Développement d'un système d'insertion Co-culture de deux types cellulaires en l'absence de Cell-Cell Contactez

L’objectif global de cette procédure est de créer un système de co-culture cellulaire de deux types de cellules à l’aide d’inserts avec une membrane perméable, permettant ainsi la diffusion des facteurs solubles sécrétés. Ceci est accompli par une série d’étapes qui placent finement des inserts contenant un type de cellule dans une plaque de culture tissulaire à plusieurs puits contenant un deuxième type de cellule. Nous commençons mon ensemencement du type de cellule numéro un dans des inserts, et mon ensemencement du type de cellule numéro deux dans une plaque de culture tissulaire multipuits.

La deuxième étape consiste à transférer les inserts dans les puits de la plaque contenant le type de cellule numéro deux. En fin de compte, cela donne la possibilité de récolter les deux types de cellules ainsi que les surnageants respectifs. Par conséquent, il est possible d’évaluer l’effet des facteurs solubles sécrétés sur le type de cellule d’intérêt.

Dans les organismes multicellulaires, les facteurs solubles sécrétés provoquent des réponses de différents types de cellules à la suite de la signalisation paracrine. En tant que tel, la valeur d’un système de co-culture d’inserts réside dans sa capacité à offrir une manière originale d’évaluer les changements de paramètres cellulaires médiés par des facteurs solubles sécrétés en l’absence de contact cellule-cellule. Les systèmes de co-culture d’insertion offrent divers avantages par rapport aux autres techniques de co-culture, tels que :l’une par signalisation directionnelle ; deux ont conservé la polarité cellulaire ; et trois détections spécifiques à la population des changements cellulaires.

Un protocole spécifique pour mesurer les effets toxiques des cytokines sécrétées par la microglie N9 activée par les lipopolysaccharides sur les cellules neuronales PC12 sera détaillé ci-dessous, fournissant ainsi une compréhension concrète de la méthodologie de co-culture d’inserts. Pour commencer, déballez la plaque de culture tissulaire à 24 puits et les inserts en polytétrafluoroéthylène de 0,4 micron de leur emballage. Ensuite, placez les inserts dans les puits vides de la plaque de culture tissulaire en saisissant le bord supérieur de l’insert à l’aide d’une pince à épiler stérile.

Ensuite, remplissez les inserts avec du milieu N9 de routine jusqu’à ce que la membrane soit complètement recouverte. Incuber les inserts pendant au moins une heure, ou toute la nuit, pour améliorer la capacité des cellules à se fixer. Une fois que les inserts sont prêts, divisez la microglie N9 à 80 à 90 % de confluence à l’aide du milieu N9 habituel pour obtenir une suspension cellulaire qui sera utilisée pour ensemencer les inserts.

Ensuite, retirez le milieu de routine des inserts en prenant soin de ne pas perforer la membrane avec la pointe de la micropipette. Ensuite, ensemencez chaque insert à 60 000 cellules par centimètre carré avec 50 microlitres de suspension cellulaire, ou selon le protocole du fabricant de l’insert. Lors de la distribution de la suspension cellulaire, assurez-vous qu’elle reste homogène en inversant de temps en temps le tube.

Lorsque tous les inserts sont ensemencés, balancez doucement la plaque d’avant en arrière, puis de gauche à droite, afin de répartir uniformément les cellules. Évitez de faire des mouvements circulaires car cela entraînerait l’accumulation des cellules au centre de l’insert. Par la suite, incubez la plaque contenant les inserts pendant 24 heures avant de poursuivre avec l’activation de la microglie N9.

Commencez par peser 10 milligrammes de lipopolysaccharide et conservez-le dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre pour une utilisation ultérieure. Étant donné que le lipopolysaccharide est une puissante endotoxine pro-inflammatoire et nécessite des précautions de sécurité particulières, des lunettes, des gants et un respirateur contre les particules sont fortement recommandés. Ensuite, créez un ensemble de dilutions en série de lipopolysaccharide à l’aide d’un milieu de traitement N9 chaud pour obtenir des solutions efficaces de quatre, deux et un microgrammes par millilitre.

Enfin, retirez la moitié du milieu de culture des inserts en prenant soin de ne pas déranger les cellules. Ensuite, ajoutez doucement 25 microlitres de solutions de travail de lipopolysaccharide dans les inserts pour obtenir des dilutions finales de deux, un ou 0,5 microgrammes par millilitre. Incuber la plaque pendant encore 24 heures avant de procéder aux expériences de co-culture.

Cette étape nécessite des cellules PC12 plaquées à 30 000 cellules par centimètre carré d’interneurones différenciés, et une microglie N9 activée avec du lipopolysaccharide pendant 24 heures, comme décrit dans la section précédente. Commencez par retirer délicatement tout le milieu des inserts et remplacez-le par 50 microlitres de milieu de traitement N9 frais et chaud. Ceci est nécessaire pour éliminer toutes les traces de lipopolysaccharide, ne laissant que la microglie N9 activée.

