Name: Définition Substrat Spécificités pour lipase et phospholipase candidats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez une méthode computationnelle pour identifier les substrats physiologiques des lipases et phospholipases bactériennes. Cette technique optimise l'activité enzymatique et la recherche de substrats naturels de manière indépendante.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexique) (82614, 153998, 253549 et 178359 dans Investigación Científica Básica ainsi que 118 à Investigación en Fronteras de la Ciencia) et de Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Au cours des 20 dernières années, les génomes de nombreux organismes ont été séquencés et même si un grand nombre de données de séquence du génome a été générée, l&#39;interprétation fonctionnelle est à la traîne et entrave donc notre compréhension du fonctionnement du génome. fonctions de gènes dans les génomes sont souvent attribués en fonction de similarité avec des gènes de la fonction ou l&#39;apparition de motifs conservés connu. Cependant, la fonction précise d&#39;un gène donné est souvent inconnue. Surtout, pré...

Lipides à base de glycérol tels que triacylglycérols et (glycéro) phospholipides constituent importante et probablement les classes de lipides les plus connus 1. Triacylglycérols (TAG) sont des graisses ou des huiles, qui fonctionnent habituellement comme les lipides de stockage, et donc en tant que sources d&#39;énergie et de carbone potentiels. TAGs peuvent être dégradés par les lipases, qui sont souvent sécrétées par l&#39;organisme producteur à digérer TAGs externes et les rendre disponibles en tant que sources de carbone. En outre, les lipases ont été largement étudiés au cours des années en raison de leurs applications biotechnologiques importantes 2. En raison de leur nature amphiphile et leur forme quasi cylindrique, les propriétés des membranes formant (glycéro) phospholipides présentent et constituent généralement les principaux composants lipidiques d&#39;une membrane bicouche 3. Dans les micro - organismes simples, tels que la bactérie Escherichia coli, seules les trois principales variantes de groupe de tête, le phosphatidylglycérol (PG), cardiolipine (CL), et phosphatidylethanolamine (PE) sont rencontrées, mais il faut savoir que chacun d&#39;entre eux pouvant être substitué par un grand nombre de différentes chaînes d&#39;acyle gras en position sn -1 et sn -2 positions donnant lieu à un grand nombre d&#39;espèces moléculaires différentes 4 . D&#39;autres bactéries pourraient avoir d&#39;autres phospholipides, en plus ou au lieu. Par exemple, Sinorhizobium meliloti, une bactérie du sol, qui est capable de former une racine nodule symbiose fixatrice d&#39;azote avec la luzerne , des légumineuses (Medicago sativa), contient en outre au PE d&#39; un second phospholipide zwitterionique, la phosphatidylcholine (PC) 5. En outre, les lipides ne contenant pas de phosphore ou de glycérol peuvent faire partie amphiphile et la forme de la membrane cellulaire. Par exemple, des conditions de croissance du phosphore limitatif, en S. meliloti (glycéro- phospholipides) sont en grande partie remplacés par des lipides membranaires qui ne contiennent pas de phosphore, à savoir, les sulfolipides, les lipides ornithine et diacylglyceryl trimethylhomoserine (dgts) 6. Chez les bactéries, dgts est formé à partir de diacylglycérol (DAG) dans une voie à deux étapes 7 , mais la source pour la génération DAG était pas claire. Expériences pulse-chase ont suggéré que PC pourrait être un précurseur pour dgts 8 et en utilisant la méthodologie décrite dans ce manuscrit nous avons pu identifier une phospholipase C (PLCP, SMc00171) qui est formé dans des conditions de phosphore limitatif et qui peut convertir PC en DAG et phosphocholine 8. Dans une étude séparée, nous avons découvert que l&#39;acyl-CoA synthétase (FADD) mutant déficient de S. meliloti ou d&#39;Escherichia coli accumulée des acides gras libres lors de l&#39; entrée en phase stationnaire de croissance 9. Bien que ces acides gras semblent être dérivés à partir des lipides membranaires, l&#39;origine précise pour les acides gras libres ou de l&#39;enzyme (s) en les libérant sont pas connus. Encore une fois, en utilisant la stratégie décrite dans ce manuscrit, deux 10 (phospho) lipases patatine-like (SMc00930 et SMc01003) qui a contribué à la formation d&#39;acides gras libres dans S. meliloti 11 ont été prédit. De manière surprenante, SMc01003 DAG utilisé comme substrat le convertissant en monoacylglycérol et , enfin , du glycérol et des acides gras libres 11. Par conséquent, SMc01003 est une lipase DAG (DGLA). Bien qu&#39;un certain nombre d&#39;algorithmes existent pour prédire le potentiel (phospho) lipases 12,13, leur fonction précise et rôle physiologique est généralement pas connue. Nous présentons ici un protocole, pour cloner et surexpriment (phospho) lipases prédites ou potentiels. Ce manuscrit explique comment les dosages enzymatiques peuvent être développées et optimisées pour le (phospho) lipase surexprimé en utilisant des substrats chromogènes artificiels. Nous fournissons des exemples comment avec un test enzymatique optimisé réel (phospho) substrat de lipase peut être rencontré et comment ces résultats pourraient enrichir notre compréhension de la physiologie microbienne.

