Développement d'un système d'insertion Co-culture de deux types cellulaires en l'absence de Cell-Cell Contactez

L'objectif général de cette procédure est de créer un système de co-culture cellulaire de deux types cellulaires à l'aide d'inserts munis d'une membrane perméable, permettant ainsi la diffusion de facteurs solubles sécrétés. Ceci est réalisé grâce à une série d'étapes qui placent précisément des inserts contenant un type cellulaire dans une plaque de culture tissulaire multipuits contenant un second type cellulaire. Nous commençons par semer le type cellulaire numéro un dans les inserts, et le type cellulaire numéro deux dans une plaque de culture tissulaire multipuits.

La deuxième étape consiste à transférer les inserts dans les puits de la plaque contenant le type cellulaire numéro deux. Cela permet finalement de récolter les deux types cellulaires ainsi que leurs surnageants respectifs. Il est donc possible d'évaluer l'effet des facteurs solubles sécrétés sur le type cellulaire d'intérêt.

Dans les organismes multicellulaires, les facteurs solubles sécrétés provoquent des réponses chez différents types cellulaires en raison de la signalisation paracrine. Ainsi, la valeur d'un système de co-culture avec insert réside dans sa capacité à offrir une méthode originale pour évaluer les modifications des paramètres cellulaires induites par des facteurs solubles sécrétés, en l'absence de contact cellule-cellule. Les systèmes de co-culture avec insert présentent plusieurs avantages par rapport à d'autres techniques de co-culture, tels que : un signalisation directionnelle ; deux préservation de la polarité cellulaire ; et trois détection spécifique à la population des modifications cellulaires.

Un protocole spécifique permettant de mesurer les effets toxiques des cytokines sécrétées par les microglies N9 activées par le lipopolysaccharide sur les cellules neuronales PC12 sera détaillé ci-après, offrant ainsi une compréhension concrète de la méthode de co-culture par insertion. Commencez par retirer l'emballage de la plaque de culture tissulaire 24 puits et des inserts en politétrafluoroéthylène porique de 0,4 micron. Ensuite, placez les inserts dans les puits vides de la plaque de culture tissulaire en saisissant le bord supérieur de l'insert à l'aide de pinces stériles.

Ensuite, remplir les inserts avec le milieu N9 habituel jusqu'à ce que la membrane soit entièrement recouverte. Incuber les inserts pendant au moins une heure, ou toute la nuit, afin d'améliorer la capacité des cellules à s'attacher. Une fois les inserts prêts, diviser les microglies N9 à une confluence de 80 à 90 % à l'aide du milieu N9 habituel pour obtenir une suspension cellulaire qui sera utilisée pour ensemencer les inserts.

Ensuite, retirez le milieu de culture des inserts en prenant soin de ne pas perforer la membrane avec la pointe de la micropipette. Puis, semez chaque insert à raison de 60 000 cellules par centimètre carré avec 50 microlitres de la suspension cellulaire, ou selon le protocole du fabricant de l'insert. Lors de la distribution de la suspension cellulaire, veillez à ce qu'elle reste homogène en retournant occasionnellement le tube.

Lorsque tous les inserts ont été ensemencés, agiter doucement la plaque d'avant en arrière, puis de gauche à droite, afin de répartir les cellules uniformément. Éviter d'effectuer des mouvements circulaires, car cela provoquerait l'accumulation des cellules au centre de l'insert. Incuber ensuite la plaque contenant les inserts pendant 24 heures avant de procéder à l'activation des microglies N9.

Commencez par peser 10 milligrammes de lipopolysaccharide et conservez-le dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre pour une utilisation ultérieure. Étant donné que le lipopolysaccharide est un endotoxine pro-inflammatoire puissante et qu'il nécessite des précautions particulières en matière de sécurité, il est fortement recommandé de porter des lunettes, des gants et un respirateur anti-particules. Ensuite, préparez une série de dilutions consécutives de lipopolysaccharide à l'aide du milieu de traitement N9 tiède afin d'obtenir des solutions de travail à quatre, deux et un microgramme par millilitre.

Enfin, retirez la moitié du milieu de culture des inserts, en prenant soin de ne pas perturber les cellules. Ensuite, ajoutez délicatement 25 microlitres des solutions working de lipopolysaccharide aux inserts afin d'obtenir des dilutions finales de 2, 1 ou 0,5 microgramme par millilitre. Incubez la plaque pendant encore 24 heures avant de procéder aux expériences de co-culture.

Cette étape nécessite des cellules PC12 ensemencées à raison de 30 000 cellules par centimètre carré, des interneurones différenciés et des microglies N9 activées avec du lipopolysaccharide pendant 24 heures, comme décrit dans la section précédente. Commencez par retirer délicatement tout le milieu des inserts, puis remplacez-le par 50 microlitres de milieu de traitement N9 frais et préchauffé. Cette étape est nécessaire pour éliminer toute trace de lipopolysaccharide, ne laissant que les microglies N9 activées.

