Name: Développement dun système dinsertion Co-culture de deux types cellulaires en labsence de Cell-Cell Contactez (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Découvrez un système de co-culture cellulaire utilisant des inserts à membrane perméable pour étudier les facteurs solubles sécrétés sans contact direct entre cellules. Cette méthode permet d'évaluer les effets paracrines sur différents types cellulaires.

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Ce travail a été financé par une subvention canadienne du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) à MGM. JR est un étudiant boursier CRSNG-Vanier.

NB: Chacune des étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire tel que requis pour la culture cellulaire de mammifère. En outre, les lignes directrices générales pour la culture optimale des cellules stériles appliquent, par exemple., En écartant des conseils chaque fois qu&#39;ils peuvent conduire à la contamination croisée, ce qui réduit la quantité de cellules de temps sont exposés à l&#39;air lors de l&#39; exécution des changements de médias entiers, correctement , mais en remuant doucement tout suspensions cellulaires pour assurer leur pipetage homogène, etc. de plus, les inserts sont une sorte de plasticware qui nécessitent un traitement spécial. Tout d&#39;abord, chaque fois que les inserts sont manipulés, évitez de toucher la membrane fragile, qui se déchire facilement et pourrait donc compromettre l&#39;expérience. En outre, il ne convient pas pour effectuer l&#39;aspiration du milieu de culture cellulaire, car il existe un risque de perforation de la membrane ou dissociant les cellules adhérentes. Ensuite, inserts pendre dans la plaque de culture tissulaire multipuits et, par conséquent, la prudence doit être employée lorsque moVing l&#39;plasticware ou lors du pipetage pour éviter dissociant des cellules adhérentes. En outre, quand on utilise des inserts avec de grandes tailles de pores, il est possible que le milieu de culture cellulaire suinte à travers la membrane et, par conséquent, il est important de contrôler fréquemment le niveau de liquide. Enfin, notez que le protocole suivant est conçu pour les cellules adhérentes et nécessite des modifications mineures afin d&#39;être adapté pour des cellules en suspension. 1. Lignes directrices générales pour la conduite insertion des expériences de co-culture <ol><li> Semis type de cellule n ° 1 à inserts <ol><li> Déballer les inserts de leur emballage. </li><li> Placer les inserts dans un multipuits plaque de culture de tissu vide de la bonne dimension. Pour ce faire, saisir le bord supérieur de l&#39;insert en utilisant des pinces. </li><li> Pour améliorer la fixation et la propagation des cellules adhérentes, conditionner les plaquettes avec un milieu de culture cellulaire avant l&#39;ensemencement. Pour ce faire, couvrir toute la surface de la membrane avec culture cellulaire medium à l&#39;aide d&#39;une micropipette. NOTE: Pour ce faire, pour autant inserts au besoin. </li><li> Replacer le couvercle sur la plaque et incuber pendant au moins 1 heure ou O / N dans les mêmes conditions (généralement 37 ° C, 5 à 10% de CO 2). </li><li> Lorsque les inserts sont conditionnés, retirer la totalité du milieu de culture cellulaire en utilisant une micropipette. Jeter le moyen utilisé. </li><li> Graine type cellulaire # 1 dans du milieu frais de culture cellulaire de la même manière que dans une plaque multipuits. Pour ce faire, tirer un volume approprié de la suspension cellulaire avec une micropipette et distribuer le liquide dans l&#39;insert. NOTE: Préparer autant inserts au besoin. </li><li> Après l&#39;ensemencement tous les inserts, secouez légèrement la plaque à gauche et à droite, puis en arrière afin de répartir les cellules uniformément. Évitez de faire des mouvements circulaires, car cela provoquerait des cellules d&#39;accumuler dans le centre des inserts. </li><li> Placer le couvercle sur la plaque et incuber comme indiqué par conformément aux exigences cellulaires (habituellement 37 ° C, 5-10% de CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Semis type de cellule n ° 2 dans des plaques de culture tissulaire multipuits <ol><li> Seed type de cellule # 2 dans un milieu de culture cellulaire frais conformément à la section 1. </li><li> Préparer autant de puits selon les besoins pour le nombre d&#39;insertions. Balancer la plaque comme dans l&#39;étape 1.1.7) pour faire en sorte que les cellules sont réparties de façon uniforme dans les puits. </li><li> Placer le couvercle sur la plaque et incuber dans les mêmes conditions (généralement 37 ° C, 5 à 10% de CO 2). </li></ol></li><li> moyen Rafraîchissant dans des inserts <ol><li> À l&#39;aide d&#39;une micropipette, retirer une partie ou la totalité du milieu de culture cellulaire, dans les inserts contenant du type de cellule n ° 1. Jeter le moyen utilisé. </li><li> Dessinez un volume approprié de milieu de culture de cellules fraîches. reposer doucement la pointe sur la paroi interne de l&#39;insert et passer lentement le milieu de culture cellulaire. </li><li> Placez le couvercle sur la plaque et incuber comme à l&#39;étape 1.1.4. </li></ol></li><li> moyen Rafraîchissant dans des plaques de culture tissulaire multipuits <ol><li> En utilisant un Micropipette, retirer une partie ou la totalité du milieu de culture cellulaire dans les puits contenant des cellules de type N ° 2. Jeter le moyen utilisé. </li><li> Dessinez un volume approprié