Isolement de périvasculaire Multipotentes Précurseurs cellulaires Populations de Cardiac Human Tissue

L'objectif général de cette procédure est d'isoler deux populations distinctes de cellules souches précurseurs multipotentes associées aux vaisseaux sanguins à partir de tissu cardiaque humain. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération cardiaque, telles que la contribution apportée à ce processus par des sous-ensembles de la population cellulaire péri-vasculaire. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle permet d'obtenir des populations de cellules progénitrices présentant une hétérogénéité réduite et une viabilité améliorée par rapport à un certain nombre de techniques classiques d'adhérence.

Cette technique pourrait avoir des implications dans le traitement des maladies cardiaques ischémiques, car certains sous-types de cellules souches périvasculaires se sont révélés posséder un potentiel cardiomyogénique. Bien que cette méthode permette de mieux comprendre le rôle des cellules périvasculaires dans la régénération cardiaque, elle peut également être utilisée pour étudier d'autres aspects des maladies cardiaques, tels que la fibrose myocardique. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de l'utilisation de cellules viables, qui dépend de la fraîcheur du tissu.

Pour commencer cette procédure, après avoir retiré le péricarde, les gros vaisseaux et les oreillettes, placez l'échantillon dans un milieu de lavage dans une boîte de Pétri. Ensuite, découpez le myocarde ventriculaire en petits morceaux d'environ un millimètre cube et traitez-les immédiatement pour obtenir un rendement cellulaire maximal. Préparez ensuite une solution de digestion fraîche et réchauffez-la à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Ensuite, filtrer les morceaux de tissu en suspension à l’aide d’un tamis de 100 microns et les laver deux fois avec du PBS. Transférer les morceaux de tissu dans un récipient stérile de 30 millilitres muni d’un couvercle hermétique. Ajouter la solution de digestion et placer le récipient dans un sac plastique scellé, puis dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius réglé à 120 tr/min.

Après 15 minutes, retournez le récipient trois fois. Ensuite, remettez-le dans le bain-marie pendant 15 minutes supplémentaires. Par la suite, retirez-le et arrêtez l'action des collagénases en ajoutant cinq millilitres de DMEM complété avec 20 % de FBS.

Ensuite, triturez le tissu digéré en pipetant doucement 10 à 20 fois avec une pipette sérologique de 10 millilitres afin de rompre les agrégats tissulaires. Puis, filtrez la suspension successivement à travers des filtres cellulaires de 100 microns, 70 microns, et enfin 40 microns, pour obtenir une suspension monocellulaire. Après cela, centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant quatre minutes.

Versez soigneusement le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de tampon d’hémolyse pendant deux minutes à température ambiante, avant de le diluer avec quatre millilitres de milieu de lavage. Répétez l’étape de centrifugation et resuspendez le culot dans un millilitre de milieu de lavage. Diluez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 90 microlitres de milieu de lavage pour obtenir une dilution au 1/10 de la suspension cellulaire.

Mélangez 10 microlitres de la suspension cellulaire diluée avec 10 microlitres de colorant bleu de trypan et déposez 10 microlitres du mélange sur un hémocytomètre standard pour le décompte cellulaire. Dans cette procédure, ajoutez 50 microlitres de sérum de souris à la suspension cellulaire et incubez-la à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes afin de bloquer la liaison non spécifique des anticorps. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant quatre minutes.

Éliminer le surnageant et resuspendre dans le milieu de lavage. Ensuite, aliquoter 50 microlitres de la suspension cellulaire dans chacun des deux tubes de cytométrie en flux en polystyrène à fond rond destinés aux contrôles d'isotype et non coloré, et placer le volume restant dans un troisième tube pour la coloration multiplex. Ajouter cinq anticorps à la suspension cellulaire unique pour la coloration multiplex.

Pipetez délicatement pour mélanger les anticorps avec les cellules et incubez tous les tubes à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes à l'abri de la lumière. Préparez les billes de contrôle de compensation en ajoutant une goutte de billes positives à 100 microlitres de milieu de lavage dans cinq tubes de cytométrie en flux. Ajoutez les anticorps individuellement à chacun des cinq tubes.

Ensuite, incuber tous les tubes à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes à l'abri de la lumière. Pendant ce temps, préparer des tubes de collecte de cellules, chacun contenant 500 microlitres de milieu de culture EGM-2, et les placer à quatre degrés Celsius. Après l'incubation avec les anticorps, ajouter cinq millilitres de milieu de lavage pour laver les cellules et les billes afin d'éliminer les anticorps non liés.

Centrifuger tous les tubes à 200 x g pendant quatre minutes. Répéter les étapes de lavage et de centrifugation et décantation soigneuse du surnageant. Ensuite, resuspendre les cellules dans le milieu de lavage à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par 250 µL.

Ensuite, resuspendre les billes dans 100 microlitres de milieu de lavage. Transférer les suspensions cellulaires et les suspensions de billes vers le trieur cellulaire sur glace et à l'abri de la lumière. Ajouter une goutte de billes négatives aux tubes de contrôle de compensation de billes positives et utiliser ceux-ci pour régler la compensation de fluorescence.

Ensuite, analyser les cellules contrôles non marquées pour établir la fluorescence de fond et régler les tensions. Puis, analyser les isotopes contrôles pour déterminer les seuils de fluorescence de fond liés à la liaison non spécifique. Analyser l'échantillon marqué en multicolore et recueillir les populations de cellules péricytaires et adventitielles dans les tubes de collecte.

Dans cette procédure, ajouter 100 microlitres de solution stérile de gélatine à 0,2 % par centimètre carré de surface de croissance et agiter manuellement pour recouvrir entièrement les puits. Ensuite, incuber les plaques à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis, éliminer complètement la solution de gélatine.

Conserver les cellules recueillies sur de la glace pendant la préparation des plaques de culture. Ensuite, centrifuger les cellules fraîchement recueillies à 200 x g pendant quatre minutes et redisperser délicatement le culot cellulaire dans un volume approprié d'EGM-2. Puis, ensemencer les cellules sur les plaques revêtues de gélatine.

Dans cette figure, les cellules vivantes ont été sélectionnées en excluant d'abord les cellules positives pour CD45, puis les cellules positives pour CD56. Les cellules endothéliales positives pour CD144 ont ensuite été éliminées de la fraction négative pour CD56. À partir de cette population finale, les péricytes positifs pour CD146 et négatifs pour CD34, ainsi que les cellules adventitielles négatives pour CD146 et positives pour CD34, ont été sélectionnés puis collectés.

Les deux cultures de péricytes myocardiques et de cellules adventitielles purifiées par tri cellulaire assisté par fluorescence présentent une morphologie allant de fusiforme à stellaire. Une fois maîtrisée, cette technique prendra environ cinq heures si elle est réalisée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que les échantillons les plus frais fourniront le meilleur rendement en cellules viables.

Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la cardiomyoplastie cellulaire, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, comme l'aptitude de ces cellules au traitement des maladies cardiaques ischémiques.