’il est exposé chimiquement à de petites molécules, une fois maîtrisée, cette technique peut prendre 10 à 15 minutes si elle est correctement exécutée.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’imagerie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’emplacement des limites des segments rénaux. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de monter à plat un embryon de poisson-zèbre coloré afin de mieux visualiser les structures souhaitées par l’élimination du jaune.