L'injection de cellules syngéniques murin de mélanome pour déterminer leur potentiel métastatique dans les Poumons

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une méthode de production de tumeurs métastatiques chez six souris noires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunothérapie, comme la façon dont les agents de recherche affectent la réponse immunitaire dans les poumons. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit de métastases expérimentales.

Les résultats sont donc fiables et relativement cohérents. Pour commencer, placez des cultures de cellules de mélanome B16-BL6, dont la confluence doit être d’environ 70 %, dans une hotte stérile. Ensuite, ajoutez un millilitre de 05 % de trypsine EDTA dans chaque plat et laissez les cellules pendant une minute.

Après avoir aspiré cette solution, ajoutez un millilitre de trypsine dans chaque plaque, puis remettez les cellules dans l’incubateur. Après 10 minutes, déplacez les cellules dans une hotte stérile et ajoutez quatre millilitres de milieu RPMI sans sérum dans chaque plaque. Ensuite, collectez les cellules à l’aide d’une pipette motorisée stérile.

Pour briser les amas qui pourraient potentiellement obstruer l’aiguille d’éjection, appuyez la pointe de la pipette contre le bas de la plaque et expulsez les cellules. Après avoir répété ce processus plusieurs fois, récupérez les cellules et transférez-les dans un tube conique de 15 millimètres. Ensuite, prélevez un échantillon de la suspension cellulaire, insérez-le dans un hémocytomètre et déterminez la densité cellulaire.

Répartissez également la suspension cellulaire dans quatre tubes de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les tubes, puis décantez le surnageant. Procédez à l’étiquetage de chacun des tubes avec une densité de cellules différente - 0, 0,063, 0,125, 0,25 ou 0,5 million de cellules par millilitre.

Ajoutez ensuite un volume approprié de RPMI sans sérum à chaque cône pour produire ces concentrations finales. Confirmez les densités cellulaires souhaitées à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, répartissez 500 microlitres de chaque suspension dans des tubes étiquetés de 1,8 millilitre placés sur de la glace.

Une fois que toutes les suspensions de cellules B16-BL6 ont été préparées, sélectionnez une souris. En le tenant par la queue, guidez l’arrière de l’animal en premier dans un dispositif de contention. Lorsque le torse de la souris est dans la chambre principale et sa queue à l’extérieur de l’appareil, tirez l’animal vers l’extrémité du dispositif de contention.

Ensuite, insérez le piston de retenue et continuez à pousser sur le piston jusqu’à ce que la souris soit bien fixée. Une fois l’animal en place, faites pivoter la souris de 90 degrés de sorte que l’une des veines latérales de la queue soit tournée vers le haut. Ensuite, utilisez un tampon imbibé d’alcool pour nettoyer vigoureusement le côté de la queue de la souris où la veine est la plus visible.

Pour préparer l’injection, prélevez d’abord 300 microlitres de la suspension de 0,5 million de cellules par millilitre dans une seringue. Ensuite, éjectez les bulles de la seringue en la renversant, en effleurant son côté et en poussant le piston. Une fois les bulles éliminées, éjectez la culture cellulaire pour obtenir un volume final de 250 microlitres dans la seringue.

Procédez à l’extension de la queue de la souris avec la main non dominante. Tenez-le de manière à ce que l’index élève l’extrémité proximale de la queue et que le pouce enfonce la partie distale. Avec la main dominante, insérez l’aiguille dans la veine vers l’extrémité distale de la queue à un petit angle vers le bas.

Insérez ensuite l’aiguille plus loin, en l’ajustant de manière à ce qu’elle corresponde à l’angle de la veine de la queue. Une fois que l’aiguille a été insérée à environ un centimètre dans la veine de la queue, commencez à pousser le piston tout en maintenant la seringue stable. Arrêtez tout saignement en tenant de la gaze contre le site d’entrée.

Une fois la suspension cellulaire éjectée, retirez l’aiguille de la veine et jetez-la. Ensuite, retirez le piston de la retenue et placez la souris dans une cage réceptrice. Ce protocole visait à identifier le nombre optimal de cellules B16-BL6 à injecter pour créer un modèle utile de mélanome métastatique.

On voit ici des foyers expérimentaux indiqués par des flèches formées dans les poumons deux à trois semaines après l’injection de cinq densités cellulaires différentes. Lorsque 500 000 cellules par millilitre ont été injectées, des foyers ont complètement recouvert les poumons. Dans l’exemple présenté ici, 102 foyers ont été comptés.

En revanche, les poumons n’étaient que faiblement recouverts de foyers lorsque 62 500 cellules par millilitre ou 125 000 cellules par millilitre ont été injectées. Respectivement, ces densités ont entraîné un nombre de foyers pulmonaires de un et de 17. À l’aide de cette méthode, il a été déterminé que la concentration optimale de cellules à injecter était de 250 000 cellules par millilitre.

Cette densité a donné des poumons avec environ 65 foyers, un nombre auquel les organes n’étaient ni complètement recouverts ni trop clairsemés de foyers. Une énumération plus poussée de ces données, lorsqu’elle est représentée graphiquement, démontre une relation approximativement linéaire entre les foyers pulmonaires et la densité de culture cellulaire supérieure à 125 000 cellules par millilitre, comme indiqué ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure, le nombre de souris dépendant, si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de procédure, il est important de se rappeler d’essayer d’injecter un nombre équivalent de cellules par souris. Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être utilisées, telles que l’administration de médicaments, pour répondre à des questions telles que la façon dont les thérapies potentielles affectent un certain nombre de foyers résultants. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en cancérologie pour explorer les constituants du cancer métastatique dans le mélanome chez six souris noires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter et de préparer les cellules B16-BL6, de retenir les souris, de préparer les aiguilles et d’injecter un nombre équivalent de cellules dans chaque veine de la queue. N’oubliez pas que travailler avec des cultures de mammifères et des aiguilles peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que d’éviter les piqûres d’aiguilles et de porter un équipement de protection, doivent toujours être prises.