de milieu de culture de cellules fraîches. Reste la pointe sur la paroi intérieure du puits et distribuer lentement le milieu de culture cellulaire. </li><li> Placer le couvercle sur la plaque et incuber selon les protocoles de culture de cellules préalablement établies. </li></ol></li><li> Transférer des inserts contenant le type de la cellule n ° 1 sur des plaques de culture tissulaire multipuits contenant du type de cellule # 2. REMARQUE: Effectuez cette étape lorsque les deux types de cellules ont atteint le stade de croissance approprié. <ol><li> Avant de transférer les inserts dans les puits, apporter des modifications moyennes nécessaires, comme décrit précédemment dans les étapes 1.3) et 1.4). NOTE: A ce stade, il est important de distribuer les volumes appropriés de médias dans les deux compartiments tel que spécifié par les instructions du fabricant d&#39;insertion. </li><li> En utilisant des pinces, saisir le bord supérieur d&#39;un insert contenant des cellules Type # 1 et placez-le doucement dans le puits approprié contenant un type de cellule 2 #. </li><li> Après le transfert de tous les inserts, vérifier la présence de bulles d&#39;air sous la membrane des inserts. NOTE: Les bulles d&#39;air empêchent tout échange à travers la membrane de l&#39;insert et peuvent mettre en péril l&#39;ensemble de l&#39;expérience. </li><li> Si des bulles d&#39;air sont présentes, soulever très doucement l&#39;insert des puits à l&#39;aide de pinces et de replonger dans le milieu de culture cellulaire. Les bulles vont disparaître. Si elles sont encore présentes, essayez doucement plongeant inserts retour dans le milieu de culture cellulaire à un angle. NOTE: Ne pas frapper ou remuer des inserts pour éviter dissociant des cellules adhérentes. </li><li> Après avoir retiré toutes les bulles d&#39;air et de vérifier que les volumes des médias dans les deux compartiments, placez le couvercle sur la plaque et incuber. </li></ol></li><li> médias rafraîchissantes dans un système de co-culture NOTE: Bien que la membrane permet facilement les échanges de médias entre l&#39;insert et le bien, rafraîchissant le moyen se fait enles deux compartiments puisque le temps nécessaire pour atteindre l&#39;équilibre dans les compartiments supérieur et inférieur par diffusion seul peut être assez long. <ol><li> moyen Rafraîchissant dans des inserts contenant type de cellule # 1 se fait de la même manière que dans l&#39;étape 1.3). </li><li> Pour rafraîchir dans les puits contenant type de cellule # 2 moyen, faites glisser doucement l&#39;insert sur le côté pour créer un espace suffisamment large pour accueillir une pointe de pipette. Actualiser le moyen comme à l&#39;étape 1.4). </li><li> Vérifier la présence de bulles d&#39;air et vérifier les volumes que par étapes 1.5.3) par 1.5.5). </li></ol></li></ol> Exemple 2: mesurer les effets des cytokines sécrétées par les cellules microgliales activées par le LPS N9 sur les cellules PC12 neuronales REMARQUE: Les étapes suivantes sont conçues pour flacon spécifique, bien et tailles plat. Toutefois, le protocole peut être personnalisé pour toutes les dimensions de plasticware. Pour les médias et la composition voir tableau Matériaux. <ol><li> Ensemencement et la différenciation des cellules PC12 en multides plaques de culture tissulaire <ol><li> Milieu de culture cellulaire PC12 routine chaud, PC12 milieu de différenciation et de la trypsine-EDTA dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Utiliser les cellules PC12 à 60-80% de confluence d&#39;un 2 flacon de 75 cm. </li><li> 15 mm avec une pipette Pasteur, effectuer l&#39;aspiration de la totalité du milieu de culture cellulaire dans le flacon. </li><li> Rincer délicatement la monocouche cellulaire avec 5 ml de tampon phosphate salin stérile et éliminer le liquide avec une pipette Pasteur. Veillez à ne pas dissocier les cellules à cette étape. </li><li> Recouvrir la monocouche de cellules avec 3 ml de trypsine-EDTA et laisser incuber pendant 2-3 minutes à 37 ° C. </li><li> Veiller à ce que toutes les cellules sont décollées sous un microscope. Si très peu de cellules sont flottantes, incuber pendant une période plus longue pour un maximum de 5 min. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules PC12 de routine afin d&#39;inactiver la trypsine-EDTA. </li><li> Avec une pipette de 10 ml, triturer doucement tout en veillant à ce que la plupart des cellules sont dissociées du fond of flacon. Évitez de créer des bulles d&#39;air dans la suspension cellulaire. </li><li> Avec la même pipette de 10 ml, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 50 ml. </li><li> Centrifuger pendant 1 min à 3.200 xg </li><li> Jeter le surnageant avec une pipette Pasteur tout en prenant soin de ne pas perturber le culot. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules PC12 routine avec une pipette de 10 ml. NOTE: Ce volume peut être ajusté si le culot est anormalement petite ou grande. </li><li> Triturer avec la même pipette de 10 ml pour homogénéiser la pastille. Les cellules PC12 agglutiner souvent ensemble pour au moins 20 pipetage et downare nécessaire. NOTE: Bien que trituration vigoureuse est nécessaire, éviter de créer des bulles d&#39;air dans la suspension cellulaire. </li><li> Dans un tube de 1,5 ml, préparer une dilution appropriée de la suspension cellulaire en bleu trypan. