Name: Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez un insert imprimé en 3D pour co-cultures cellulaires 2D et 3D facilitant la communication paracrine entre kératinocytes et cellules endothéliales. Cette méthode améliore la prolifération et la migration cellulaire pour l'étude des physiopathologies.

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Cette étude a été réalisée en collaboration avec BASF Beauty Care Solutions. Mme Charlie Colin-Pierre est doctorante financée par BASF et le CNRS.
Nous tenons à remercier M. Mehdi Sellami pour la conception des inserts imprimés en 3D.

REMARQUE : Les inserts 3D (Figure 1A) sont achetés dans le commerce et sont imprimés à l’aide d’une résine photopolymère biocompatible avec la culture cellulaire et l’autoclavage (voir le tableau des matériaux). Dans cette section, un protocole détaillé pour établir le modèle de co-culture par inserts est décrit (voir la figure 1B). Quelques exemples d’applications sont également fournis.
1. Mise en place de l’insert stérilisé dans les plaques à 6 puits
<ol><li>Mélangez les deux composants fournis dans le kit (voir tableau des matériaux), le silicium alimentaire (réactif A) et le catalyseur (réactif B), dans un rapport de 10 :1 (v/v) selon les instructions du fabricant. (Figure 1Ba). Utilisez une spatule stérilisée à l’éthanol à 70 % pour mélanger les deux composants. REMARQUE : Le volume du mélange de silicium à préparer dépend du nombre d’inserts à fixer. Un excès de catalyseur peut entraîner une solidification trop rapide du mélange de silicium.</li>
	<li>Appliquez les inserts sur le mélange de silicone à l’aide d’une pince à épiler de manière à ce que le mélange soit uniformément réparti sur le bord inférieur des inserts (Figure 1Bb). Placez les inserts dans les puits d’une plaque à 6 puits et appliquez une légère pression sur les inserts pour vous assurer que les inserts sont en contact étroit avec la plaque afin d’éviter toute fuite du milieu de culture cellulaire (Figure 1Bc).</li>
	<li>Placez la plaque à 37 °C pour soutenir le processus de solidification du silicium pendant 1 h. REMARQUE : Le temps de solidification dépend de la quantité de catalyseur qui a été ajoutée.</li>
	<li>Après solidification, stériliser les plaques avec les inserts en les plongeant dans un bain d’éthanol à 70% pendant 30 min à 1 h.</li>
	<li>Jetez l’alcool par pipetage et laissez sécher la plaque (couvercle ouvert) pendant la nuit dans une hotte de culture cellulaire. REMARQUE : L’alcool doit être complètement évaporé avant d’effectuer l’étape suivante pour éviter la fixation cellulaire et la toxicité. La plaque prête à l’emploi contenant les inserts peut être conservée pendant plusieurs jours avant utilisation dans des conditions sèches et stériles à température ambiante.</li>
</ol>2. Revêtements tels que la poly-L-lysine ou la poly-HEMA (étape facultative)
REMARQUE : Le revêtement n’est pas effectué dans cette expérience et les étapes sont fournies pour informer sur la possibilité de revêtement des inserts.