Veillez à ce que les inserts soient mobiles dans les puits de la plaque de culture cellulaire et puissent bouger si la pointe appuie trop fort contre la paroi. Cette étape doit être réalisée un insert à la fois afin d'éviter que les cellules ne s'assèchent en raison d'un contact prolongé avec l'air. Ensuite, retirez complètement le milieu des cellules neuronales PC12 et remplacez-le par 0,6 millilitre de milieu de traitement PC12 frais et préchauffé.

Faites cela un par un afin de vous assurer que les cellules ne s'assèchent pas. À l’aide de pinces, saisissez le bord supérieur d’un insert et placez-le délicatement dans le puits contenant les cellules neuronales PC12. Une fois tous les inserts transférés, vérifiez la présence de bulles d’air sous les membranes des inserts.

Les bulles d'air empêcheront tout échange à travers la membrane de l'insert et peuvent compromettre l'ensemble de l'expérience. Éliminez les bulles d'air en soulevant très délicatement l'insert du puits à l'aide de pinces, puis en le replaçant dans le milieu de culture cellulaire ; cette manipulation devrait éliminer la plupart des bulles. Toutefois, pour les bulles persistantes, essayez d'immerger doucement l'insert dans le milieu de culture cellulaire selon un angle.

Ne pas frapper ni agiter les inserts, car cela risque de provoquer la dissociation des cellules adhérentes. Ensuite, vérifier les volumes de milieu dans les inserts et les puits ; le liquide dans les deux compartiments doit se situer approximativement au même niveau. Une fois toutes les bulles d'air éliminées et les volumes de milieu adaptés, incuber la plaque.

Les cellules, le milieu de culture ou les deux peuvent ensuite être récoltés afin de mesurer les effets de la signalisation paracrine entre les microglies N9 et les cellules neuronales PC12. Des dosages immuno-enzymatiques ont été réalisés sur le milieu de culture du compartiment inférieur pour quantifier les cytokines pro-inflammatoires. Les résultats montrent que 24 heures après la période d'activation, les microglies N9 traitées avec deux microgrammes par millilitre de lipopolysaccharide sécrétaient significativement plus de cytokines pro-inflammatoires, telles que l'interleukine-6, le facteur de nécrose tumorale-alpha et l'interféron gamma, par rapport aux microglies non traitées.

En outre, les microglies N9 traitées avec un microgramme par millilitre de lipopolysaccharide ont sécrété nettement plus d'interféron gamma après 24 heures, tandis qu'il a fallu 48 heures pour observer une augmentation significative des niveaux d'interleukine-6 et du facteur de nécrose tumorale-alpha dans le milieu cellulaire. En revanche, la condition à 0,5 microgramme par millilitre n'a pas réussi à augmenter l'expression des cytokines dans les microglies N9 aux temps 24 et 48 heures après la période d'activation. De plus, les données à 24 heures dans le groupe à deux microgrammes par millilitre suggèrent qu'il y avait une microgliose, soit une augmentation de la population microgliale.

Cependant, ce n’est qu’après 48 heures que le nombre de cellules a été significativement augmenté. Enfin, afin d’évaluer les conséquences de l’activation microgliale menant à une sécrétion accrue de cytokines et à la microgliose, la cytotoxicité a été évaluée dans les cellules neuronales PC12 en co-culture. En mesurant les niveaux de lactate déshydrogénase extracellulaire, qui est libérée par les cellules endommagées, on a observé que les cellules neuronales PC12 présentaient une augmentation de la mort cellulaire à mesure que la concentration de lipopolysaccharide sur les cellules N9 augmentait.

Par conséquent, ces résultats montrent que les facteurs solubles sécrétés sont capables de traverser la membrane des inserts de co-culture et peuvent provoquer des dommages cytotoxiques aux cellules neuronales PC12 en l'absence de contact cellulaire. Bien qu'un seul scénario de co-culture par insert ait été présenté ici, il s'agit d'une technique très souple. Dans ce protocole, un type cellulaire a été prétraité avec la molécule responsable de la réduction de la sécrétion de facteurs solubles qui, après le transfert de l'insert dans le puits, affectent le comportement d'un second type cellulaire.

Cependant, il est possible d'incuber les deux types cellulaires ensemble dans un système de co-culture afin de détecter l'augmentation de la fragilité, ou au contraire de la résistance, d'une ou des deux populations cellulaires à un traitement ultérieur. Cette technique peut simplement utiliser deux populations cellulaires incubées ensemble sans traitement, afin d'évaluer la signalisation paracrine réciproque basale, par exemple. En plus d'être utile dans le domaine de la neuroinflammation, comme le montre ici, les systèmes de co-culture avec inserts peuvent être utilisés pour répondre à un large éventail de questions relatives à la régénération tumorale, à la neurolathyrisme, à la signalisation de l'apoptose, ou à tout autre sujet impliquant un volet de signalisation paracrine.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez désormais bien comprendre comment les systèmes de co-culture avec insert peuvent offrir un moyen simple d'évaluer les modifications induites par des facteurs solubles sécrétés. Nous espérons également vous avoir convaincu du fort potentiel de ces systèmes de co-culture avec insert dans l'étude de la signalisation paracrine multicellulaire en l'absence de contact cellule-cellule.