Name: Procédure dadaptation Laboratoire de lévolution de Microorganismes Utilisation chémostat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Apprenez l'évolution adaptative en laboratoire de microorganismes par culture en chémostat avec E. coli. Cette méthode permet d'étudier les réponses au stress et l'ingénierie métabolique.

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Cette étude a été soutenue financièrement par le ministère coréen des Sciences, des TIC et de la Planification future (programme du Centre de biologie synthétique intelligente 2012M3A6A8054887). P. Kim a été soutenu par une bourse de l’Université catholique de Corée (2015).

1. Équipement Préparation <ol><li> Obtenir un récipient chimiostatique (150-250 ml) ou d&#39;un Erlenmeyer (250 ml) contenant un orifice d&#39;entrée et un orifice de sortie. Connectez les ports avec des tubes de silicium permettant des taux de 10-100 ml / h de débit. En option, utiliser un évent, un orifice de sortie d&#39;air et des orifices d&#39;entrée et sortie d&#39;eau à température contrôlée. </li><li> Obtenir un dispositif approprié pour le pot de chemostat qui fournit pour l&#39;agitation et de la température (ou utiliser un incubateur agitateur rotatif). </li><li> Obtenir deux pompes péristaltiques afin d&#39;offrir un milieu frais et de percevoir la culture. </li><li> Obtenir un pot de réservoir (10 à 20 L) contenant un orifice de sortie de fluide et un orifice d&#39;entrée d&#39;air. </li><li> Obtenir un tube de silicium pour le taux de dilution (c. -à- ID 0,8 mm, plage de débit de 0,06 à 36 ml / min; L / S 13 tubes). </li></ol> 2. Moyen Préparation et stérilisation <ol><li> Medium initial <ol><li> Dissoudre 0,3 g de glucose, 0,08 g de NH 4Cl, 0,05 g de NaCl, 0,75 g de Na 2 HPO 4 .2H 2 O, et 0,3 g de KH 2 PO 4 dans 90 ml d&#39; eau distillée (DW) dans un récipient chimiostatique. </li><li> Sceller le bocal en chemostat avec le tuyau à l&#39;aide des pinces. Ne pas sceller l&#39;évent. </li><li> Stériliser le pot de chemostat dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min. Après stérilisation, stocker le pot de chemostat à la température ambiante. </li><li> Dissoudre 0,02 g de MgSO 4 · 7H 2 O, 0,01 g de CaCl 2, et 0,1 mg de thiamine dans 10 ml DW (solution A). </li><li> Une solution de filtration à l&#39;aide d&#39;une seringue et d&#39;un filtre à seringue pré-stérilisé (un filtre de 0,45 um de pores). </li><li> Ajouter la solution A filtrats dans le pot de chemostat. </li></ol></li><li> stress Medium <ol><li> Dissoudre 30 g de glucose, 8 g de NH 4 Cl, 5 g de NaCl, 75 g de Na 2 HPO 4 .2H 2 O, 30 g de KH 2 PO 4 et 300 g de succinate disodique hexahydraté (Na 2 · succinate .6H &lt;sub&gt; 2 O; le facteur de stress utilisé dans cette expérience) dans 9,9 L DW dans un pot de réservoir. </li><li> Sceller le pot de réservoir avec le tuyau à l&#39;aide des pinces. Ne pas sceller l&#39;évent. </li><li> Stériliser le pot de réservoir dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min. Après stérilisation, stocker le pot à la température ambiante. </li><li> Dissoudre 2 g MgSO 4 · 7H 2 O, 1 g de CaCl 2, et 10 mg de thiamine dans 100 ml DW (solution A). </li><li> Une solution de filtre avec une seringue et d&#39;un filtre à seringue pré-stérilisé (un filtre à pores de 0,45 um). </li><li> Ajouter la solution A filtrats dans le pot de réservoir. </li><li> Aseptique connecter le tube de silicium stérilisé pour le pot de réservoir et fixer les pompes péristaltiques. </li></ol></li><li> Haut-stress moyen <ol><li> Préparer le milieu comme dans la section 2.2, mais avec une plus grande concentration de stresseur (ie, 3-5 g / L plus élevé dans l&#39;adaptation succinate). Remarque: Ce protocole est pour l&#39;adaptation à une contrainte eà peut être livré via le support. Dans le cas des facteurs de stress physiques tels que la température, l&#39;agitation ou l&#39;illumination, la culture doit être conçu en conséquence. </li></ol></li></ol> 3. Culture initiale <ol><li> Inoculer une seule colonie de type