A High Throughput, multiplexée et ciblée protéomique CSF Assay à Quantifier neurodégénératifs Biomarqueurs et apolipoprotéine E isoformes Status

L’objectif global de cette méthode est de quantifier rapidement et à moindre coût plusieurs biomarqueurs dans le liquide céphalorachidien, ou LCR, afin d’évaluer leur utilisation pour le diagnostic et le suivi du traitement. Il s’agit d’un nouveau test qui nous permet de mesurer des biomarqueurs qui n’étaient pas possibles auparavant. Et nous pensons que cela peut être utilisé à des fins de diagnostic et aussi pour différencier différentes maladies neurodégénératives et potentiellement aussi donner des informations pronostiques.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est conçue pour être rapide, simple dans la préparation des échantillons, très spécifique et rentable pour l’application en laboratoire clinique. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie ou au diagnostic, car ce test à haut débit peut être utilisé dans de futurs essais cliniques pour de nouvelles thérapies en neurodégénérescence. Cette méthodologie peut également être appliquée à d’autres maladies et tissus, tels que l’urine pour les troubles rénaux, le plasma pour la cardiomyopathie et les cellules pour la pluripotence.

Pour commencer cette procédure, remplacez en suspension les peptides synthétiques souhaités à une concentration d’origine d’un milligramme par millilitre, conformément aux instructions du fabricant. Préparez une dilution sur 10 du peptide à partir de la concentration de stock, et regroupez 1 000 picomoles de chaque peptide dans un tube de microcentrifugation à faible liaison. Séchez l’échantillon de peptide mélangé dans un concentrateur SpeedVac.

Une fois terminé, conservez l’échantillon à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, aliquote 100 microlitres de LCR dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison. Lyophiliser les échantillons de LCR.

Remettre en suspension une aliquote de l’échantillon de peptide mélangé dans le tampon de digestion pour obtenir des concentrations de 10 et un picomole par microlitre. Maintenant, ajoutez l’échantillon de peptide mélangé dans les aliquotes lyophilisées de 100 microlitres de LCR, à des concentrations picomolaires de zéro, un, deux, cinq, 10 et 15. Ensuite, ajoutez 20 nanogrammes de protéines intactes non apparentées pour agir comme un étalon interne et contrôler l’efficacité de la digestion de la trypsine.

Ajouter un tampon de digestion aux aliquotes du LCR jusqu’à un volume final de 20 microlitres et vortex les échantillons. Ensuite, digérez les échantillons selon le protocole standard en ajoutant 1,5 microlitre de dithiothréitol et en agitant à température ambiante pendant une heure. Ensuite, ajoutez trois microlitres d’iodoacétamide aux échantillons et agitez à température ambiante pendant 45 minutes dans l’obscurité.

Ensuite, ajoutez 165 microlitres d’eau doublement distillée. Ajouter 10 microlitres d’une solution de trypsine modifiée de 0,1 microgramme par microlitre, de qualité séquençage, remise en suspension dans un tampon de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires aux échantillons. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Ensuite, arrêtez la digestion en congelant les échantillons. Après décongélation, le LCR se digère sur de la glace, centrifuger à 16 000 fois g pendant 10 minutes. Une fois terminé, transférez 60 microlitres de chaque digest dans un insert en verre de 300 microlitres.

À l’aide d’un système LC-MS, équipé d’une colonne UPLC C18, injectez la concentration la plus élevée à partir du point de la courbe standard en utilisant un gradient linéaire de 10 minutes, de un à 40 % d’acétonitrile. Une fois l’exécution terminée, ouvrez le chromatogramme résultant dans le logiciel et notez le temps de rétention et les deux transitions les plus intenses par peptide. Sur la base de ces informations, mettez à jour une méthode de surveillance à réactions multiples ou MRM précédemment créée avec des canaux temporisés pour mesurer les peptides.

Pour maintenir la sensibilité, conservez chaque canal avec des points par pic supérieurs à huit et un temps de séjour supérieur à 0,01 seconde pour au moins une transition pour chaque peptide. Inclure les retards de solvant dans la méthode MRM en sélectionnant les retards de solvant dans les événements de méthode dans le fichier de méthode MS. Il est essentiel de faire correspondre correctement le pic correct dans une méthode HPLC courte.

Cela peut être fait en utilisant les peptides enrichis dans la matrice qui sont utilisés pour une courbe standard et en observant les multiples transitions pendant le développement de la méthode. Enfin, vérifiez manuellement l’annotation des données pour vous assurer de son exactitude. Analysez chaque peptide et rapportez-le à un étalon interne approprié marqué par un isotope stable.

Un chromatogramme des marqueurs peptidiques significatifs du dosage du LCR à haut débit est présenté ici. Les données fournissent des rapports normalisés par rapport à l’étalon interne marqué par un isotope stable pertinent, qui peuvent être utilisés pour déterminer les concentrations absolues de LCR et analysés statistiquement pour détecter les changements dans les échantillons cliniques. La quantification des 74 peptides inclus dans ce test de LCR a révélé que 25 étaient significativement altérés dans le LCR des patients atteints de démence, et les résultats des marqueurs de démence pro-orexine et de la protéine de type chitinase-3 YKL sont présentés ici.

L’ApoE4 est un facteur de risque connu de la maladie d’Alzheimer, et la détection des isoformes de l’ApoE est basée sur la détection des peptides correspondants pour les changements d’acides aminés des isoformes E2 et E4. Le modèle de pic attendu pour chaque combinaison d’isoformes est illustré ici. Une fois la méthode mise en place, le test peut être effectué en une journée s’il est effectué correctement. Après le développement de cette méthode, il a été possible de mesurer un nouvel ensemble de biomarqueurs avec une sensibilité et une spécificité analytiques élevées, ce qui permettra aux chercheurs d’évaluer les maladies neurodégénératives d’une nouvelle manière.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir et d’optimiser un test MRM pour la sensibilité et la spécificité. N’oubliez pas que travailler avec du DTE, des termites, de l’acide formique et des tissus humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants, doivent être appliquées pendant cette procédure.