<table><tbody><tr><td>Chloroforme</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>Analyse TLC & Extraction lipidique</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>Analyse TLC & Extraction lipidique</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>Analyse TLC & Extraction lipidique</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>Analyse TLC & Extraction lipidique</td></tr><tr><td>Diéthyléther</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Essais enzymatiques</td></tr><tr><td>eau bidistillée</td><td>&nbsp ; N’importe lequel</td><td>&nbsp ; NA</td><td>Essais enzymatiques</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Essais enzymatiques</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Essais enzymatiques</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Essais enzymatiques</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Essais enzymatiques</td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Croissance bactérienne, 10 g de tryptone + 5 g d’extrait de levure + 10 g de NaCl par litre d’eau bidistillée</td></tr><tr><td>tryptone</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td><td>Extrait</td></tr> de <tr><td>levure de croissance</td> bactérienne <td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Croissance bactérienne</td></tr><tr><td>TY bouillon</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Croissance bactérienne, 8 g de tryptone + 3 g d’extrait de levure + 66 mg de CaCl2&#183 ; 2H2O par litre d’eau bidistillée</td></tr><tr><td>CaCl2&#183 ; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>isopropyl-&bêta ;-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Croissance bactérienne</td></tr><tr><td>Diéthanolamine</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>Phospholipase A2 serpent venom</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>Phospholipase C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrophényl phosphate</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>p-nitrophénylstéarate</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>p-nitrophényl dodécanoate</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>p-nitrophényle décanoate</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>p-nitrophényle palmitate</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>p-butyrate de nitrophényle</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>p-nitrophényl octanoate</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>Acide acétique, sel de sodium [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>Croissance bactérienne</td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>Aluminium HPTLC gel de silice 60 plaques. Plaques HPTLC en gel de silice de taille 20 x 20 cm, 25 feuilles.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>analyse TLC & Spectromètre d’extraction de lipides</td></tr><tr><td>UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Tests enzymatiques</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Dynamique moléculaire</td><td>NA</td><td>Photostimulable Scanner de luminescence</td></tr><tr><td>Compteur à scintillation polyvalent</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Quantification de la radioactivité</td></tr><tr><td>Cellule de pression française</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp ;</td><td>Bris des cellules</td></tr><tr><td>papier chromatographie 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>analyse TLC</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021notre</td><td>référence 11</td><td></td><td>a étudié la souche</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Cellules compétentes</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>souche d’expression protéique</td></tr><tr><td>vecteur pET9a Vecteur d’expression</td><td>protéique</td> <td>Novagen</td><td>69431</td></tr><tr><td>Vecteur pET17b Vecteur</td><td>d’expression protéique</td><td>Novagen</td><td>69663</td></tr><tr><td>Tube stérile en polystyrène à fond rond (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>radiomarquage des cultures bactériennes Tubes à</td></tr><tr><td>centrifuger en polypropylène (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Dosages enzymatiques</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycérol</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>étalon lipidique</td></tr><tr><td>L-&alpha ;-phosphatidylcholine, dipalmitoyl</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>étalon lipidique</td></tr><tr><td>DL-&alpha ;-monopalmitine</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>étalon lipidique</td></tr><tr><td>acide palmitique</td><td>Sigma</td><td>P0500</td> étalon <td>lipidique</td></tr></tbody></table>