sauvage E. coli dans un tube à essai de 15 ml contenant 4 ml de milieu initial. </li><li> Incuber le tube à essai dans un incubateur à agitation par secousses pendant 12 heures à 37 ° C et à 220 tours par minute. </li><li> transfert aseptique 1 ml de préculture au pot chemostat. </li><li> Incuber le pot de chemostat, prévoyant l&#39;aération (air 50 ml / min) et l&#39;agitation (200 rpm), à 37 ° C pendant 6 heures. </li></ol> 4. Stress Adaptation <ol><li> Aseptique connecter l&#39;extrémité du tube de silicium à partir des pompes à la jarre de chemostat. </li><li> Démarrer la pompe de sortie (10 ml / h ou plus) et recueillir la culture. Remarque: La culture doit être en phase exponentielle, généralement 4-8 heures après la culture initiale. </li><li> ChEck la densité optique (600 nm) de la culture de la tubulure de sortie. </li><li> Démarrer la pompe d&#39;entrée (10 ml / h, ce qui correspond à un taux de dilution de 0,1 h -1). </li><li> Vérifier la densité optique de la culture à 600 nm à partir de la tubulure de sortie toutes les 24 heures. </li><li> Faire fonctionner le chemostat pendant 96 heures (chiffre d&#39;affaires de 9,6 fois) ou plus. Si la densité optique est stable, échanger le réservoir contenant le milieu de stress élevé. Si la densité optique est inférieure à 0,2, arrêter la pompe d&#39;entrée d&#39;alimentation pendant 6 heures. Redémarrez la pompe d&#39;entrée et vérifier que la densité optique est supérieure à 0,2. </li><li> Augmenter graduellement la concentration du facteur de stress en changeant à un réservoir contenant une concentration plus élevée de facteur de stress. </li><li> Prélever des échantillons de la culture adaptée chaque fois qu&#39;il atteint une étape importante (par exemple, une souche adaptée à 100 g / L stress succinate), et un magasin pour une analyse génomique. </li><li> Pour le stockage de l&#39;échantillon, mélanger l&#39;échantillon de culture (0,5 ml) avec un stérilisée 80% de glycérol solutisur (0,5 ml) et le stocker à -80 ° C. Remarque: si le micro-organisme acquiert une capacité de dégrader le facteur de stress au cours du procédé ALE, la concentration du facteur de force dans le récipient de fermentation ne sont pas les mêmes que dans le réservoir frais. </li></ol> 5. unique colonie d&#39;isolement de la souche adaptée au stress <ol><li> Préparer le milieu de plaque de gélose (1,6% de gélose) contenant le même facteur de stress et à la même concentration du milieu. </li><li> La culture de la plaque de sortie (0,1 ml) à partir du chemostat, et incuber à 37 ° C pendant 16 heures. </li><li> Prélever des colonies uniques à partir de la plaque à l&#39;aide d&#39;un cure-dent stérile et inoculer 15 ml dans les tubes à essai contenant le même facteur de stress et à la même concentration que dans le milieu chémostat, et laisser incuber pendant 6 heures. </li><li> Transférer 1 ml de bouillon de culture dans un erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de milieu. Récolte 0,5 ml du bouillon de culture, toutes les 1 h, et de mesurer la DO à 600 nm. Comparer le taux de l&#39;strai adapté de croissancen à celle de la souche de type sauvage étant donné le stresseur. </li></ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
<li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15(2014).</li>
<li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li>
<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
<li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+dynamics+during+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les microorganismes sont capables d&#39;adapter à presque tous les environnements en raison de leur taux de croissance rapide et de la diversité génétique. évolution de laboratoire Adaptive permet des micro-organismes à évoluer dans des conditions conçues, ce qui fournit un moyen de sélectionner les organismes individuels hébergeant des mutations spontanées qui sont bénéfiques dans les conditions données. La technique de chemostat est plus robuste pour réaliser l&#39;évolution entraînée arti...