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre selon des protocoles établis précédemment 74. </li><li> Dans un tube de 50 ml séparée, séparer la suspension cellulaireavec un milieu de différenciation PC12 pour obtenir une suspension cellulaire diluée appropriée pour l&#39; ensemencement des puits d&#39;une plaque à 24 puits (30 000 ¢ / cm2, 0,6 ml par puits selon le protocole du fabricant). NOTE: La plaque de 24 puits doit être préalablement revêtu avec du collagène tel que spécifié par des protocoles déjà établis 75. </li><li> Distribuer 0,6 ml de la suspension cellulaire par puits à l&#39;aide d&#39;une micropipette. </li><li> Lorsque tous les puits sont ensemencées, la roche la plaque comme à l&#39;étape 1.1.7). </li><li> Pour permettre une bonne différenciation des cellules PC12, incuber les plaques à 24 puits pendant 7-9 jours à 37 ° C en atmosphère humide 5% de CO2 dans un milieu de différenciation CP12 15,16 avant d&#39; effectuer des expériences de co-culture. </li><li> Effectuer des changements de milieu tous les deux jours en enlevant la moitié du liquide et en le remplaçant par un volume égal de milieu de différenciation PC12 frais. </li></ol></li><li> Ensemencement microglie N9 dans les inserts et le traitement avec le LPS <ol><li> Un jour avant d&#39;effectuer les expériences de co-culture, pré-traiter PTFE 0,4 inserts um-pores avec un milieu de culture cellulaire de routine N9 pour optimiser l&#39;adhérence des cellules, en suivant les étapes 1.1.1) par le biais de 1.1.4) </li><li> N9 milieu chaud routine de culture cellulaire et de la trypsine-EDTA dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Pendant ce temps, peser environ 10 mg de LPS dans un tube de 1,5 ml pour une utilisation ultérieure. NOTE: Depuis LPS est une endotoxine pro-inflammatoire puissant et exige des précautions particulières de sécurité, des lunettes, des gants et un respirateur de particules sont fortement recommandés. </li><li> Utiliser des cellules N9 à 80-90% de confluence d&#39;un 2 flacon de 75 cm. </li><li> Suivez les étapes 2.1.3) à 2.1.14). Toujours utiliser la routine du milieu de culture cellulaire N9 à la place du milieu de culture des cellules PC12 de routine. A noter également que la microglie N9 n&#39;agglutinent pas ensemble autant que les cellules PC12 font, donc moins pipetage de haut en bas peut être nécessaire à l&#39;étape 2.1.13). </li><li> Dans un tube de 50 ml séparée, séparer la suspension cellulaire avec un milieu de culture cellulaire à N9 obtenir une suspension cellulaire diluée appropriée pour l&#39; ensemencement des inserts destinés à contenir dans des plaques à 24 puits (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml par insert selon le protocole du fabricant, pour la membrane de surface voir les informations du fabricant). NOTE: Ces inserts sont déjà revêtus de collagène par le fabricant et sont optimisés pour l&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Distribuer 0,05 ml de la suspension cellulaire par insertion à l&#39;aide d&#39;une micropipette. </li><li> Lorsque tous les inserts sont ensemencées, basculez la plaque comme à l&#39;étape 1.1.7). </li><li> Effectuer des dilutions en série de LPS en utilisant un milieu de traitement N9 pour obtenir 4 pg / ml, 2 pg / ml et / ml de solutions de travail 1 ug. </li><li> Pipette 0,05 ml de la / ml solution de travail 4 pg dans l&#39;un de l&#39;ensemble des inserts afin de produire une dilution finale de 2 pg / ml. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.2.10) pour les deux autres solutions de travail dans différents inserts ensembles, ce qui donne des dilutions finales de 1 pg / ml et 0,5 pg / ml, respectivement. </li><li> Danscubate les plaques contenant les inserts de 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% d&#39; humidité pour permettre l&#39; activation des microglies N9 avec du LPS avant d&#39; effectuer les expériences de co-culture. </li></ol></li><li> Co-culture de cellules PC12 neuronales avec microglie N9 <ol><li> 7-9 jours de différenciation des cellules PC12, activer les microglies N9 après 24 heures d&#39;incubation avec du LPS par un milieu de traitement chaud et N9 milieu de traitement PC12 dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Effectuer un changement de milieu total des microglies N9 comme dans l&#39;étape 1.3), le remplacement de la totalité du support utilisé par 0,1 ml de milieu de traitement N9. Pour ce faire, pour chaque insert.This est nécessaire pour éliminer toute trace de LPS, laissant microglie N9 seulement activés dans les inserts. </li><li> Effectuer un changement de milieu total des cellules PC12 neuronales comme dans l&#39;étape 1.4). Transférer les inserts dans les plaques à 24 puits comme dans l&#39; étape 1.5) .Incubate la N9-PC12 co-cultures pendant 24 heures ou 48 heures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% humide. </li><li> après 24h ou 48 h, récolte le surnageant et / ou les cellules pour la cytotoxicité, dosage immuno-enzymatique (ELISA), Western blot, ou d&#39;autres essais. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;étape la plus critique de toute expérience du système insert co-culture réside effectivement dans le choix de l&#39;insert approprié à utiliser. La taille des pores et le matériau de la membrane doivent être prises en compte en profondeur, sans oublier de considérer le type de cellules qui seront ensemencées et le but de l&#39;expérience. Par exemple, des dosages chimiotactiques peuvent utiliser le même type de membrane que les co-cultures cellulaires pour analyser les modulations du comportement cellulaire induit...