<ol><li>Préparez la solution de revêtement selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Considérez un volume de 200 à 400 μL pour les plus grands compartiments et un volume de 50 à 100 μL pour les plus petits compartiments pour le revêtement de l’insert. Ajoutez la solution de revêtement dans les compartiments individuels.</li>
	<li>Laissez sécher le revêtement comme indiqué par le fabricant dans des conditions stériles.</li>
</ol>3. Ensemencement des cellules
<ol><li>Cultivez les kératinocytes de la gaine radiculaire externe (KORS) et les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines (HDMEC) selon les recommandations du fabricant. Préparez la suspension cellulaire une fois que les cellules atteignent la confluence.<ol><li>Jeter le milieu des flacons et ajouter 5 mL de trypsine pour détacher les cellules (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Placer la fiole contenant le KORS à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 5 min. Incuber le flacon contenant les HDMEC pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Mélanger la solution de trypsine contenant le KORS avec 5 mL de milieu de cellules souches mésenchymateuses (MSCM) complété par 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et de facteurs de croissance (milieu basal avec trousse de supplémentation, voir le tableau des matériaux). Mélanger la solution de trypsine contenant les HDMEC avec 5 mL de milieu cellulaire endothélial (ECM) complété par 5 % de FBS et de facteurs de croissance (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Transférer les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml. Centrifuger les suspensions KORS et HDMEC à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL du milieu respectif.</li>
		<li>Mélanger 10 μL de la suspension cellulaire avec 10 μL de colorant bleu trypan (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Ajouter 10 μL du mélange dans la chambre de la lame de comptage.</li>
		<li>Insérez la lame de comptage dans le système de comptage des cellules (voir le tableau des matériaux) et détectez le numéro de cellule et la viabilité.</li>
		<li>Préparez la suspension cellulaire à une concentration de 0,5 x 105 cellules/mL dans le milieu respectif. REMARQUE : Si les différents types de cellules nécessitent des temps d’adhérence différents et/ou pour atteindre la confluence idéale, l’ensemencement des cellules peut être effectué à des moments différents selon les types de cellules.</li>
	</ol></li>
	<li>Distribuer 800 μL à 1 mL de suspension cellulaire dans les grands compartiments individuels et 100 à 150 μL dans les petits compartiments individuels à l’aide d’une pipette.<ol><li>Ensemencer le KORS à raison de 1 x 10 5 cellules/mL dans du MSCM complété par5% de FBS et des facteurs de croissance dans l’un des grands compartiments.</li>
		<li>Semence HDMEC dans ECM complétée par 5 % de FBS et de facteurs de croissance à 2,5 x 103 cellules/mL dans les petits compartiments et à 1,25 x 105 cellules/mL dans l’autre grand compartiment. REMARQUE : L’essai de prolifération peut être effectué dans les petits compartiments, et les tests de migration et de viabilité peuvent être effectués dans les grands compartiments. La concentration des cellules ensemencées a été optimisée selon les recommandations du fabricant. Cette concentration permet une bonne viabilité des cellules après 24 à 48 h d’incubation.</li>
	</ol></li>
	<li>Placer la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 ou dans les conditions habituelles pour permettre l’adhésion et/ou la maturation des cellules. REMARQUE : Incuber les cellules pendant 24 à 48 h sans changer le milieu. Si nécessaire, le support des compartiments peut être modifié indépendamment.</li>
</ol>4. Mise en œuvre de la co-culture (Figure 1Bd)
NOTE : La mise en place de la co-culture correspond au moment où le milieu commun est ajouté. L’ajout d’un milieu unique pour tous les types de cellules dans les différents compartiments offre la possibilité d’une communication paracrine entre les cellules en raison de la présence de fenêtres de communication (trous ovoïdes dans les parois des inserts imprimés en 3D). Pour mettre en œuvre la co-culture, suivez les étapes 4.1 à 4.3.
<ol><li>Videz les milieux de culture des différents compartiments des inserts à l’aide d’une pipette. Dans le cas d’une culture de cellules sphéroïdes 3D, jetez le milieu très doucement.</li>
	<li>Rincez les cellules avec 1 mL de PBS chaud à 37 °C dans les grands compartiments et 200 μL de PBS chaud à 37 °C dans les petits compartiments. Assurez-vous d’un lavage doux pour ne pas détacher les cellules.</li>