Les microorganismes peuvent survivre et s&#39;adapter à des environnements divers. En cas de stress sévère, l&#39; adaptation peut se produire via l&#39; acquisition de phénotypes bénéfiques par des mutations génomiques aléatoires et la sélection positive ultérieure 1-3. Par conséquent, les cellules microbiennes peuvent adapter en changeant métabolique ou les réseaux de régulation pour une croissance optimale, qui est appelé «l&#39;évolution adaptative&quot;. tendances microbiennes importantes récentes, telles que les épidémies de superbactéries et l&#39;apparition de souches microbiennes robustes, sont très étroitement liés à l&#39;évolution adaptative dans des conditions stressantes. Dans des conditions de laboratoire définies, nous sommes en mesure d&#39;étudier les mécanismes de l&#39;évolution moléculaire et même de contrôler la direction de l&#39;évolution microbienne pour diverses applications. Contrairement à des organismes multicellulaires, les organismes unicellulaires sont bien adaptés à l&#39;évolution de laboratoire adaptatif (ALE) pour les raisons suivantes: ils régénèrent rapidement, ils maintiennent des populations importantes, et il est facile de créer et maintenir homenvironnements ogeneous. Combiné avec les récentes avancées dans les techniques de séquençage de l&#39;ADN et des technologies à haut débit, ALE permet l&#39;observation directe des changements génomiques qui conduisent à des changements réglementaires systémiques. la dynamique de mutation et la diversité de la population sont également observables. Stratégies de génie génétique peuvent être déterminées à partir de l&#39;analyse des souches d&#39;ale 4,5. Culture Chemostat est une méthode utilisée pour obtenir des cellules à l&#39; état ​​stable et d&#39; augmenter la productivité dans les processus de fermentation 6. Du milieu frais est ajouté et le bouillon de culture est récolté pendant le processus (celui-ci comprend en moyenne et la biomasse). Culture chemostat à long terme, cependant, modifie la productivité à l&#39; état ​​stable de la culture et provoque l&#39;accumulation de mutations spontanées et la sélection lors de la culture (figure 1a). Sous diverses pressions de sélection (facteurs de stress), l&#39;accumulation de mutations est améliorée. Une augmentation progressive de stress dans un long terme<html> chémostat prévoit une sélection continue de mutations qui agissent contre les facteurs de stress donnés, tels que la température, le pH, la pression osmotique, des substances nutritives inanition, l&#39; oxydation, des produits finaux toxiques, etc. , le transfert des colonies à partir d&#39; un milieu solide et le transfert en série à partir d&#39; un milieu liquide (répété culture discontinue) permettent également aux chercheurs d&#39;obtenir des micro - organismes évolués (figure 1b et 1c). Bien que la culture chemostat nécessite des méthodes compliquées, la piscine de la diversité (nombre de répétitions et de la taille de la population) est supérieure à celle obtenue par transfert des colonies et des techniques de transfert de série. L&#39;exposition au stress stable à des cellules individuelles et une diminution de la variation de l&#39;état cellulaire pendant la culture chemostat (état stable) sont les autres avantages de l&#39;ALE par rapport aux techniques basées sur la culture par lots. ALE Le stress induit par des Escherichia coli soumis à des conditions succinate élevées est introduit dans cet article. iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Méthodes d&#39;évolution de laboratoire adaptatif (A) Chemostat;. (B) transfert en série; (C) transfert des colonies. Les chiffres supérieurs illustrent le concept des méthodes pour ALE, et les chiffres inférieurs illustrent le nombre de cellules qui se sont développées au cours ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Fermenteur mini-chémostat</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>fabriqué par commande spéciale</td></tr><tr><td>tube en silicone La taille du</td> tube <td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 13</td><td>peut être modifiée en fonction du taux de dilution et de la taille du pot de fermenteur.</td></tr><tr><td>bocal réservoir</td><td>Bellco</td><td>Media bouteille de stockage</td><td>20 L</td></tr><tr><td>produits chimiques</td><td>Sigma-Aldrich-réactif</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>ACS réactif</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>pour la biologie moléculaire, adapté à la culture cellulaire, &ge ; 99,5 %</td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>réactif ACS, &ge ; 99 %</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot ; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98.5-101 %</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>réactif ACS, &ge ; 99 %</td></tr><tr><td>MgSO4&middot ; 7H2O</td><td>Réactif Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>ACS, &ge ; 98 %</td></tr> <tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>réactif ACS, &ge ; 96 %</td></tr> <tr><td>thiamine&middot ; HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>grade réactif, &ge ; 99 %</td></tr><tr><td>Na2&middot ; succinate&middot ; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &ge ; 99 %</td></tr></tbody></table>