L&#39;étude des tissus, des organes ou des systèmes in vitro est un essai de simplifier les relations complexes qui existent entre les sous - types cellulaires différents qui comprennent des organismes multicellulaires. En effet, des études in vitro permettent d&#39;acquérir une compréhension détaillée des populations de cellules isolées. Il y a deux principaux avantages de la conduite des expériences in vitro: 1) réduit les interactions cellulaires, et 2) la capacité de manipuler facilement l&#39;environnement cellulaire. Par conséquent, ces deux avantages ont permis aux scientifiques de prédire le comportement des types cellulaires spécifiques in vivo, conduisant à la capacité de réguler les résultats des influences extrinsèques dans des organismes entiers. En ce sens, la culture in vitro de cellules dans fonctionne souvent comme un pont reliant les sciences fondamentales et appliquées vie. Néanmoins, il y a aussi plusieurs inconvénients du travail in vitro, le plus important étant qu&#39;une certaine réserve peut demeurer dans le physiologiqueal pertinence des phénotypes observés. En effet, quand un seul type de cellule est cultivée dans un récipient, la culture perd, à des degrés divers, ses connexions cellule-cellule avec d&#39;autres types de cellules, sa contribution à l&#39;environnement humorale du tissu et de l&#39;organisme d&#39;origine, et les ancres au sein le tissu qui lui a permis de faire respecter une structure tridimensionnelle particulière, parfois crucial pour la fonction cellulaire. La question des relations cellule-cellule a été adressée par le développement des techniques de culture mixtes. Dans ce procédé, deux ou plusieurs populations de cellules sont cultivées dans le même récipient de culture. Cependant, ces cultures mixtes portent des inconvénients importants. D&#39;une part, certains sous-types de cellules n&#39;interagissent pas physiquement avec l&#39;autre dans le tissu d&#39;origine et reposent uniquement sur les communications paracrines soutenues par des facteurs solubles sécrétés et récepteurs à proximité. Tel est le cas pour plusieurs processus inflammatoires qui dépendent de la signalisation des cytokines proximale. Dans mixte cULTURES, les interactions physiques sont inévitables et il est impossible d&#39;étudier les communications paracrines en l&#39;absence de contacts cellule-cellule qui peut donner des résultats modifiés. D&#39;autre part, la réalisation des interprétations spécifiques de cellules à partir d&#39;une population mixte devient impossible sans l&#39;utilisation de techniques de séparation difficiles qui pourraient affecter de manière significative les résultats. Pour résoudre ces questions importantes, l&#39;utilisation des médias conditionnés a été développé comme une technique permettant des cultures compartimentées et l&#39;étude de la signalisation paracrine. Cette méthode nécessite le transfert du surnageant d&#39;un type de cellule, le milieu conditionné ainsi nommé, aux puits contenant une autre population de cellules. Mais un inconvénient important est que les molécules de courte durée ne survivent pas assez longtemps dans le milieu conditionné à être transféré dans les puits de la seconde population de cellules. Même les molécules longue durée de vie sera grandement dilué au fil du temps en raison de la diffusion. En outre, les deux cellulespopulations ne participent à la communication paracrine unidirectionnel plutôt que dans une communication bidirectionnelle active. Cela conduit à l&#39;absence de signaux de rétroaction qui est essentielle pour recréer les relations exactes pluricellulaires tels qu&#39;ils existent in vivo. En conséquence , et entraînée par la nécessité de mieux simuler l&#39;original dans des conditions in vivo dans l&#39;environnement cellulaire in vitro, de nombreux progrès dans les techniques de culture cellulaire ont été réalisées au cours des années. L&#39; un des progrès les plus significatifs a été l&#39;utilisation de supports perméables avec des membranes microporeuses pour compartimenter des cultures de cellules, utilisées pour la première fois par Grobstein en 1953 1. De tels supports perméables ont été adaptés au fil des ans pour accueillir de nombreux types de cellules et à utiliser dans plusieurs applications différentes. Aujourd&#39;hui, ces supports existent comme des inserts creux qui sont conçus pour reposer dans les puits d&#39;une plaque de culture tissulaire multipuits ou circuplats lar. Dans un système de co-culture, l&#39;insert contient un type de cellule tandis que le puits ou l&#39;autre plat contient population cellulaire, ce qui permet d&#39;étudier la contribution de deux populations différentes de cellules de leur environnement humorale (figure 1). En conséquence, la polarité cellulaire (basolatérale ou apicale contre la sécrétion réception du signal) est conservé, ce qui confère ainsi des systèmes de co-culture insérer un avantage important par rapport aux cultures mixtes et des techniques milieu conditionné. Plusieurs types de matériaux de membrane sont disponibles, les plus courantes étant du polyester (PET), le polycarbonate (PC) ou du