Gardez à l’esprit que les inserts sont lâches dans les puits de la plaque de culture tissulaire et peuvent se déplacer si la pointe est pressée trop fort sur la paroi. Cette étape doit être exécutée un insert à la fois afin d’éviter que les cellules ne se dessèchent en raison d’un contact prolongé avec l’air. Par la suite, retirez complètement le milieu cellulaire neuronal PC12 et remplacez-le par 0,6 millilitre de milieu de traitement PC12 frais et chaud.

Faites-le bien une à la fois pour vous assurer que les cellules ne se dessèchent pas. À l’aide d’une pince à épiler, saisissez le bord supérieur d’un insert et placez-le doucement dans le puits contenant les cellules neuronales PC12. Lorsque tous les inserts sont transférés, vérifiez la présence de bulles d’air sous les membranes des inserts.

Les bulles d’air empêcheront tout échange à travers la membrane de l’insert et peuvent mettre en péril l’ensemble de l’expérience. Éliminez toutes les bulles d’air en soulevant très doucement l’insert du puits à l’aide d’une pince à épiler et en le replaçant dans le milieu de culture cellulaire, cette action devrait éliminer la plupart des bulles. Cependant, pour les bulles persistantes, essayez de replonger doucement l’insert dans le milieu de culture cellulaire en biais.

Ne frappez pas ou ne remuez pas les inserts, car cela a tendance à provoquer la dissociation des cellules adhérentes. Ensuite, vérifiez les volumes de fluide dans les inserts et les puits, le liquide dans les deux compartiments doit être à peu près au même niveau. Lorsque toutes les bulles d’air sont éliminées et que les volumes de média sont appropriés, incubez la plaque.

Les cellules, le milieu de culture, ou les deux, peuvent ensuite être récoltés pour mesurer les effets de la signalisation paracrine entre la microglie N9 et les cellules neuronales PC12. Des tests immuno-enzymatiques ont été effectués sur le milieu de culture cellulaire du compartiment inférieur pour quantifier les cytokines pro-inflammatoires. Les résultats montrent que 24 heures après la période d’activation, la microglie N9 traitée avec deux microgrammes par millilitre de lipopolysaccharide a sécrété significativement plus de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’interluken-6, le facteur de nécrose tumorale-alpha et l’interféron gamma, par rapport aux microglies qui n’ont pas été traitées.

De plus, la microglie N9 traitée avec un microgramme par millilitre de lipopolysaccharide a sécrété nettement plus d’interféron gamma après 24 heures, alors qu’il a fallu 48 heures pour voir une augmentation significative des niveaux de milieu cellulaire d’interluken-6 et du facteur de nécrose tumorale-alpha. En revanche, la condition de 0,5 microgramme par millilitre n’a pas réussi à améliorer l’expression des cytokines dans la microglie N9 à la fois 24 et 48 heures après la période d’activation. De plus, les données à 24 heures dans le groupe de deux microgrammes par millilitre suggèrent qu’il y avait une microgliose, une augmentation de la population microgliale.

Cependant, ce n’est qu’après 48 heures que le numéro de cellulaire a été considérablement augmenté. Enfin, afin d’évaluer les conséquences de l’activation microgliale conduisant à une augmentation de la sécrétion de cytokines et des microgliosos, la cytotoxicité a été évaluée dans les cellules neuronales PC12 co-cultivées. En mesurant les niveaux de lactate déshydrogénase extracellulaire, qui est libérée par les cellules endommagées, on a constaté que les cellules neuronales PC12 présentaient une plus grande mort cellulaire à mesure que la concentration de lipopolysaccharide sur les cellules N9 augmentait.

En tant que tels, ces résultats montrent que les facteurs solubles sécrétés sont capables de traverser la membrane des inserts de co-culture, et peuvent causer des dommages cytotoxiques aux cellules neuronales PC12 en l’absence de contact cellule-cellule. Bien qu’un seul scénario de co-culture d’insertion ait été présenté ici, il s’agit d’une technique très flexible. Dans ce protocole, un type de cellule a été prétraité avec la molécule responsable de la réduction de la sécrétion de facteurs solubles qui, lors du transfert de l’insert dans le puits, affectent le comportement du deuxième type de cellule.

Cependant, il est possible d’incuber les deux types de cellules ensemble dans un système de co-culture pour détecter la faiblesse ou la résistance accrue de l’une ou des deux populations cellulaires à un traitement ultérieur. Cette technique permet simplement d’utiliser deux populations de cellules incubées ensemble sans aucun traitement, pour évaluer la signalisation réciproque paracrine basale, par exemple. En plus d’être appréciés dans le domaine de la neuroinflammation, comme démontré ici, les systèmes de co-culture d’inserts peuvent être utilisés pour répondre à un large éventail de questions relatives à la régénération tumorale, au neurolathyrisma, à la signalisation de l’apoptose ou à tout autre sujet ayant une composante de signalisation paracrine.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon dont les systèmes de co-culture d’inserts peuvent offrir un moyen simple d’évaluer les changements médiés par le facteur soluble sécrété. Et nous espérons vous avoir convaincu du fort potentiel de ces systèmes de co-culture d’inserts dans l’étude de la signalisation paracrine multicellulaire en l’absence de contact cellule-cellule.