procédure d&#39;adaptation laboratoire de l&#39;évolution de microorganismes utilisation chémostat

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

L’évolution naturelle implique une diversité génétique telle que le changement environnemental et une sélection entre de petites populations. L’évolution adaptative en laboratoire (ALE) fait référence à la situation expérimentale dans laquelle l’évolution est observée à l’aide d’organismes vivants dans des conditions contrôlées et des facteurs de stress ; Les organismes sont ainsi artificiellement forcés d’effectuer des changements évolutifs. Les micro-organismes sont soumis à une variété de facteurs de stress dans l’environnement et sont capables de réguler certaines protéines induites par le stress pour augmenter leurs chances de survie. Les mutations spontanées naturelles entraînent des changements dans le génome d’un micro-organisme qui affectent ses chances de survie. L’exposition à long terme à la culture des chémostats provoque une accumulation de mutations spontanées et rend dominante la souche la plus adaptable. Par rapport aux méthodes de transfert de colonies et de transfert en série, la culture de chimiostats implique le plus grand nombre de divisions cellulaires et, par conséquent, le plus grand nombre de populations diverses. Bien que la culture du chémostat pour l’ALE nécessite des dispositifs de culture plus complexes, elle demande moins de main-d’œuvre une fois l’opération commencée. Des analyses comparatives génomiques et transcriptomiques de la souche adaptée fournissent des indices évolutifs sur la façon dont les facteurs de stress contribuent aux mutations qui surmontent le stress. L’objectif de cet article est d’accélérer l’évolution des micro-organismes dans des conditions de laboratoire contrôlées.

Pour haute succinate adaptation au stress, le type sauvage E. coli W3110 a été cultivé dans un chemostat à D = 0,1 h -1 pendant 270 jours (Figure 2). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Figure 2: High-succinate adaptation au stress de E. coli W3110 en utilisant la culture chemostat. flèches minces indiquent les ...

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir adaptatif évolution en laboratoire de micro-organismes dans des conditions à l&#39;aide de la culture chemostat. En outre, l&#39;analyse génomique de la souche évoluée est discutée.

Procédure d&#39;adaptation Laboratoire de l&#39;évolution de Microorganismes Utilisation chémostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