	<li>Ajouter 3 mL d’un milieu commun choisi pour être compatible avec tous les types de cellules. NOTA : Dans cette étude, l’ECbasale M (sans FBS ni facteurs de croissance) est utilisée. Assurez-vous que le support recouvre tous les compartiments (niveau au-dessus des fenêtres de communication [trous ovoïdes dans les murs], comme illustré à la figure 1A).</li>
	<li>Placer la plaque contenant les co-cultures à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 à 48 h.</li>
</ol>5. Observation, comptage et grattage des cellules
<ol><li>Observer la morphologie et compter le nombre de cellules des différents compartiments pendant l’expérience sous un microscope optique après 24-48 h d’incubation. NOTE : Le nombre de cellules attendues dépend des types de cellules utilisées (taille, morphologie, etc.) et de la taille du compartiment. Dans cette expérience, entre 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL et entre 0,25 x 106-0,75 x 106 HDMECs/mL sont comptés dans les grands compartiments.</li>
	<li>Détachez les cellules à l’aide de trypsine pour le comptage des suspensions cellulaires. REMARQUE : Pour la solution de détachement des cellules, considérez un volume de 100 à 500 μL pour les plus grands compartiments et un volume de 10 à 50 μL pour les plus petits compartiments.</li>
	<li>Vérifiez la viabilité à l’aide d’une coloration au bleu trypan (voir les étapes 3.1.6 à 3.1.8).</li>
</ol>6. Nettoyage des inserts pour le recyclage
<ol><li>Retirez les inserts de la plaque à 6 puits à la fin de l’expérience en les tournant légèrement (Figure 1Be).</li>
	<li>Retirez le silicone des inserts en le tirant. Si nécessaire, utilisez une spatule pour retirer le silicium restant collé aux parois des inserts (Figure 1Bf).</li>
	<li>Lavez les inserts avec des détergents et des produits de nettoyage conventionnels pour cultures cellulaires (exemple fourni dans le tableau des matériaux).</li>
	<li>Stériliser les inserts pour une utilisation ultérieure en autoclave (cycle solide, 121 °C pendant 20 min) ou en les immergeant dans un bain d’éthanol à 70% pendant 1 h. NOTE : À partir de cette étape, deux exemples de tests possibles (tests de prolifération et de migration) sont décrits à l’aide des inserts imprimés en 3D (Figure 1Bd).</li>
</ol>7. Essai de prolifération cellulaire - Essai WST-1
<ol><li>Suivez les étapes 1 à 3.1 pour cultiver les cellules. REMARQUE : Suivez l’étape décrite dans cette section pour mettre en œuvre le système de co-culture afin d’étudier l’effet du sécrétome KORS sur la prolifération HDMEC. Les cellules KORS sont utilisées pour comparer les données publiées précédemment8.<ol><li>Ensemencer le KORS à raison de 1 x 10 5 cellules/mL dans un milieu de cellules souches mésenchymateuses (MSCM) complété par5 % de FBS et des facteurs de croissance dans les grands compartiments.</li>
		<li>Placer la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
		<li>Ensemencer les HDMECs dans un milieu de cellules endothéliales (ECM) complété par 5% de FBS et de facteurs de croissance à raison de 2,5 x 103 cellules/mL dans les petits compartiments.</li>
		<li>Placez la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 à 48 h.</li>
		<li>Éliminer les milieux de tous les compartiments et mettre en œuvre le système de co-culture par l’ajout de 3 mL d’ECM basale non supplémentée (milieu de culture cellulaire commun à tous les compartiments des inserts imprimés en 3D).</li>
	</ol></li>
	<li>Diluer WST-1 dans le milieu de culture cellulaire commun ECM (dilution finale 1 :10) pour préparer la solution WST-1. REMARQUE : Pour le volume de la solution WST-1, préparer au moins 500 μL de solution supplémentaire pour le blanc.</li>
	<li>Éliminez le milieu de culture cellulaire de l’insert par pipetage.</li>
	<li>Ajouter la solution WST-1 aux compartiments sélectionnés (150 μL pour les petits compartiments et 600 μL pour les grands compartiments). Placez l’assiette à 37 °C avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Après le temps d’incubation cellulaire optimal de 30 minutes, transférez 100 μL du milieu d’incubation de chaque condition sur une plaque à 96 puits.</li>
	<li>Évaluer la réaction colorimétrique à l’aide d’un lecteur de microplaques entre 420 nm et 480 nm.<ol><li>Placez la plaque sur le lecteur de microplaques et cliquez sur le bouton modifier un nouveau protocole.</li>
		<li>Sélectionnez le type spécifique de plaque à 96 puits (voir le tableau des matériaux) utilisé et la longueur d’onde de 450 nm.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton démarrer la mesure.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Test de migration cellulaire - dispositif à deux chambres de migration
<ol><li>Suivez les étapes 1 à 3.1 pour cultiver les cellules. REMARQUE : Suivez les étapes de cette section pour mettre en œuvre le système de co-culture afin d’étudier l’effet du sécrétome KORS sur la prolifération HDMEC.<ol><li>Ensemencer le KORS à raison de 1 x 10 5 cellules/mL dans du MSCM complété par5% de FBS et des facteurs de croissance dans l’un des grands compartiments.</li>