collagène revêtu de polytétrafluoroéthylène (PTFE), et ils existent en différentes tailles de pores allant de 0,4 um à 12,0 um. Ces variétés de matériaux et de tailles des pores offrent un spectre d&#39;inserts exerçant des caractéristiques variables pertinentes aux propriétés optiques, l&#39;épaisseur de la membrane et l&#39;adhérence des cellules qui les rendent pratiques à différents niveaux pour les utilisations suivantes sans s&#39;y limiter: -étudierla différenciation cellulaire, le développement embryonnaire, la métastase tumorale et la réparation des plaies par des dosages chimiotactiques à travers des membranes perméables; -evaluating la pénétration du médicament en évaluant leur transport à travers des monocouches épithéliales ou endothéliales cultivées sur des supports perméables, et; cellules co-cultures -Exécution pour analyser les modulations du comportement cellulaire induite par des facteurs solubles sécrétés en l&#39;absence de contact cellule-cellule. Le but de cet article est de décrire les lignes directrices méthodologiques générales pour remplir la troisième fonction indiquée ci-dessus, qui est d&#39;évaluer les changements cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en l&#39;absence de contact cellule-cellule en utilisant un système de co-culture insert. Plusieurs domaines de recherche différents utilisent des systèmes insert de co-culture, afin de répondre à des questions pertinentes à l&#39;effet de facteurs solubles sécrétés sur les populations de cellules. En effet, la signalisation paracrine qui module le comportement cellulaire à différents niveaux est pertinent dans tous les tissuset les systèmes, ce qui rend les systèmes de co-culture insertion indispensable pour assurer des progrès dans ces domaines. A l&#39;inverse, l&#39;utilisation d&#39;inserts peut confirmer que la transduction du signal se fait par le contact direct de cellule à cellule, et non par des facteurs sécrétés. L&#39; une des utilisations les plus importantes des inserts est dans les études de l&#39; inflammation 2-14 où l&#39;effet de cytokines sécrétées est évaluée à différents acteurs cellulaires de l&#39; immunité. En particulier, l&#39;étude de l&#39; inflammation dans le système nerveux central (SNC) a grandement profité des études insert de co-culture, qui ont permis de mieux définir les rôles paracrines distincts de neurones et les microglies dans neuroinflammation 15-21 conduite. Ces systèmes ont été conçus aussi pour étudier le potentiel anti-inflammatoire des molécules repose sur leur capacité à réduire ou à inhiber la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires 22-26. La recherche portant sur ​​le cancer 27-31, en ​​particulier les mécanismes sous - jacents de l&#39; angiogenèse 32-34 et inflammatisur 35-42 dans la tumorigenèse, bénéficie également de systèmes insert de co-culture. En outre, des facteurs solubles sont de première importance dans les processus qui conduisent la différenciation et plusieurs études ont utilisé des inserts pour répondre aux questions dans ce domaine particulier 43-50. Dans le SNC, car le tissu neural possède un potentiel de renouvellement très limité, l&#39;étude de la neuroprotection et neurotrophism est fondamental et a été largement assurée par l&#39;utilisation de cellules souches dans des systèmes de co-culture 51-56. En outre, les inserts sont également utilisés dans les domaines aussi variés que la néphrologie 57,58, les interactions endothéliales et l&#39; angiogénèse 59-62, 63-65 signalisation de l&#39; apoptose, l&#39; inflammation dans l&#39; obésité et le syndrome métabolique 22,23,66-67, l&#39; oreille interne de protection des cellules ciliées 68,69, et même dans la virulence des champignons 70,71 et parasitologie 72,73. Cet article propose des lignes directrices méthodologiques générales afin de mettre en place un expériment en vue d&#39;évaluer les modifications cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en utilisant un système de co-culture insert. En particulier, nous allons nous concentrer notre attention sur cellules nerveuses co-cultures et leurs utilisations dans l&#39;étude de processus de neuroinflammatoire. Compte tenu de la très vaste éventail d&#39;expériences qui insère permettre au pilote, il est insupportable pour couvrir tous les aspects de cette technique de culture cellulaire. A titre d&#39;exemple, un protocole spécifique pour mesurer les effets des cytokines sécrétées par le lipopolysaccharide (LPS) -activated microglie N9 sur les cellules PC12 neuronales seront détaillées, offrant une compréhension concrète de la méthodologie insert co-culture.