Définition Substrat Spécificités pour lipase et phospholipase candidats

L’objectif global de cette procédure est d’accélérer la détection de substrats physiologiques pour les lipases et les phosopholipases potentielles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’entomologie, telles que la façon dont les phospholipases contribuent au remodelage des lipides dans les membranes biologiques. Le principal avantage de cette technique est que l’optimisation de l’activité enzymatique et la recherche du substrat naturel de l’enzyme peuvent être effectuées indépendamment.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la spécificité du substrat des lipases bactériennes et des phospholipases, elle peut également être modifiée pour étudier les hydrolases de tout autre organisme modèle. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons recherché une activité enzymatique qui pourrait dégrader le lipide membranaire intrinsèque phosphatidylcholine inorhizobium meliloti. Pour préparer des extraits de protéines acellulaires, décongelez les suspensions de cellules bactériennes et conservez-les sur de la glace.

Ensuite, passez les suspensions de cellule trois fois dans une cellule de pression froide à 20 000 livres par pouce carré. Retirez les cellules intactes et les débris cellulaires par centrifugation à 5 000 fois g pendant 30 minutes, à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, préparez des aliquotes de 100 et 500 microlitres à partir du surnageant pour une analyse ultérieure.

Configurez le dosage enzymatique précédemment optimisé à l’aide des schémas de pipetage présentés dans le protocole texte. Pour une première couverture des activités enzymatiques distinctes, utilisez des substrats artificiels qui donnent un produit coloré lors de l’hydrolyse, tels que des dérivés de para-nitrophénol ou de PNP. Suivez l’évolution temporelle d’une augmentation de l’absorbance à 405 nanomètres, due à la formation de PNP dans un spectrophotomètre à 30 degrés Celsius sur une période de cinq minutes.

Enfin, effectuez les calculs décrits dans le protocole texte. Pour le radiomarquage des lipides, préparez une pré-culture nocturne d’un organisme d’intérêt dans cinq millilitres du milieu de culture souhaité et cultivez-le à 30 degrés Celsius. A partir de la pré-culture, inoculer dans 20 millimètres de milieu frais dans une fiole de culture de 100 millimètres, pour obtenir une densité optique initiale à 620 nanomètres de 0,3 pour la culture.

Ensuite, transférez une aliquote d’un millilitre de la culture dans un tube stérile à fond rond en polystyrène de 14 millilitres dans des conditions stériles. Ajouter une microcurie d’acétate de 114 c à la culture d’un millilitre. Ensuite, incubez la culture liquide sous agitation à 30 degrés Celsius pendant une période de 24 heures.

À la fin de la période d’incubation, transférez la culture dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et centrifugez-la à 12 000 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Remettez le granulé en suspension dans 100 microlitres d’eau. À ce stade, conservez la suspension cellulaire à moins 20 degrés Celsius ou poursuivez immédiatement l’extraction des lipides polaires.

Pour effectuer l’extraction des lipides polaires, ajoutez 375 microlitres d’une solution de méthanol à chlore à deux pour un aux 100 microlitres de suspension cellulaire aqueuse. Faites tourbillonner l’échantillon pendant 30 secondes avant de l’incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après l’incubation, centrifuger pendant cinq minutes à 12 000 fois g à température ambiante.

Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 125 microlitres de chloroforme et 125 microlitres d’eau au surnageant. Après avoir tourbillonné pendant 30 secondes, centrifugez l’échantillon pendant une minute à 12 000 fois g à température ambiante.

Transférez la phase inférieure de chloroforme dans un tube frais. Ensuite, séchez la solution avec un courant d’azote gazeux. Dissoudre les lipides séchés dans 100 microlitres de solution de chloroforme à méthanol.

Pour la séparation des lipides polaires neutres par chromatographie sur couche mince, appliquez trois aliquotes d’un microlitre des échantillons de lipides, sur une feuille d’aluminium en gel de silice par chromatographie sur couche mince à haute performance, en commençant à deux centimètres des bords de la plaque. Si plusieurs échantillons sont analysés par chromatographie unidimensionnelle, gardez une distance d’au moins 1,5 centimètre entre les différents points d’application de l’échantillon. Transférez la phase mobile dans une chambre de développement TLC, recouverte intérieurement de papier de chromatographie.

Couvrir d’une plaque de verre pour laisser la chambre saturer pendant 30 minutes. Transférez la feuille d’aluminium HPTLC Silica Gel avec les échantillons de lipides séchés dans la chambre. Laissez la plaque se développer pendant 30 minutes dans une chambre fermée avant de la retirer.

Ensuite, laissez sécher les solvants dans une hotte à flux pendant deux heures. Une fois que la feuille de CCM développée est sèche, incubez-la avec un écran de luminescence photostimulable dans une cassette fermée pendant trois jours. Ensuite, exposez le tamis incubé à un scanner PSL et acquérez une image virtuelle des lipides radiomarqués séparés.

Pour déterminer l’activité du diacylglycérol, ou DAG, la lipase, ajoutez d’abord 5 000 CPM de DAG 14 marqués au C dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez également une solution de Triton X-100 dans le tube et mélangez par vortex. Séchez la solution sous un jet d’azote.

Pour un dosage final de 100 microlitres, ajoutez un tampon Tris-HCl, une solution de chlorure de sodium et de l’eau bidistillée. Vortex pendant cinq secondes. Amorcez la réaction en ajoutant cinq microlitres d’enzyme à la solution.

Incuber la solution à 30 degrés Celsius pendant quatre heures. Stoppez la réaction par l’ajout de 250 microlitres de méthanol et de 125 microlitres de chloroforme, avant d’extraire les lipides comme décrit plus haut dans cette vidéo. Procéder à l’analyse des lipides polaires neutres par 1DTLC et à l’imagerie PSL ultérieure comme précédemment.

Bien que la phosopholipase SMc01003 prédite montre une activité avec des esters artificiels de para-nitrophénol acyle, l’activité n’est que le double ou le triple de l’activité de fond présente dans les extraits acellulaires d’Escherichia coli, dans lesquels aucun gène étranger n’a été exprimé. Cela indique que les esters de para-nitrophénylacyle ne semblent pas être de bons substrats pour SMc01003. Alors que les extraits acellulaires d’E.Coli ne peuvent pas dégrader le diacylglycérol, les extraits de souches dans lesquelles la phospholipase prédite, SMc01003, avait été exprimée, ont provoqué une dégradation du diacylglycérol.

Bien que SMc01003 ait été prédit comme étant une phospholipase, il s’agit en fait d’une diacylglycérol lipase qui dégrade le diacylglycérol en monoacylglycérol et en un acide gras. Il dégrade ensuite le monoacylglycérol en glycérol et en un autre acide gras. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques semaines si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’optimiser les activités enzymatiques des lipases et des phospholipases, et comment poursuivre la recherche de leurs substrats physiologiques. Un avantage crucial de cette procédure est que l’optimisation de l’activité enzymatique peut être séparée de la recherche du substrat enzymatique naturel. N’oubliez pas que travailler avec des solvants organiques ou des substances radioactives peut être extrêmement dangereux et que les précautions requises doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.