		<li>Placer la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
		<li>Placez le dispositif à deux chambres de migration dans l’autre grand compartiment d’inserts.</li>
		<li>Ensemencer les HDMECs dans ECM complété par 5% de FBS et de facteurs de croissance à 7 x 105 cellules/puits du dispositif à deux chambres de migration.</li>
		<li>Placer la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
		<li>Jetez le milieu et le dispositif à deux chambres de migration après 24 h ou à un moment optimal selon le type de cellule qui migre. Mettre en œuvre le système de co-culture par l’ajout de 3 mL d’ECM basale non supplémentée. REMARQUE : Procédez avec précaution pour ne pas détacher les cellules. Si les cellules sont vraiment sensibles au décollement induit par l’ajout de milieu commun, retirez le dispositif à deux chambres de migration après l’ajout du milieu commun.</li>
	</ol></li>
	<li>Observez et prenez une photo de la surface recouverte par les cellules à différents moments sous un microscope à contraste de phase à un grossissement de 10x. REMARQUE : Les photos sont prises à l’aide d’un microscope à contraste de phase (voir le tableau des matériaux). Les images sont enregistrées sur une clé USB puis analysées par le plugin d’outil de cicatrisation du logiciel (voir Table des matériaux).</li>
	<li>Mesurez la surface non couverte à l’aide d’un logiciel d’analyse quantitative classique.<ol><li>Ouvrez l’image sur le logiciel et activez l’outil de cicatrisation disponible dans la liste des macros.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton m pour mesurer la surface non couverte de l’image de migration.</li>
		<li>La surface non couverte est calculée selon la formule suivante : Pourcentage de couverture = ([surface moyenne sans cellules à T0 − surface sans cellules à l’instant T]/surface moyenne sans cellules à T0) × 100. NOTE : Les inserts imprimés en 3D sont totalement adaptés à la plupart des techniques de biologie cellulaire (telles que le test de formation de pseudotubes, les cultures 3D) et pour les expériences de biochimie (telles que l’extraction d’ADN, d’ARN, de protéines).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li>
<li>Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825(2019).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1%2F2%2FHIF-1%CE%B1%2FVEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113(2018).</li>
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<li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense%2C+interconnected+endothelial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318(2021).</li>
<li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).</li>
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<li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glypican-1%2FHGF%2FC-met+and+glypican-1%2FVEGF%2FVEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172(2021).</li>
<li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li>
<li>Wu, A. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m%C3%BCller+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352(2021).</li>
<li>Oudart, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li>
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<li>Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth%2C+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97(2018).</li>
<li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

La communication cellulaire indirecte est couramment étudiée à l’aide de milieux conditionnés ou de dispositifs de système de co-culture. La préparation des milieux conditionnés prend beaucoup de temps en amont des expériences, et cette méthode est limitée à des analyses unilatérales des effets. L’étude précédente de Colin-Pierre et al.8 à l’aide de milieux conditionnés a été menée sur la communication cellulaire indirecte entre deux types de cellules (HDMECs et KORS). Les données de cett...

In vivo, les cellules communiquent entre elles soit directement (contact cellulaire), soit indirectement (par sécrétion de molécules). Pour étudier la communication cellulaire, différents modèles de co-culture peuvent être développés, tels que la co-culture directe (les différents types de cellules sont en interaction directe dans le même puits) et la co-culture compartimentée (les différents types de cellules sont en interaction indirecte dans différents compartiments d’un système de culture)1. De plus, les milieux conditionnés peuvent être utilisés pour les systèmes de co-culture, où l’interaction indirecte est rendue possible par le transfert de molécules sécrétées contenues dans le milieu conditionné d’un type de cellule effectrice à une cellule répondeusede type 1.