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 moyen</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Mélange moyen/nutritif F-12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation, doit être complété par 0,365 g/L de L-glutamine</td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Facteur de croissance nerveuse-7S de la glande sous-maxillaire murine</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstituer la poudre lyophilisée dans une solution saline tamponnée ou un milieu de culture tissulaire contenant 0,1&ndash ; 1,0 % d’albumine sérique bovine ou 1-10 % de</td></tr> sérum <tr><td>Trypsine-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides de&nbsp ; Escherichia coli&nbsp ; 055 :B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Toxic Inserts de culture cellulaire à utiliser avec des plaques à 24 puits</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &mu ; m pores</td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Enrober de collagène avant utilisation</td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td> de culture cellulaire Routine PC12 <td>Milieu de culture cellulaire Routine N9</td></tr>-<tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 85 % RPMI moyen</td><td></td><td></td><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 90 % DMEM-F12 moyen</td></tr><tr><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 10 % de sérum</td><td></td><td></td> de cheval inactivé par la chaleur<td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 10 % de sérum de cheval inactivé par la chaleur</td></tr><tr><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Sérum</td><td></td><td></td><td></td>fœtal bovin inactivé à 5 %</tr><tr><td>PC12 milieu</td><td></td><td></td> de <td>différenciation Milieu de traitement N9</td></tr> <tr><td>- &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 99 % RPMI moyen</td><td></td><td></td><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 99 % DMEM-F12 moyen</td></tr><tr><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Sérum fœtal bovin inactivé à 1 % par la chaleur</td><td></td><td></td><td> &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Sérum fœtal bovin inactivé à 1 % par la chaleur</td></tr><tr><td> &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 50 ng/mL de facteur</td><td></td><td></td><td></td>de croissance nerveuse</tr><tr><td>PC12 milieu</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de traitement &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 99 % RPMI moyen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Sérum</td><td></td><td></td><td></td> fœtal bovin inactivé à 1 %</tr></tbody></table>

développement d&#39;un système d&#39;insertion co-culture de deux types cellulaires en l&#39;absence de cell-cell contactez

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Le rôle des facteurs solubles sécrétés dans la modification des réponses cellulaires est un thème récurrent dans l’étude de tous les tissus et systèmes. Dans le but de rendre simples les relations très complexes entre les différents sous-types cellulaires qui composent les organismes multicellulaires, des techniques in vitro ont été développées pour aider les chercheurs à acquérir une compréhension détaillée des populations de cellules uniques. L’une de ces techniques utilise des inserts avec une membrane perméable permettant aux facteurs solubles sécrétés de se diffuser. Ainsi, une population de cellules cultivées dans des inserts peut être co-cultivée dans un puits ou une boîte contenant un type de cellule différent pour évaluer les changements cellulaires suite à la signalisation paracrine en l’absence de contact cellule-cellule. De tels systèmes de co-culture d’inserts offrent divers avantages par rapport aux autres techniques de co-culture, à savoir la signalisation bidirectionnelle, la polarité cellulaire conservée et la détection des changements cellulaires spécifiques à la population. En plus d’être utilisés dans le domaine de l’inflammation, du cancer, de l’angiogenèse et de la différenciation, ces systèmes de co-culture sont d’une importance primordiale dans l’étude des relations complexes qui existent entre les différents sous-types cellulaires présents dans le système nerveux central, en particulier dans le contexte de la neuroinflammation. Cet article propose des orientations méthodologiques générales afin de mettre en place une expérience permettant d’évaluer les changements cellulaires médiés par des facteurs solubles sécrétés à l’aide d’un système de co-culture d’inserts. De plus, un protocole spécifique pour mesurer les effets neuro-inflammatoires des cytokines sécrétées par la microglie N9 activée par les lipopolysaccharides sur les cellules neuronales PC12 sera détaillé, offrant une compréhension concrète de la méthodologie de co-culture d’inserts.

L&#39;utilisation de systèmes de co-culture insert est particulièrement pertinente dans l&#39;étude des processus neuro-inflammatoires qui mettent en valeur les relations paracrines entre les différents acteurs cellulaires du système nerveux central. Immunité dans le SNC est réalisée principalement par les cellules résidentes appelées microglies qui surveillent leur environnement dans leur état ​​de repos ramifiées (Figure 2A) et sont capables de perturbations de détecti...

Dans les organismes multicellulaires, les facteurs solubles sécrétés provoquent des réponses de différents types de cellules à la suite de la signalisation paracrine. Les systèmes de co-culture d’inserts offrent un moyen simple d’évaluer les changements médiés par les facteurs solubles sécrétés en l’absence de contact cellule-cellule.

