Une méthode rapide pour le traitement du sang pour augmenter le rendement des niveaux peptidiques plasma dans le sang humain

L’objectif global de cette méthode RAPID est d’améliorer le rendement des hormones peptidiques endogènes à mesurer dans le sang humain. La méthode RAPID a été récemment établie pour une utilisation chez le rat, et convient également à une utilisation dans le sang humain. La méthode RAPID améliore le rendement et permet de détecter la forme moléculaire correcte du peptide endogène.

La méthode RAPID est facile à utiliser. Cependant, la méthode RAPID prend plus de temps et coûte plus cher que le prélèvement sanguin standard. Cela pourrait donc être plus applicable dans le cadre de la recherche.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la dilution en temps opportun des échantillons ainsi que l’élution sont d’une grande importance pour garantir un niveau de peptide approprié. Prélever du sang veineux à un moment normalisé après un jeûne d’une nuit à partir d’une veine de l’avant-bras. Et traiter selon des procédures standard, ou la méthode RAPID.

Demander aux sujets de ne pas faire d’exercice ou de fumer avant le prélèvement sanguin. Pour le traitement standard, prélever le sang dans des tubes contenant de l’EDTA réfrigérés et centrifuger dans les 10 minutes à 3000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant et maintenez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit traité ultérieurement par dosage radio-immunologique.

Pour le traitement RAPID, diluez immédiatement le sang de un à 10, dans un tampon RAPID glacé. PH trois virgule six, contenant zéro virgule un molaire amoniumasitate. Chlorure de sodium molaire à point zéro et inhibiteurs d’enzymes.

En 10 minutes, centrifuger l’échantillon RAPID à 3000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et prélever le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, chargez les cartouches de chromatographie avec 100 % d’actitonitrile, à 10 millilitres par minute. Après équilibration avec 0,1 % de trifluoroacétique, ou TFA.

Chargez avec le surnageant d’échantillon RAPID, à un débit constant d’un millilitre par minute, à l’aide d’un pousse-seringue. Après avoir lavé les cartouches avec trois millilitres de TFA à 0,1 %, à 10 millilitres par minute, éluez lentement l’échantillon RAPID avec deux millilitres d’acétonitrile à 70 % contenant 0,1 % de TFA, à raison de deux millilitres par minute. Sécher les échantillons élués par centrifugation sous vide et les stocker à moins 80 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’ils soient traités par dosage radio-immunologique.

Obtenez des peptides humains marqués à l’iode 125. Conservez les peptides sous forme de poudre jusqu’à l’expérience. Puis diluer fraîchement dans de l’acide acétique à 0,1 %.

Pour un traitement standard, directement après le prélèvement du sang, dans des tubes réfrigérés contenant de l’EDTA, transférez un millilitre de sang dans un tube contenant 50 microlitres de radiomarqueur, contenant 3000 à 6000 CPM. Pour le traitement RAPID, transférez un millilitre d’EDTA contenant du sang dans un tube contenant neuf millilitres de tampon RAPID, et 500 microlitres de radiomarqueur contiennent 30 000 à 60 000 CPM. En raison de la dilution de un à 10, utilisez un volume de radiomarqueur 10 fois plus élevé pour le traitement RAPIDE.

Directement après l’application des différentes étapes de la méthode RAPID, évaluer la récupération des peptides marqués radioactivement à l’aide d’un compteur gamma. Ne séchez pas les échantillons par centrifugation sous vide et notez qu’ils sont stockés à moins 80 degrés Celsius. Pour la mesure, transférez le surnageant dans des tubes raccordés au compteur gamma.

Et évaluez le nombre de comptes par minute. Mesurer l’ensemble du surnageant dans des échantillons standard. Dans les échantillons RAPID, analysez un dixième du volume total pour obtenir une quantité comparable de radiomarqueurs utilisés.

En tant qu’étalon à 100 %, utilisez deux échantillons avec 50 microlitres de peptide radiomarqué d’iode 125 qui ne subissent pas de traitement. Mesurez la radioactivité de tous les échantillons en même temps. Prélever du sang, dans des tubes contenant de l’EDTA réfrigérés, et transférer un millilitre dans des tubes contenant 200 microlitres d’acylghréline radiomarquée, contenant 15 000 à 20 000 CPM, pour un traitement standard.