Dans le cas des études de communication cellulaire paracrine, les systèmes de co-culture indirecte fournissent des modèles qui reflètent fortement les interactions cellulaires in vivo. Des systèmes de co-culture indirecte ont été développés et commercialisés, permettant la mise en place de modèles de co-culture indirecte 2,3. Malheureusement, la plupart des systèmes de co-culture indirecte ne comportent que deux compartiments. D’autres systèmes de co-culture indirecte offrent plusieurs compartiments, mais ils sont moins évolutifs que le système décrit dans le présent manuscrit. Certains d’entre eux ne permettent pas une visualisation classique au microscope, et ils présentent souvent des méthodes d’application spécifiques. Dans plusieurs études, la communication paracrine entre différents types de cellules est sondée par le modèle de milieu conditionné 4,5,6,7. Il s’agit d’une méthode d’investigation plus facile par rapport aux systèmes de co-culture indirects, car elle ne nécessite pas de méthodes ou de matériaux spécifiques pour être établie1. D’autre part, la préparation des milieux conditionnés prend du temps et ne fournit des informations que sur la signalisation cellulaire unidirectionnelle (effecteur à répondeur)1.
Dans cet article, une nouvelle façon simple d’étudier la communication cellulaire est proposée. Permettant la combinaison de plusieurs types de cellules en interaction directe ou indirecte et dans des formats 2D ou 3D, les inserts imprimés présentent de nombreux avantages pour mettre en place facilement des modèles de co-culture. Adapté pour être placé dans les puits de plaques de 6 puits, l’insert imprimé en 3D est circulaire et permet de séparer le puits en quatre compartiments (deux grands compartiments et deux petits compartiments ; Graphique 1A). Les inserts imprimés en 3D se caractérisent par l’absence de fond. Ainsi, les cellules sont en contact direct avec la plaque sur laquelle l’insert est placé. De plus, chaque compartiment peut être revêtu indépendamment des autres. De plus, le comportement des cellules peut être facilement suivi au microscope optique. La présence de fenêtres de communication dans chaque paroi de l’insert permet l’ajout, au moment optimal, d’un support commun pour réaliser différentes expériences de co-culture. De nombreuses combinaisons de co-culture peuvent être réalisées pour étudier la communication directe et/ou indirecte entre plusieurs types de cellules. Par exemple, un modèle de co-culture indirecte entre quatre types de cellules différentes en monocouche et/ou en 3D (sphéroïdes) peut être conçu. Une combinaison de modèles de co-culture directe et indirecte peut également être réalisée en mélangeant différents types de cellules dans le même compartiment. L’effet de structures complexes (organoïdes, explants de tissus, etc.) sur différents types de cellules pourrait être un autre exemple de modèles qui peuvent être réalisés. De plus, les inserts imprimés en 3D sont compatibles avec les tests fonctionnels de biologie cellulaire (prolifération, migration, formation de pseudotubes, différenciation, etc.) et avec les tests de biochimie (extraction d’ADN, d’ARN, de protéines, de lipides, etc.). Enfin, les inserts imprimés en 3D offrent un large éventail de schémas expérimentaux de modèles de co-culture avec la possibilité de combiner simultanément différents tests dans la même expérience dans les différents compartiments.
Certaines capacités des inserts imprimés en 3D sont présentées pour les valider en tant que modèle de co-culture rapide et facile à utiliser. Par rapport à une étude précédemment publiée sur la communication des cellules paracrines, la capacité des inserts imprimés en 3D à être un modèle de co-culture précieux est démontrée. Pour évaluer ce point, la régulation de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales par les kératinocytes a été comparée entre le système d’insertion imprimé en 3D et le système classique utilisant des milieux conditionnés. Les inserts imprimés en 3D permettent d’obtenir rapidement des résultats similaires par rapport au système conventionnel utilisant des supports conditionnés. En effet, les inserts imprimés en 3D fournissent un modèle robuste pour étudier les interactions cellulaires dans les deux sens sans avoir besoin de produire des milieux conditionnés et avec la possibilité d’effectuer en parallèle les tests de prolifération et de migration dans la même expérience.
