Définition Substrat Spécificités pour lipase et phospholipase candidats

L'objectif général de cette procédure est d'accélérer la détection de substrats physiologiques pour des lipases et phospholipases potentielles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'entomologie, telles que la manière dont les phospholipases contribuent au remaniement des lipides dans les membranes biologiques. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'optimisation de l'activité enzymatique et la recherche du substrat naturel de l'enzyme peuvent être réalisées indépendamment l'une de l'autre.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la spécificité du substrat des lipases et des phospholipases bactériennes, elle peut également être modifiée pour étudier les hydrolases d'autres organismes modèles. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons cherché une activité enzymatique capable de dégrader le lipide membranaire intrinsèque, la phosphatidylcholine, chez *Rhizobium meliloti*. Pour préparer des extraits protéiques sans cellules, décongelez les suspensions de cellules bactériennes et conservez-les sur de la glace.

Ensuite, faire passer les suspensions cellulaires trois fois à travers une cellule de pression froide à 20 000 livres par pouce carré. Éliminer les cellules intactes et les débris cellulaires par centrifugation à 5 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, préparer des aliquotes de 100 et 500 microlitres du surnageant pour les analyses ultérieures.

Configurer le dosage enzymatique précédemment optimisé en utilisant les schémas de pipetage indiqués dans le protocole écrit. Pour une couverture initiale de différentes activités enzymatiques, utiliser des substrats artificiels produisant un composé coloré après hydrolyse, tels que les dérivés du para-nitrophénol ou du PNP. Suivre la cinétique d'augmentation de l'absorbance à 405 nanomètres, due à la formation de PNP, dans un spectrophotomètre à 30 degrés Celsius pendant une période de cinq minutes.

Enfin, effectuez les calculs comme décrit dans le protocole écrit. Pour le marquage radioactif des lipides, préparez une pré-culture d'un organisme d'intérêt pendant la nuit dans cinq millilitres de milieu de culture souhaité et faites-la croître à 30 degrés Celsius. À partir de la pré-culture, ensemencez 20 millilitres de milieu frais dans un flacon de culture de 100 millimètres afin d'obtenir une densité optique initiale à 620 nanomètres de 0,3 pour la culture.

Ensuite, transférez un aliquot de un millilitre de la culture dans un tube stérile en polystyrène de 14 millilitres à fond rond, en conditions stériles. Ajoutez un microcurie d'acétate 114 c au milieu de culture d'un millilitre. Incubez ensuite la culture liquide sous agitation à 30 degrés Celsius pendant une période de 24 heures.

À la fin de la période d'incubation, transférer la culture dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger à 12 000 ×g à température ambiante pendant cinq minutes. Resuspendre le culot dans 100 microlitres d'eau. À ce stade, conserver la suspension cellulaire à −20 degrés Celsius ou poursuivre immédiatement l'extraction des lipides polaires.

Pour effectuer l'extraction des lipides polaires, ajouter 375 microlitres d'une solution de méthanol sur chloroforme à un rapport de deux pour un à 100 microlitres de suspension cellulaire aqueuse. Vortexer l'échantillon pendant 30 secondes avant de l'incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après l'incubation, centrifuger pendant cinq minutes à 12 000 ×g à température ambiante.

Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 125 microlitres de chloroforme et 125 microlitres d'eau au surnageant. Après avoir vortexé pendant 30 secondes, centrifugez l'échantillon pendant une minute à 12 000 ×g à température ambiante.

Transférez la phase inférieure de chloroforme dans un tube propre. Ensuite, sèchez la solution à l’aide d’un courant d’azote gazeux. Dissolvez les lipides desséchés dans 100 microlitres de solution de chloroforme dans le méthanol.

Pour la séparation des lipides neutres polaires par chromatographie sur couche mince, appliquez des aliquotes de trois microlitres des échantillons lipidiques sur une plaque d'aluminium recouverte de gel de silice pour chromatographie sur couche mince haute performance, en commençant à deux centimètres des bords de la plaque. Si plusieurs échantillons sont analysés en chromatographie unidimensionnelle, maintenez une distance d'au moins 1,5 centimètre entre les différents points d'application des échantillons. Transférez la phase mobile dans une chambre de développement pour CCM, préalablement tapissée intérieurement de papier chromatographique.

Couvrir avec une plaque de verre pour permettre à la chambre de saturer pendant 30 minutes. Transférer la feuille d’aluminium à gel de silice HPTLC avec les échantillons lipidiques séchés dans la chambre. Laisser la plaque migrer pendant 30 minutes dans une chambre fermée avant de retirer la plaque.

Ensuite, laissez les solvants s'évaporer sous hotte à flux laminaire pendant deux heures. Une fois que la plaque de CCM développée est sèche, incubez-la avec un écran de luminescence stimulable par la lumière dans une cassette fermée pendant trois jours. Puis, exposez l'écran incubé à un scanner PSL et acquérez une image virtuelle des lipides marqués au radioisotope séparés.

Pour déterminer l'activité de la diacylglycérol (DAG) lipase, ajoutez d'abord 5 000 CPM de DAG marqué au 14 C dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez également une solution de Triton X-100 au tube et mélangez par vortex. Séchez la solution sous un courant d'azote.

Pour un dosage final de 100 microlitres, ajouter du tampon Tris-HCl, une solution de chlorure de sodium et de l'eau bi-distillée. Vortexer pendant cinq secondes. Initier la réaction en ajoutant cinq microlitres d'enzyme à la solution.

Incuber la solution à 30 degrés Celsius pendant quatre heures. Arrêter la réaction par l'ajout de 250 microlitres de méthanol et de 125 microlitres de chloroforme, avant d'extraire les lipides comme décrit précédemment dans cette vidéo. Passer ensuite à l'analyse des lipides neutres polaires par CLT1D et imagerie PSL ultérieure comme auparavant.

Bien que la phospholipase prédite SMc01003 montre une activité avec les esters acyles artificiels de para-nitrophénol, cette activité n'est que deux à trois fois supérieure à l'activité de fond présente dans les extraits sans cellules d'Escherichia coli, dans lesquels aucun gène étranger n'avait été exprimé. Cela indique que les esters acyles de para-nitrophényle ne semblent pas être de bons substrats pour SMc01003. Alors que les extraits sans cellules d'E. coli ne peuvent pas dégrader le diacylglycérol, les extraits de souches dans lesquelles la phospholipase prédite, SMc01003, avait été exprimée, entraînent une dégradation du diacylglycérol.

Bien que SMc01003 ait été prédit comme étant une phospholipase, il s'agit en réalité d'une diacylglycérol lipase qui dégrade le diacylglycérol en monoacylglycérol et un acide gras. Ensuite, il dégrade le monoacylglycérol en glycérol et un autre acide gras. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques semaines si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'optimiser les activités enzymatiques des lipases et des phospholipases, ainsi que de la poursuite de la recherche de leurs substrats physiologiques. Un avantage crucial de cette procédure est que l'optimisation de l'activité enzymatique peut être dissociée de la recherche du substrat naturel de l'enzyme. N'oubliez pas que le travail avec des solvants organiques ou des substances radioactives peut être extrêmement dangereux et que les précautions nécessaires doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.