Développement d&#39;un système d&#39;insertion Co-culture de deux types cellulaires en l&#39;absence de Cell-Cell Contactez

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

L'objectif général de cette procédure est de créer un système de co-culture cellulaire de deux types cellulaires à l'aide d'inserts munis d'une membrane perméable, permettant ainsi la diffusion de facteurs solubles sécrétés. Ceci est réalisé grâce à une série d'étapes qui placent précisément des inserts contenant un type cellulaire dans une plaque de culture tissulaire multipuits contenant un second type cellulaire. Nous commençons par semer le type cellulaire numéro un dans les inserts, et le type cellulaire numéro deux dans une plaque de culture tissulaire multipuits.La deuxième étape consiste à transférer les inserts dans les puits de la plaque contenant le type cellulaire numéro deux. Cela permet finalement de récolter les deux types cellulaires ainsi que leurs surnageants respectifs. Il est donc possible d'évaluer l'effet des facteurs solubles sécrétés sur le type cellulaire d'intérêt.Dans les organismes multicellulaires, les facteurs solubles sécrétés provoquent des réponses chez différents types cellulaires en raison de la signalisation paracrine. Ainsi, la valeur d'un système de co-culture avec insert réside dans sa capacité à offrir une méthode originale pour évaluer les modifications des paramètres cellulaires induites par des facteurs solubles sécrétés, en l'absence de contact cellule-cellule. Les systèmes de co-culture avec insert présentent plusieurs avantages par rapport à d'autres techniques de co-culture, tels que : un signalisation directionnelle ; deux préservation de la polarité cellulaire ; et trois détection spécifique à la population des modifications cellulaires.Un protocole spécifique permettant de mesurer les effets toxiques des cytokines sécrétées par les microglies N9 activées par le lipopolysaccharide sur les cellules neuronales PC12 sera détaillé ci-après, offrant ainsi une compréhension concrète de la méthode de co-culture par insertion. Commencez par retirer l'emballage de la plaque de culture tissulaire 24 puits et des inserts en politétrafluoroéthylène porique de 0,4 micron. Ensuite, placez les inserts dans les puits vides de la plaque de culture tissulaire en saisissant le bord supérieur de l'insert à l'aide de pinces stériles.Ensuite, remplir les inserts avec le milieu N9 habituel jusqu'à ce que la membrane soit entièrement recouverte. Incuber les inserts pendant au moins une heure, ou toute la nuit, afin d'améliorer la capacité des cellules à s'attacher. Une fois les inserts prêts, diviser les microglies N9 à une confluence de 80 à 90 % à l'aide du milieu N9 habituel pour obtenir une suspension cellulaire qui sera utilisée pour ensemencer les inserts.Ensuite, retirez le milieu de culture des inserts en prenant soin de ne pas perforer la membrane avec la pointe de la micropipette. Puis, semez chaque insert à raison de 60 000 cellules par centimètre carré avec 50 microlitres de la suspension cellulaire, ou selon le protocole du fabricant de l'insert. Lors de la distribution de la suspension cellulaire, veillez à ce qu'elle reste homogène en retournant occasionnellement le tube.Lorsque tous les inserts ont été ensemencés, agiter doucement la plaque d'avant en arrière, puis de gauche à droite, afin de répartir les cellules uniformément. Éviter d'effectuer des mouvements circulaires, car cela provoquerait l'accumulation des cellules au centre de l'insert. Incuber ensuite la plaque contenant les inserts pendant 24 heures avant de procéder à l'activation des microglies N9.Commencez par peser 10 milligrammes de lipopolysaccharide et conservez-le dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre pour une utilisation ultérieure. Étant donné que le lipopolysaccharide est un endotoxine pro-inflammatoire puissante et qu'il nécessite des précautions particulières en matière de sécurité, il est fortement recommandé de porter des lunettes, des gants et un respirateur anti-particules. Ensuite, préparez une série de dilutions consécutives de lipopolysaccharide à l'aide du milieu de traitement N9 tiède afin d'obtenir des solutions de travail à quatre, deux et un microgramme par millilitre.Enfin, retirez la moitié du milieu de culture des inserts, en prenant soin de ne pas perturber les cellules. Ensuite, ajoutez délicatement 25 microlitres des solutions working de lipopolysaccharide aux inserts afin d'obtenir des dilutions finales de 2, 1 ou 0,5 microgramme par millilitre. Incubez la plaque pendant encore 24 heures avant de procéder aux expériences de co-culture.Cette étape nécessite des cellules PC12 ensemencées à raison de 30 000 cellules par centimètre carré, des interneurones différenciés et des microglies N9 activées avec du lipopolysaccharide pendant 24 heures, comme décrit dans la section précédente. Commencez par retirer délicatement tout le milieu des inserts, puis remplacez-le par 50 microlitres de milieu de traitement N9 frais et préchauffé. Cette étape est nécessaire pour éliminer toute trace de lipopolysaccharide, ne laissant que les microglies N9 activées.Veillez à ce que les inserts soient mobiles dans les puits de la plaque de culture cellulaire et puissent bouger si la pointe appuie trop fort contre la paroi. Cette