Pour conclure, dans cet article, un nouveau modèle prêt à l’emploi pour étudier la communication cellulaire est proposé. Compatibles avec tous les types de cellules adhérentes, les inserts imprimés en 3D permettent d’effectuer de nombreuses combinaisons de co-culture qui visent à se rapprocher des conditions in vivo .

<table><tbody><tr><td>Autoclave</td><td>Getinge</td><td>APHP</td><td>Cycle solide, 121 &deg ; C pour 20 min</td></tr><tr><td>Biomed Clear</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>Impression réalisée par la société 3D-Morphoz (Reims, France)</td></tr><tr><td>Détergents pour culture cellulaire&nbsp ;</td><td>Tounett</td><td>A18590/0116</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de prolifération cellulaire WST-1</td><td>Roche</td><td>11,64,48,07,001</td><td></td></tr><tr><td>Lame de comptage</td><td>NanoEnTek</td><td>EVE-050</td><td></td></tr><tr><td>Culture-Insert 2 Puits dans &mu ;-Dish 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>80206</td><td>dispositif à deux chambres de migration.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Milieu endothélial</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td>Milieu basal +/- 25 mL de sérum fœtal bovin (FBS, 0025), 5 mL de supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS, 1052) et 5 mL de solution de pénicilline/streptomycine (P/S, 0503).</td></tr><tr><td>EVE Compteur automatisé de cellules&nbsp ;</td><td>NanoEnTek</td><td>NESCT-EVE-001E&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMEX1200</td><td>10x de grossissement</td></tr><tr><td>Kit réactif et catalyseur de silicium alimentaire</td><td>Artificina</td><td>RTV 3428 A et B&nbsp ;</td><td>(10:1)</td></tr><tr><td>Imprimante FORM 3B</td><td>Formlabs</td><td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td><td>Impression réalisée par la société 3D-Morphoz</td></tr><tr><td>Cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines (HDMEC)</td><td>ScienCell</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>Kératinocytes de la gaine radiculaire externe (KORS)</td><td>ScienCell</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’outil de cicatrisation des macro-plaies</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Logiciel utilisé pour la mesure de la surface découverte (pour essais de migration)</td></tr><tr><td>Milieu de cellules souches mésenchymateuses&nbsp ;</td><td>ScienCell</td><td>7501</td><td>Milieu basal +/-25 mL de sérum fœtal bovin (FBS, 0025), 5 mL de supplément de croissance des cellules souches mésenchymateuses (MSCGS, 7552) et 5 mL de solution de pénicilline/streptomycine (P/S, 0503)</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques SPECTRO star NANO</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>BMG Logiciel LABTECH</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Promocell</td><td>C-40232</td><td>Sans Ca2+ / Mg2+</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>NanoEnTek</td><td>EBT-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine / EDTA</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td>Incubation de KORS à 37 &deg ; C avec 5 % de CO2 pendant 5 min. Incubation de HDMECs pendant 5 min à température ambiante</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits Nunclon Delta Surface</td><td>Thermoscientific</td><td>167008</td><td></td></tr></tbody></table>

un insert innovant imprimé en 3d conçu pour permettre des cultures cellulaires 2d et 3d simples

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

Les analyses classiques de la communication indirecte entre différents types de cellules nécessitent l’utilisation de milieux conditionnés. De plus, la production de milieux conditionnés reste chronophage et éloignée des conditions physiologiques et pathologiques. Bien que quelques modèles de co-culture soient disponibles dans le commerce, ils restent limités à des tests spécifiques et concernent principalement deux types de cellules. 