L'objectif général de cette procédure est de permettre à un microorganisme d'évoluer en conditions de laboratoire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que les relations fonctionnelles avec les glandes surrénales, les réponses au stress, l'ingénierie métabolique, et bien sûr, l'évolution. Le principal avantage de cette technique réside dans la sélection continue du descendant le mieux adapté aux conditions spécifiques de laboratoire.Commencez cette procédure par la préparation du matériel, ainsi que du milieu initial, du milieu de stress et du milieu de stress élevé, comme décrit dans le protocole écrit. Inoculez une colonie unique ou une souche sauvage d’E.coli dans un tube à essai de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu initial. Incubez le tube à essai dans un incubateur agité pendant 12 heures à 37 degrés Celsius et 220 tr/min.Incuber le flacon du chimostat en assurant l'aération et l'agitation à 37 degrés Celsius pendant six heures. Après l'incubation, relier aseptiquement l'extrémité du tube en silicone des pompes au flacon du chimostat. Transférer aseptiquement un millilitre de pré-culture dans le flacon du chimostat.Démarrer la pompe de sortie et recueillir la culture en phase exponentielle. Vérifier la densité optique à 600 nanomètres de la culture provenant du tube de sortie. Ensuite, démarrer la pompe d'entrée.Vérifiez la densité optique de la culture à 600 nanomètres à partir du tube de sortie toutes les 24 heures. Après avoir fait fonctionner le chimostat pendant 96 heures, soit un renouvellement complet de 9,6 fois, remplacez le réservoir par le milieu à forte contrainte de concentration la plus faible. Lorsque vous remplacez le réservoir par un milieu à contrainte plus élevée, les cellules peuvent subir un choc.Si la densité cellulaire est trop faible, arrêtez l'alimentation avec le milieu à stress élevé pendant un certain temps afin de restaurer la densité cellulaire. Si la densité optique est inférieure à 0,2, arrêtez la pompe d'entrée pendant six heures. Redémarrez la pompe d'entrée et vérifiez que la densité optique est supérieure à 0,2.Augmentez progressivement la concentration du facteur de stress en passant de manière incrémentielle à un réservoir contenant une concentration plus élevée de ce facteur. Prélevez des échantillons de la culture adaptée chaque fois qu'elle atteint une étape clé d'adaptation au stress et conservez-les pour des analyses génomiques ultérieures. Pour le stockage des échantillons, mélangez 0,5 millilitre d'échantillon de culture avec 0,5 millilitre d'une solution stérilisée de glycérol à 80 % et conservez-les à 80 degrés Celsius.Préparez un milieu solide à 1,6 % contenant le même facteur de stress à la même concentration que dans le milieu. Déposez 0,1 millilitre de la culture du flux de sortie du chimostat sur la boîte de Petri et incubez à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Après l'incubation, prélèvez des colonies isolées à l’aide d’un cure-dent stérile et inoculez-les dans des tubes à essai de 15 millilitres contenant le même facteur de stress et à la même concentration de milieu que dans le chimostat.Incuber pendant six heures. Transférer un millilitre du bouillon de culture dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres contenant 50 millilitres de milieu. Récolter 0,5 millilitre du bouillon de culture chaque heure et mesurer la densité optique à 600 nanomètres.Comparer la vitesse de croissance de la souche adaptée à celle de la souche sauvage en présence du facteur de stress. La souche sauvage d'E.coli a été soumise à une évolution en condition de stress élevé en succinate pendant 270 jours, ce qui correspond à près de 930 générations. À chaque ajout d'un stress plus élevé en succinate, la concentration en biomasse a été immédiatement réduite, puis rétablie.Voici un schéma du chimostat avec un mutant tolérant au fort stress causé par le succinate. La plupart des cellules de type sauvage sont éliminées dans les conditions de stress, tandis que le mutant se développe davantage. En fin de compte, la population du mutant descendant augmente.La deuxième et la troisième mutation sont continuellement sélectionnées et finissent par dominer le chimostat. Cette figure montre que la souche adaptée a poussé sans délai dans des conditions de stress élevées en succinate, tandis que la souche sauvage n’a pas poussé. Une stratégie similaire peut être appliquée à l’évolution adaptative en laboratoire en utilisant un chimostat avec une variation de facteurs de stress.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et faire évoluer le micro-organisme dans une condition spécifique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques mois. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de ne pas éliminer les cellules du chimostat en appliquant un stress trop élevé d’un seul coup, et de penser à vérifier la densité optique chaque jour.Après avoir suivi cette procédure, des méthodes telles qu'une analyse du génome et une analyse du transcriptome peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quelle mutation contribue à l'évolution de la tolérance au stress ?

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JoVE Journal

Genetics

Génétique

Source : Jian, X., et al., Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre l’utilisation d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes pour favoriser l’évolution adaptative des bactéries vers la tolérance au méthanol. En mélangeant des cultures bactériennes modifiées avec un milieu à fort stress de méthanol et en les segmentant en microgouttelettes, le système...