Pour le traitement RAPID, transférez un millilitre de sang dans un tube contenant neuf millilitres de tampon rapide et 200 microlitres d’acylghréline radiomarquée contenant 15 000 à 20 000 CPM. Ensuite, traitez les échantillons comme précédemment. Pour une analyse plus approfondie par HPLC en phase inversée, chargez directement les échantillons sur une colonne C18 à liaison stable équilibrée en 17 % d’acétonitrile dans de l’eau complétée par 0,1 % de TFA.

Après cinq minutes d’équilibre, utiliser un gradient de 17 à 40 % d’acétonitrile, pour éluer l’échantillon en 40 minutes, à raison d’un millilitre par minute. Prélevez des fractions de millilitre toutes les minutes et analysez la radioactivité à l’aide d’un compteur gamma. Dans une expérience distincte, chargez 200 microlitres d’acylghréline radiomarquée contenant 15 000 à 20 000 CPM directement sur la colonne et effectuez la HPLC comme précédemment.

Pour les essais radio-immunologiques, décongelez les surnageants congelés et la poudre séchée sous vide à température ambiante. Immédiatement avant le dosage radio-immunologique, remettre en suspension les échantillons secs de RAPID dans de l’eau bidistillée, en fonction du volume plasmatique initial. Évaluer la kisspeptine et la ghréline totale ainsi que l’acyl ghréline, à l’aide de radio-imprégnoasies commerciales conformément aux protocoles du fabricant.

Utilisez des tubes en borosilicate qui permettent une formation stable de la palette. Le premier jour, incuber les échantillons à l’aide d’un tampon de dosage et d’un corps primaire dans la dilution fournie par le fabricant pendant une période de 24 heures. Le deuxième jour, ajoutez le traceur d’iode 125, vortex et incubez pendant une période de 24 heures.

Le troisième jour, ajoutez le réactif de précipitation, le vortex et incubez comme recommandé par le fabricant. Ensuite, centrifugez les tubes à 3 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez les surnageants et comptez la radioactivité dans les palettes, à l’aide d’un compteur gamma.

Calculez la désacylghréline, comme la différence entre la ghréline totale moins l’acyl ghréline. Évalue le rapport acyle, désacyl ghréline, en plongeant acyle par désacyl ghréline pour chaque échantillon individuel. Si possible, traitez tous les échantillons en un seul lot, afin d’éviter la variabilité entre les essais.

traitement sanguin RAPID augmente le rendement des peptides radiomarqués à l’iode 125 dans le sang humain, par rapport au traitement sanguin standard. Après un traitement sanguin standard, la récupération des peptides radiomarqués variait de 48 % à 68 % dans neuf peptides. Le traitement RAPID a amélioré le rendement de tous les peptides marqués à l’iode 125, avec une récupération allant de 71 % à 98 %.

Après le traitement RAPID, la ghréline marquée à l’iode 125 s’est échappée à la position prévue. Alors qu’après la procédure standard, un pic plus précoce a été observé. Correspondant probablement à la désacyl ghréline.

Cela représentait une dégradation de 62 % du peptide. Le traitement sanguin RAPID améliore le rapport acyle, désacyl ghréline par rapport au traitement standard. Après le traitement RAPID, le rapport acyle, désacyl ghréline dans le sang des sujets de poids normal était de un à trois.

Par rapport à un à 23 suivant le traitement du sang standard. Des résultats similaires ont été observés dans des conditions anorexiques et obèses. Le traitement sanguin RAPIDE entraîne une augmentation des taux sanguins de kisspeptine endogène par rapport au traitement standard.

Chez les sujets anorexiques et de poids normal, les taux de kisspeptine endogène circulante étaient significativement plus élevés après l’étude RAPID par rapport au traitement standard. La différence n’a pas atteint la signification dans des conditions d’obésité. Une fois maîtrisée, et exécutée correctement, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure.

Cette méthode est particulièrement importante lorsque la concentration attendue du peptide est faible ou que les différences entre les groupes sont faibles. Une recommandation générale pour les peptides ne peut pas être donnée. Le bénéfice potentiel de chaque peptide doit être testé une fois au début.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs de différents domaines pour explorer le rendement et, plus important encore, la forme moléculaire correcte des hormones peptidiques endogènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer la méthode RAPID pour le traitement du sang chez l’homme.