Ici, on utilise des inserts imprimés en 3D qui sont compatibles avec de nombreux tests fonctionnels. L’insert permet la séparation d’un puits d’une plaque à 6 puits en quatre compartiments. Un large éventail de combinaisons peut être défini. De plus, des fenêtres sont conçues dans chaque paroi des compartiments de manière à ce que la communication intercellulaire potentielle entre chaque compartiment soit possible dans le milieu de culture d’une manière dépendante du volume. Par exemple, la communication intercellulaire paracrine peut être étudiée entre quatre types de cellules en monocouche, en 3D (sphéroïdes), ou en combinant les deux. De plus, un mélange de différents types de cellules peut être ensemencé dans le même compartiment au format 2D ou 3D (organoïdes). L’absence de fond dans les inserts imprimés en 3D permet les conditions de culture habituelles sur la plaque, un éventuel revêtement sur la plaque contenant l’insert, et une visualisation directe par microscopie optique. Les multiples compartiments offrent la possibilité de collecter différents types de cellules indépendamment ou d’utiliser, dans chaque compartiment, différents réactifs pour l’extraction d’ARN ou de protéines. Dans cette étude, une méthodologie détaillée est fournie pour utiliser le nouvel insert imprimé en 3D comme système de co-culture. Pour démontrer plusieurs capacités de ce modèle flexible et simple, des tests fonctionnels de communication cellulaire précédemment publiés ont été effectués dans les nouveaux inserts imprimés en 3D et se sont avérés reproductibles. Les inserts imprimés en 3D et la culture cellulaire conventionnelle à l’aide de milieux conditionnés ont conduit à des résultats similaires. En conclusion, l’insert imprimé en 3D est un dispositif simple qui peut être adapté à de nombreux modèles de co-cultures avec des types de cellules adhérentes.

Dans le présent travail, un système de co-culture optimisé a été décrit pour obtenir des données robustes, fiables et significatives comparables aux méthodes classiques grâce à l’utilisation de milieux conditionnés. Les inserts imprimés en 3D imitent les conditions du microenvironnement in vivo de différents types de cellules en interaction en surmontant les difficultés et la production fastidieuse de milieux conditionnés en amont des expériences. Une étude précédemment publiée a été remenée pour analyser les in...

Dans cet article, un insert nouvellement conçu imprimé en 3D est présenté comme un modèle de co-culture et validé par l’étude de la communication intercellulaire paracrine entre les cellules endothéliales et les kératinocytes.

Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Ce protocole peut être utilisé pour étudier de nombreuses études de culture et fournir un nouvel outil pour étudier la communication cellulaire directe. Ce nouveau dispositif permet de gagner un temps considérable dans l’établissement d’un modèle de culture et est applicable à différents types de cellules nécessitant ou non un enrobage spécifique. En effet, les quatre compartiments des inserts imprimés en 3D, permettent de cultiver différents types de cellules en monocouche, ou en 3D de la même manière avec différentes combinaisons.Les inserts imprimés en 3D sont plus durables, flexibles, évolutifs et peuvent être utilisés pour concevoir des modèles expérimentaux pour l’étude des physiopathologies, telles que l’immunologie ou l’androgenèse. Pour commencer, mélangez les deux composants, le silicium alimentaire et le catalyseur fournis dans le kit dans un rapport de 10 :1, à l’aide d’une spatule stérilisée à l’éthanol à 70% selon les instructions du fabricant. Appliquez les inserts sur le mélange de silicone à l’aide d’une pince à épiler afin que le mélange soit réparti de manière homogène sur le bord inférieur de l’insert.Placez les inserts dans les puits d’une plaque à six puits et appliquez une légère pression pour vous assurer que les inserts sont en contact étroit avec la plaque afin d’éviter toute fuite du milieu de culture cellulaire. Placez la plaque à 37 degrés Celsius pour soutenir le processus de solidification du silicium pendant une heure. Après solidification, stérilisez les plaques avec les inserts en les immergeant dans un bain d’éthanol à 70% pendant 30 minutes à une heure.Ensuite, jetez l’alcool par pipetage et laissez sécher la plaque pendant la nuit dans une hotte de culture cellulaire. Pour cultiver les kératinocytes de la gaine radiculaire externe et des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines, jetez le milieu des flacons et ajoutez cinq millilitres de trypsine pour détacher les cellules. Placez le flacon contenant les kératinocytes de la gaine racinaire externe à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq minutes, et incubez le flacon contenant les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines pendant cinq minutes à température ambiante.Dans un tube conique stérile de 15 millilitres, mélanger la solution de trypsine contenant