Évolution adaptative de bactéries à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes

Source : Jeong, H., et al. Procédure pour l’évolution adaptative en laboratoire des micro-organismes utilisant un chimiot. J. Vis. Exp. (2016).Cette vidéo montre l’isolement sélectif et la croissance de bactéries adaptées au stress issues d’une culture exposée à des conditions de stress prolongées. La culture est placée sur un agar contenant un facteur de stress, et une seule colonie est sélectionnée pour inoculer un milieu liquide avec le stresseur. L’absorption est mesurée à intervalles...

Isolement des bactéries adaptées au stress par sélection de colonie unique

taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l'étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Nous avons développé et validé un ensemble de petite empreinte de chemostats miniatures construits à partir de pièces facilement disponibles pour un faible coût. Évolution résulte physiologiques et expérimentales sont similaires à chemostats plus grand volume. Le tableau ministat fournit une plate-forme compacte, peu coûteux et accessible pour les expériences en chémostat traditionnels, la génomique fonctionnelle et les applications de criblage chimique.

Conception et utilisation des tableaux chémostat multiplexés

Nous décrivons un morbidostat configurable à faible coût qui permet de caractériser la résistance aux antibiotiques en ajustant dynamiquement la concentration du médicament. Le dispositif peut être intégré à une plate-forme microfluidique multiplexée. L’approche peut être étendue aux études de résistance aux antibiotiques en laboratoire.

Conception et utilisation d&#39;un faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques

Le Framework eVOLVER permet une culture microbienne continue à haut débit avec une haute résolution et un contrôle dynamique sur les paramètres expérimentaux. Ce protocole démontre comment appliquer le système pour mener une expérience de conditionnement physique complexe, guidant les utilisateurs sur la programmation de contrôle automatisé sur de nombreuses cultures individuelles, la mesure, la collecte et l’interaction avec les données expérimentales en temps réel.

Conception automatisée, à haut débit, des expériences de croissance cellulaire continue à l’aide d’eVOLVER

Ce protocole décrit comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative. MMC peut cultiver et sous-cultiver des micro-organismes automatiquement et en continu et surveiller en ligne leur croissance avec un débit relativement élevé et une bonne parallélisation, réduisant ainsi la consommation de main-d’œuvre et de réactifs.

Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC)

Ce protocole décrit comment maintenir l’expérience d’évolution à long terme d’Escherichia coli (LTEE) en effectuant ses transferts quotidiens et ses gels périodiques et comment mener des tests de compétition pour mesurer les améliorations de la condition physique chez les bactéries évoluées. Ces procédures peuvent servir de modèle aux chercheurs qui commencent leurs propres expériences d’évolution microbienne.

Transferts quotidiens, archivage des populations et mesure de la valeur adaptative dans l’expérience d’évolution à long terme avec Escherichia coli

Ici, nous présentons un protocole d’évolution expérimental pour l’adaptation chez les thermophiles en utilisant des thermomélangeurs de paillasse peu coûteux et économes en énergie comme incubateurs. La technique est démontrée par la caractérisation de l’adaptation à la température chez Sulfolobus acidocaldarius, un archéon avec une température de croissance optimale de 75 °C.

Adaptation aux extrêmes de la vie : évolution expérimentale avec l’archéon extrêmophile Sulfolobus acidocaldarius

Nous présentons un protocole pour le dispositif de culture continue millifluidique (MCCD), qui permet la culture de populations bactériennes sous des conditions constantes de pauvres nutriments (jusqu’à des centaines de concentrations nanomolaires) ou des fluctuations temporelles de nutriments sur une échelle de temps intime.

Dispositif millifluidique en culture continue pour l’étude d’Escherichia coli dans des conditions nutritives faibles et fluctuantes

Apprenez l'évolution adaptative en laboratoire de microorganismes par culture en chémostat avec E. coli. Cette méthode permet d'étudier les réponses au stress et l'ingénierie métabolique.

Procédure d'adaptation Laboratoire de l'évolution de Microorganismes Utilisation chémostat

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