Fixation à l’éthanol et coloration DAPI : une méthode pour visualiser l’ADN chez C. elegans

- Commencez par une goutte de solution tampon sur une lame de microscope et transférez les vers intacts dans la gouttelette. Une fois les vers en place, utilisez un mouchoir non pelucheux pour absorber et retirer le tampon. Fixez l’échantillon en baignant plusieurs fois les échantillons avec de l’éthanol à 90 %, en le laissant s’évaporer après chaque application.

Une fois que l’éthanol s’est évaporé après le rinçage final, ajoutez une solution contenant le colorant d’acide nucléique, DAPI, à l’échantillon. Le DAPI se lie préférentiellement aux bases adénine et thymine dans le sillon mineur de l’ADN. Lorsqu’il est lié, le complexe DAPI-ADN absorbe la lumière UV et émet de la lumière bleue visible.

Ajoutez ensuite un conservateur anti-décoloration pour prolonger la durée de conservation de l’échantillon. Appliquez une lamelle et scellez-la sur la lame. Ensuite, utilisez un microscope fluorescent avec un filtre bleu pour visualiser les corps DAPI, qui, en fonction de la cellule et de l’état de son cycle, peuvent représenter des chromosomes uniques, des paires de chromatides sœurs ou des noyaux entiers. Dans cette expérience, nous compterons les paires de chromatides sœurs colorées au DAPI dans les ovocytes, afin d’identifier les souches tétraploïdes de Caenorhabditis elegans.

- Les souches tétraploïdes ont 12 paires de chromosomes, qui peuvent être validées en comptant les corps colorés au DAPI dans les ovocytes non fécondés. Pour ce faire, déposez cinq à dix microlitres de tampon M9 sur une lame et transférez six à 10 tétraploïdes présumés dans la goutte. Sous un microscope à dissection, absorbez soigneusement la majeure partie du M9 dans un chiffon de nettoyage non pelucheux.

Déposez ensuite 10 microlitres d’éthanol à 90 % sur les vers et regardez l’éthanol s’évaporer complètement. Dès que l’évaporation est terminée, répétez le processus d’ajout d’éthanol et regardez-le s’évaporer. Au total, ajoutez 10 microlitres en quatre applications. Une fois la dernière goutte évaporée, ajoutez six microlitres de DAPI à deux nanogrammes par microlitre, ou une coloration similaire.

Pour un stockage à long terme des lames, montez les vers dans un anti-décoloration disponible dans le commerce ou fait maison. Ajoutez ensuite une lamelle et scellez les bords avec du vernis à ongles. Une fois que le vernis à ongles a séché, les lames peuvent être entaillées. Utilisez un microscope fluorescent et un grossissement de 100x.

Tout d’abord, trouvez l’ovocyte non fécondé le plus mature, qui est immédiatement adjacent à la spermathèque et qui n’a pas encore pénétré dans la spermathèque ou l’utérus. Les corps DAPI ici sont probablement des paires de chromosomes uniques. Ensuite, faites la mise au point sur le noyau de l’ovocyte et utilisez la mise au point fine du microscope pour le balayer lentement, de haut en bas, tout en comptant les corps DAPI. Ensuite, recomptez les corps DAPI dans le même noyau en déplaçant le focus de bas en haut.

Les ovocytes de type sauvage ont six corps DAPI en moyenne. La présence de 12 corps DAPI indique que les animaux de cette souche sont des tétraploïdes partiels ou complets. Analysez au moins 10 animaux par souche. Souvent, les paires de chromosomes sont très proches ou se touchent, de sorte que le nombre de corps DAPI est souvent inférieur au nombre réel de paires de chromosomes.