définition substrat spécificités pour lipase et phospholipase candidats

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Microorganismes produisent un large spectre de (phospho) lipases qui sont sécrétées dans le but de faire des substrats extérieurs disponibles pour l&#39;organisme. Alternativement, d&#39;autres (phospho) lipases peuvent être associées physiquement l&#39;organisme producteur provoquant un chiffre d&#39;affaires de lipides intrinsèques et souvent donner lieu à un remodelage des membranes cellulaires. Bien que les potentiels (phospho) lipases peuvent être prédits avec un certain nombre d&#39;algorithmes lorsque la séquence de gène / protéine est disponible, la preuve expérimentale de l&#39;activité des enzymes, des spécificités de substrat et les fonctions physiologiques potentiels a souvent été obtenu. Ce manuscrit décrit l&#39;optimisation des conditions d&#39;essai pour les futurs (phospho) lipases avec des spécificités de substrat inconnus et comment employer ces conditions optimisées dans la recherche pour le substrat naturel d&#39;un (phospho) lipase respective. En utilisant des substrats chromogènes artificiels, tels que les dérivés p - nitrophényle, peuvent aider à détecter un mineurl&#39;activité enzymatique d&#39;un (phospho) lipase prédite dans des conditions standard. Après avoir rencontré une telle activité enzymatique faible, les paramètres distincts d&#39;un dosage enzymatique peut être modifiée afin d&#39;obtenir une hydrolyse plus efficace du substrat artificiel. Après avoir déterminé les conditions dans lesquelles une enzyme fonctionne bien, une variété de substrats naturels potentiels doit être testé pour leur dégradation, un processus qui peut être suivie en utilisant des méthodes chromatographiques distinctes. La définition des spécificités de substrat pour de nouvelles enzymes, fournit souvent des hypothèses pour un rôle physiologique potentiel de ces enzymes, qui peuvent ensuite être testés expérimentalement. Suite à ces directives, nous avons été en mesure d&#39;identifier une phospholipase C (SMc00171) qui dégrade la phosphatidylcholine à phosphocholine et diacylglycérol, dans une étape cruciale pour le remodelage des membranes dans la bactérie Sinorhizobium meliloti sur les conditions de phosphore limitation de la croissance. Pour deux prédit patatin-comme phospholipases (SMc00930 et SMc01003) du même organisme, nous pourrions redéfinir leurs spécificités de substrat et de préciser que SMc01003 est une lipase de diacylglycérol.

L&#39; activité de la phospholipase C spécifique au PC avec SMc00171 Bis- p - nitrophényle phosphate Extraits exempts de cellules obtenues à partir de E. coli BL21 (DE3) pLysS x, qui ont exprimé smc00171, ont été étudiés pour leur capacité à hydrolyser p bis- esters de phosphate de nitrophényle, en utilisant un dosage enzyma...

De nombreuses (phospho)lipases prédites sont mal caractérisées en ce qui concerne leurs spécificités de substrat et leurs fonctions physiologiques. Nous fournissons ici un protocole pour optimiser les activités enzymatiques, rechercher des substrats naturels et proposer des fonctions physiologiques pour ces enzymes.