les kératinocytes de la gaine radiculaire externe avec cinq millilitres de milieu de cellules souches mésenchymateuses supplémentées en 5 % de FBS et de facteurs de croissance et les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines avec cinq millilitres de milieu de cellules endothéliales supplémentées en 5 % de FBS et de facteurs de croissance. Centrifuger les kératinocytes de la gaine racinaire externe et les suspensions de cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de leurs milieux respectifs.Mélangez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec 10 microlitres de colorant bleu trypan et ajoutez 10 microlitres du mélange dans la chambre de la lame de comptage. Insérez la lame de comptage dans le système de comptage de cellules et détectez le nombre et la viabilité des cellules. Après avoir préparé la suspension cellulaire à une concentration de 50 000 cellules par millilitre dans le milieu respectif, répartissez 800 microlitres à un millilitre de suspension cellulaire dans les grands compartiments individuels et 100 à 150 microlitres dans les petits compartiments individuels avec une pipette.Voir les kératinocytes dans le milieu des cellules souches mésenchymateuses supplémentées en 5% FBS et facteurs de croissance et les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines dans le milieu des cellules endothéliales, complétées avec 5% FBS et les facteurs de croissance dans les petits et autres grands compartiments. Placez la plaque de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, ou dans les conditions habituelles, pour permettre l’adhésion et/ou la maturation des cellules. Videz les milieux de culture des différents compartiments des inserts à l’aide d’une pipette.Rincez ensuite les cellules avec un millilitre de PBS chaud à 37 degrés Celsius dans les grands compartiments et 200 microlitres dans les petits compartiments. Ajoutez trois millilitres d’un milieu commun sélectionné pour être compatible avec tous les types de cellules. Placez la plaque contenant les co-cultures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures.Détachez les cellules à l’aide de trypsine pour le comptage des suspensions cellulaires et vérifiez la viabilité à l’aide d’une coloration au bleu de trypan. Après avoir observé la morphologie, comptez le nombre de cellules des différents compartiments pendant l’expérience au microscope optique après 24 à 48 heures d’incubation. Tout d’abord, retirez les inserts de la plaque à six puits à la fin de l’expérience en les tournant légèrement, puis retirez le silicium des inserts en le retirant.Lavez les inserts avec des détergents et des produits de nettoyage conventionnels pour cultures cellulaires. Stérilisez ensuite les inserts pour une utilisation ultérieure dans un autoclave, ou en les immergeant dans un bain à 70% d’éthanol pendant une heure. Le phénotype et la viabilité cellulaire ont été comparés, où une viabilité de 90 % a été observée dans les puits des plaques à six puits, et de 91 % dans les inserts imprimés en 3D pour les kératinocytes de la gaine racinaire externe.La viabilité des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines était de 85 % dans les puits de la plaque à six puits, tandis que de 86 % dans les inserts imprimés en 3D. Les communications cellulaires indirectes entre les kératinocytes et les cellules endothéliales dans les inserts imprimés en 3D ont démontré qu’en présence de kératinocytes dans les inserts, la prolifération des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines augmentait significativement de 1,5 fois après 24 heures, et de 3,1 fois après 48 heures par rapport au témoin. Cependant, il a été démontré que les kératinocytes du milieu de la gaine radiculaire externe augmentaient significativement la prolifération des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines de 1,5 fois après 24 heures et de 2,1 fois après 48 heures.Le modèle de co-culture d’inserts imprimé en 3D a été testé pour déterminer l’effet des kératinocytes sur la migration des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines. Dans la condition témoin, les cellules endothéliales ont migré et ont recouvert environ 44 % de la surface de la plaie après 24 heures. En présence de kératinocytes, une augmentation significative de la migration des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines a été observée, ce qui montre que 43 %, 67 % et 99 % de la surface de la plaie étaient couverts après trois, 12 et 24 heures respectivement.De même, la migration des HDMECs augmente en présence de kératinocytes du milieu d’état de la gaine racinaire externe. Il est crucial d’assurer l’étanchéité de l’insert à la plaque, afin d’éviter la fuite du milieu des cellules d’un compartiment à l’autre. Plusieurs applications pourraient être faites, telles que la prolifération, la migration, les tests de formation sédative de l’ADN, de l’ARN, des protéines et d’autres analyses.

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