Procédure d'adaptation Laboratoire de l'évolution de Microorganismes Utilisation chémostat

L’objectif global de cette procédure est de permettre à un micro-organisme d’évoluer dans des conditions de laboratoire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que les relations entre les fonctions surrénales, les réponses au stress, l’ingénierie métabolique et, bien sûr, l’évolution. Le principal avantage de cette technique est la sélection continue du descendant le plus suadé dans des conditions de laboratoire spécifiques.

Commencer cette procédure par la préparation de l’équipement, ainsi que du milieu initial, du milieu de contrainte et du milieu de contrainte élevée, comme décrit dans le protocole de texte. Inoculer une seule colonie ou un E. coli de type sauvage dans un tube à essai de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu initial. Incuber l’éprouvette dans un incubateur agitateur pendant 12 heures à 37 degrés Celsius et 220 tr/min.

Incuber le bocal de chémostat en prévoyant une aération et une agitation à 37 degrés Celsius pendant six heures. Après l’incubation, connectez aseptiquement l’extrémité du tube en silicone des pompes au pot de chimiostat. Transférez aseptiquement un millilitre de pré-culture dans le bocal de chémostat.

Démarrez la pompe de sortie et récupérez la culture dans la phase exponentielle. Vérifiez la densité optique à 600 nanomètres de la culture à partir du tube de sortie. Ensuite, démarrez la pompe d’entrée.

Vérifiez la densité optique de la culture à 600 nanomètres du tube de sortie toutes les 24 heures. Après avoir fait fonctionner le chémostat pendant 96 heures, ce qui correspond à un chiffre d’affaires complet de 9,6, remplacez le réservoir à la concentration la plus faible de milieu à haute contrainte. Lorsque vous remplacez le réservoir par un milieu de stress plus élevé, les cellules peuvent être choquées.

Si la densité cellulaire est trop faible, arrêtez de nourrir le milieu de stress plus élevé pendant un certain temps pour restaurer la densité cellulaire. Si la densité optique est inférieure à 0,2, arrêtez la pompe d’entrée d’alimentation pendant six heures. Redémarrez la pompe d’entrée et vérifiez que la densité optique est supérieure à 0,2.

Augmentez progressivement la concentration du facteur de stress en passant progressivement à un réservoir contenant une concentration plus élevée. Prélever des échantillons de la culture adaptée chaque fois qu’elle atteint une étape d’adaptation aux facteurs de stress et les stocker pour une analyse génomique plus approfondie. Pour le stockage de l’échantillon, mélangez l’échantillon de culture de 0,5 millilitre avec 0,5 millilitre d’une solution stérilisée à 80 % de glycérol et conservez-le à 80 degrés Celsius.

Préparez un milieu de plaque de 1,6 % contenant le même facteur de stress à la même concentration que dans le milieu. Déposer 0,1 millilitres de la culture en sortie du chémostat et incuber à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Après l’incubation, prélever des colonies individuelles dans la plaque à l’aide d’un cure-dent stérile et les inoculer dans des tubes à essai de 15 millilitres contenant le même facteur de stress et à la même concentration de milieu que dans le chémostat.

Incuber pendant six heures. Transférez un millilitre de bouillon de culture dans un erlenmeyer de 250 millilitres contenant 50 millilitres de milieu. Récoltez 0,5 millilitre de bouillon de culture toutes les heures et mesurez la densité optique à 600 nanomètres.

Comparez le taux de croissance de la souche adaptée à celui de la souche de type sauvage compte tenu du facteur de stress. La souche sauvage E. coli a évolué dans un état de stress élevé en succinate pendant 270 jours, ce qui correspond à près de 930 générations. Chaque fois qu’un stress succinate plus élevé était ajouté, la concentration de biomasse était immédiatement abaissée, puis restaurée.

Voici un schéma de principe du chémostat, avec un mutant tolérant à la contrainte élevée du succinate. La plupart des cellules de type sauvage sont lessivées dans des conditions de stress et le mutant se développe davantage. Finalement, la population du descendant mutant est augmentée.

Les deuxième et troisième mutations sont continuellement sélectionnées pour le chémostat, qu’il finit par dominer. Cette figure montre que la souche adaptée s’est développée sans délai dans des conditions de stress élevé en succinate, contrairement à la souche de type sauvage. Une stratégie similaire peut être appliquée à l’évolution adaptative en laboratoire à l’aide d’un chémostat avec une variation de facteurs de stress.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’acquérir et de faire évoluer le micro-organisme dans une condition spécifiée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques mois. Lors de cette procédure, il est important de ne pas laver les cellules de chémostat en ajoutant trop de stress à la fois et de vérifier la densité optique tous les jours.

À la suite de cette procédure, des méthodes telles qu’une analyse du génome et une analyse du transcriptome peuvent-elles être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que quelle mutation contribue à l’évolution tolérante au stress ?