Définition Substrat Spécificités pour lipase et phospholipase candidats

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

L'objectif général de cette procédure est d'accélérer la détection de substrats physiologiques pour des lipases et phospholipases potentielles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'entomologie, telles que la manière dont les phospholipases contribuent au remaniement des lipides dans les membranes biologiques. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'optimisation de l'activité enzymatique et la recherche du substrat naturel de l'enzyme peuvent être réalisées indépendamment l'une de l'autre.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la spécificité du substrat des lipases et des phospholipases bactériennes, elle peut également être modifiée pour étudier les hydrolases d'autres organismes modèles. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons cherché une activité enzymatique capable de dégrader le lipide membranaire intrinsèque, la phosphatidylcholine, chez *Rhizobium meliloti*. Pour préparer des extraits protéiques sans cellules, décongelez les suspensions de cellules bactériennes et conservez-les sur de la glace.Ensuite, faire passer les suspensions cellulaires trois fois à travers une cellule de pression froide à 20 000 livres par pouce carré. Éliminer les cellules intactes et les débris cellulaires par centrifugation à 5 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, préparer des aliquotes de 100 et 500 microlitres du surnageant pour les analyses ultérieures.Configurer le dosage enzymatique précédemment optimisé en utilisant les schémas de pipetage indiqués dans le protocole écrit. Pour une couverture initiale de différentes activités enzymatiques, utiliser des substrats artificiels produisant un composé coloré après hydrolyse, tels que les dérivés du para-nitrophénol ou du PNP. Suivre la cinétique d'augmentation de l'absorbance à 405 nanomètres, due à la formation de PNP, dans un spectrophotomètre à 30 degrés Celsius pendant une période de cinq minutes.Enfin, effectuez les calculs comme décrit dans le protocole écrit. Pour le marquage radioactif des lipides, préparez une pré-culture d'un organisme d'intérêt pendant la nuit dans cinq millilitres de milieu de culture souhaité et faites-la croître à 30 degrés Celsius. À partir de la pré-culture, ensemencez 20 millilitres de milieu frais dans un flacon de culture de 100 millimètres afin d'obtenir une densité optique initiale à 620 nanomètres de 0,3 pour la culture.Ensuite, transférez un aliquot de un millilitre de la culture dans un tube stérile en polystyrène de 14 millilitres à fond rond, en conditions stériles. Ajoutez un microcurie d'acétate 114 c au milieu de culture d'un millilitre. Incubez ensuite la culture liquide sous agitation à 30 degrés Celsius pendant une période de 24 heures.À la fin de la période d'incubation, transférer la culture dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger à 12 000 ×g à température ambiante pendant cinq minutes. Resuspendre le culot dans 100 microlitres d'eau. À ce stade, conserver la suspension cellulaire à −20 degrés Celsius ou poursuivre immédiatement l'extraction des lipides polaires.Pour effectuer l'extraction des lipides polaires, ajouter 375 microlitres d'une solution de méthanol sur chloroforme à un rapport de deux pour un à 100 microlitres de suspension cellulaire aqueuse. Vortexer l'échantillon pendant 30 secondes avant de l'incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après l'incubation, centrifuger pendant cinq minutes à 12 000 ×g à température ambiante.Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 125 microlitres de chloroforme et 125 microlitres d'eau au surnageant. Après avoir vortexé pendant 30 secondes, centrifugez l'échantillon pendant une minute à 12 000 ×g à température ambiante.Transférez la phase inférieure de chloroforme dans un tube propre. Ensuite, sèchez la solution à l’aide d’un courant d’azote gazeux. Dissolvez les lipides desséchés dans 100 microlitres de solution de chloroforme dans le méthanol.Pour la séparation des lipides neutres polaires par chromatographie sur couche mince, appliquez des aliquotes de trois microlitres des échantillons lipidiques sur une plaque d'aluminium recouverte de gel de silice pour chromatographie sur couche mince haute performance, en commençant à deux centimètres des bords de la plaque. Si plusieurs échantillons sont analysés en chromatographie unidimensionnelle, maintenez une distance d'au moins 1,5 centimètre entre les différents points d'application des échantillons. Transférez la phase mobile dans une chambre de développement pour CCM, préalablement tapissée intérieurement de papier chromatographique.Couvrir avec une plaque de verre pour permettre à la chambre de saturer pendant 30 minutes. Transférer la feuille d’aluminium à gel de silice HPTLC avec les échantillons lipidiques séchés dans la chambre. Laisser la plaque migrer pendant 30 minutes dans une chambre fermée avant de retirer la plaque.Ensuite, laissez les solvants s'évaporer sous hotte à flux laminaire pendant deux heures. Une fois que la plaque de CCM développée est sèche, incubez-la avec un écran de luminescence stimulable par la lumière dans une cassette fermée pendant trois jours. Puis, exposez l'écran incubé à un scanner PSL et acquérez une image virtuelle des lipides marqués au radioisotope séparés.Pour déterminer l'activité de la diacylglycérol (DAG) lipase, ajoutez d'abord 5 000 CPM de DAG marqué au 14 C dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez également une solution de Triton X-100 au tube et mélangez par vortex. Séchez la solution sous un courant d'azote.Pour un dosage final de 100 microlitres, ajouter du tampon Tris-HCl, une solution de chlorure de sodium et de l'eau bi-distillée. Vortexer pendant cinq secondes. Initier la réaction en ajoutant cinq microlitres d'enzyme à la solution.Incuber la solution à 30 degrés Celsius pendant quatre heures. Arrêter la réaction par l'ajout de 250 microlitres de méthanol et de 125 microlitres de chloroforme, avant d'extraire les lipides comme décrit précédemment dans cette vidéo. Passer ensuite à l'analyse des lipides neutres polaires par CLT1D et imagerie PSL ultérieure comme auparavant.Bien que la phospholipase prédite SMc01003 montre une activité avec les esters acyles artificiels de para-nitrophénol, cette activité n'est que deux à trois fois supérieure à l'activité de fond présente dans les extraits sans cellules d'Escherichia coli, dans lesquels aucun gène étranger n'avait été exprimé. Cela indique que les esters acyles de para-nitrophényle ne semblent pas être de bons substrats pour SMc01003. Alors que les extraits sans cellules d'E. coli ne peuvent pas dégrader le diacylglycérol, les extraits de souches dans lesquelles la phospholipase prédite, SMc01003, avait été exprimée, entraînent une dégradation du diacylglycérol.Bien que SMc01003 ait été prédit comme étant une phospholipase, il s'agit en réalité d'une diacylglycérol lipase qui dégrade le diacylglycérol en monoacylglycérol et un acide gras. Ensuite, il dégrade le monoacylglycérol en glycérol et un autre acide gras. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques semaines si elle est effectuée correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'optimiser les activités enzymatiques des lipases et des phospholipases, ainsi que de la poursuite de la recherche de leurs substrats physiologiques. Un avantage crucial de cette procédure est que l'optimisation de l'activité enzymatique peut être dissociée de la recherche du substrat naturel de l'enzyme. N'oubliez pas que le travail avec des solvants organiques ou des substances radioactives peut être extrêmement dangereux et que les précautions nécessaires doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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