étape doit être réalisée un insert à la fois afin d'éviter que les cellules ne s'assèchent en raison d'un contact prolongé avec l'air. Ensuite, retirez complètement le milieu des cellules neuronales PC12 et remplacez-le par 0,6 millilitre de milieu de traitement PC12 frais et préchauffé.Faites cela un par un afin de vous assurer que les cellules ne s'assèchent pas. À l’aide de pinces, saisissez le bord supérieur d’un insert et placez-le délicatement dans le puits contenant les cellules neuronales PC12. Une fois tous les inserts transférés, vérifiez la présence de bulles d’air sous les membranes des inserts.Les bulles d'air empêcheront tout échange à travers la membrane de l'insert et peuvent compromettre l'ensemble de l'expérience. Éliminez les bulles d'air en soulevant très délicatement l'insert du puits à l'aide de pinces, puis en le replaçant dans le milieu de culture cellulaire ; cette manipulation devrait éliminer la plupart des bulles. Toutefois, pour les bulles persistantes, essayez d'immerger doucement l'insert dans le milieu de culture cellulaire selon un angle.Ne pas frapper ni agiter les inserts, car cela risque de provoquer la dissociation des cellules adhérentes. Ensuite, vérifier les volumes de milieu dans les inserts et les puits ; le liquide dans les deux compartiments doit se situer approximativement au même niveau. Une fois toutes les bulles d'air éliminées et les volumes de milieu adaptés, incuber la plaque.Les cellules, le milieu de culture ou les deux peuvent ensuite être récoltés afin de mesurer les effets de la signalisation paracrine entre les microglies N9 et les cellules neuronales PC12. Des dosages immuno-enzymatiques ont été réalisés sur le milieu de culture du compartiment inférieur pour quantifier les cytokines pro-inflammatoires. Les résultats montrent que 24 heures après la période d'activation, les microglies N9 traitées avec deux microgrammes par millilitre de lipopolysaccharide sécrétaient significativement plus de cytokines pro-inflammatoires, telles que l'interleukine-6, le facteur de nécrose tumorale-alpha et l'interféron gamma, par rapport aux microglies non traitées.En outre, les microglies N9 traitées avec un microgramme par millilitre de lipopolysaccharide ont sécrété nettement plus d'interféron gamma après 24 heures, tandis qu'il a fallu 48 heures pour observer une augmentation significative des niveaux d'interleukine-6 et du facteur de nécrose tumorale-alpha dans le milieu cellulaire. En revanche, la condition à 0,5 microgramme par millilitre n'a pas réussi à augmenter l'expression des cytokines dans les microglies N9 aux temps 24 et 48 heures après la période d'activation. De plus, les données à 24 heures dans le groupe à deux microgrammes par millilitre suggèrent qu'il y avait une microgliose, soit une augmentation de la population microgliale.Cependant, ce n’est qu’après 48 heures que le nombre de cellules a été significativement augmenté. Enfin, afin d’évaluer les conséquences de l’activation microgliale menant à une sécrétion accrue de cytokines et à la microgliose, la cytotoxicité a été évaluée dans les cellules neuronales PC12 en co-culture. En mesurant les niveaux de lactate déshydrogénase extracellulaire, qui est libérée par les cellules endommagées, on a observé que les cellules neuronales PC12 présentaient une augmentation de la mort cellulaire à mesure que la concentration de lipopolysaccharide sur les cellules N9 augmentait.Par conséquent, ces résultats montrent que les facteurs solubles sécrétés sont capables de traverser la membrane des inserts de co-culture et peuvent provoquer des dommages cytotoxiques aux cellules neuronales PC12 en l'absence de contact cellulaire. Bien qu'un seul scénario de co-culture par insert ait été présenté ici, il s'agit d'une technique très souple. Dans ce protocole, un type cellulaire a été prétraité avec la molécule responsable de la réduction de la sécrétion de facteurs solubles qui, après le transfert de l'insert dans le puits, affectent le comportement d'un second type cellulaire.Cependant, il est possible d'incuber les deux types cellulaires ensemble dans un système de co-culture afin de détecter l'augmentation de la fragilité, ou au contraire de la résistance, d'une ou des deux populations cellulaires à un traitement ultérieur. Cette technique peut simplement utiliser deux populations cellulaires incubées ensemble sans traitement, afin d'évaluer la signalisation paracrine réciproque basale, par exemple. En plus d'être utile dans le domaine de la neuroinflammation, comme le montre ici, les systèmes de co-culture avec inserts peuvent être utilisés pour répondre à un large éventail de questions relatives à la régénération tumorale, à la neurolathyrisme, à la signalisation de l'apoptose, ou à tout autre sujet impliquant un volet de signalisation paracrine.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez désormais bien comprendre comment les systèmes de co-culture avec insert peuvent offrir un moyen simple d'évaluer les modifications induites par des facteurs solubles sécrétés. Nous espérons également vous avoir convaincu du fort potentiel de ces systèmes de co-culture avec insert dans l'étude de la signalisation paracrine multicellulaire en l'absence de contact cellule-cellule.

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