Imagerie à vie en fluorescence de l’agrégation de la protéine PolyQ dans les neurones de Caenorhabditis elegans

Commençons par des vers Caenorhabditis elegans anesthésiés, du même âge, et des vers Caenorhabditis elegans déficients en chaperons.

Les deux groupes expriment dans leurs neurones des protéines polyQ marquées au fluorophore qui sont sujettes à un mauvais repliement.

Chez les vers témoins, les protéines chaperonnes limitent l’agrégation de polyQ mal repliés, tandis que chez les vers déficients en chaperons, les polyQ mal repliés forment facilement des agrégats.

Placez la lame de contrôle sur une platine de microscope confocal pour la microscopie d’imagerie à durée de vie en fluorescence (FLIM).

Illuminez les vers à l’aide d’un laser pulsé.

Le laser excite le fluorophore, qui émet un photon lorsqu’il revient à l’état fondamental.

FLIM mesure la durée de vie de la fluorescence, c’est-à-dire la durée pendant laquelle le fluorophore reste dans son état excité.

Chez les vers déficients en chaperons, l’agrégation polyQ regroupe les fluorophores, favorisant le transfert d’énergie entre les fluorophores adjacents au lieu de l’émission de photons, réduisant ainsi la durée de vie de la fluorescence.

Le logiciel FLIM traite ces durées de vie pour générer des cartes codées en couleur, ce qui permet la visualisation de l’agrégation.

Une durée de vie de fluorescence réduite chez les vers déficients en chaperons, par rapport aux témoins, indique une augmentation de l’agrégation de polyQ.

Assurez-vous que les nématodes sont complètement immobiles. Ouvrez le logiciel d’acquisition FLIM. Localisez le bouton Tab et appuyez sur Activer les sorties. Placez la lame avec le C. elegans monté sur la platine et, à l’aide d’une lentille de grossissement 10 fois en mode transmission, localisez la position des nématodes sur la lame. Retirez la diapositive, passez l’objectif à un grossissement de 63 fois et appliquez le milieu d’immersion requis.

Placez la lame sur la scène et localisez les nématodes. Commencez à scanner l’échantillon. Sélectionnez une région d’intérêt et concentrez-vous sur son plan de projection maximal. Sur l’interface du logiciel FLIM, prévisualisez le nombre de photons détectés. La valeur ADC doit être comprise entre 1 fois 10 puissance quatrième et 1 fois 10 puissance cinquième. Si nécessaire, déplacez la mise au point sur un autre plan ou augmentez la puissance du laser pour collecter plus de photons.

- Assurez-vous d’éviter l’accumulation de photons, mais collectez une quantité suffisante de photons pour créer un bon ajustement et une bonne mesure à vie.

- Dans la barre de menus, sélectionnez l’onglet permettant de définir les paramètres d’acquisition. Sélectionnez Synchroniser le balayage pour permettre la détection d’un seul photon. Réglez l’acquisition sur une durée fixe ou un nombre fixe de photons. Appuyez sur Démarrer pour commencer l’acquisition. Ouvrez le logiciel et importez les fichiers de données FLIM via Fichier, Charger les données FLIM. Chargez tous les échantillons à partir d’une seule condition, même s’ils ont été obtenus lors de différentes sessions et à partir de différentes répétitions biologiques.

Si nécessaire, segmentez un seul nématode pour plusieurs images FLIM via la segmentation, le gestionnaire de segmentation. Faites glisser l’outil de recadrage autour de la zone d’intérêt jusqu’à ce qu’elle soit mise en surbrillance. Une fois terminé, appuyez sur OK. Sélectionnez une petite région où l’image basée sur l’intensité d’un C. elegans apparaît. La courbe de décroissance de cette région apparaît dans la grande fenêtre de décroissance sur le côté droit de l’interface.

Pour extrapoler la durée de vie dans l’onglet Données, définissez une valeur minimale intégrée arbitraire entre 40 et 300 afin d’exclure les pixels trop sombres pour produire un bon ajustement. Sélectionnez un nombre de temps minimum et un nombre de temps maximum pour limiter le signal FLIM à ces valeurs. Ne modifiez pas le nombre de photons prédéfinis d’un. Entrez le taux de répétition en mégahertz du laser utilisé lors de l’acquisition.

Entrez une valeur maximale de porte pour exclure tous les pixels saturés. Dans l’onglet Durée de vie, sélectionnez un raccord global à utiliser. Ne modifiez aucun autre paramètre que le nombre de sélection exponentielle si l’on sait que la décroissance de fluorescence choisie est multiexponentielle et présente plus d’une seule durée de vie.

Téléchargez l’IRF via le menu IRF. Pour estimer le décalage IRF, sélectionnez IRF, Estimation, Décalage IRF. Un ensemble de valeurs apparaît automatiquement dans l’onglet IRF. Une fois cela établi, ne modifiez aucun autre paramètre de cet onglet. Une fois tous les paramètres définis, appuyez sur Ajuster l’ensemble de données. L’ajustement résultant mis en évidence par une ligne bleue doit chevaucher tous les événements. Un bon ajustement est obtenu lorsque tous les événements sont alignés le long de l’ajustement.

Cliquez sur l’onglet Paramètres situé dans les menus en haut à droite de l’interface du logiciel, puis sélectionnez statistique, moyenne pondérée, et vérifiez que la valeur du khi-deux est aussi proche que possible de un. La valeur à vie de l’image sélectionnée est ainsi révélée par tau 1. Exportez toutes les informations d’intérêt via Fichier, Exporter les images d’intensité, Ajuster le tableau des résultats, Images, Histogrammes.