Name: Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez une méthode de criblage à haut débit pour identifier les paires kinase-substrat impliquées dans la signalisation cellulaire. Ce protocole utilise des kinases purifiées et l'autoradiographie pour analyser l'activité enzymatique.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du CRSNG 386634. Nous tenons à remercier les membres du Screaton Lab pour des discussions utiles.

1. Préparation des réactifs, des assiettes et des cellules <ol><li> Ajouter 500 ml de tampon de lyse: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, EDTA 0,5 mM pH 8,0, 0,5% de Triton X-100, 5 mM de bêta-glycérophosphate, 5% de glycerol. Conserver à 4 ° C. Immédiatement avant l&#39;utilisation, ajouter 1 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM de fluorure de phénylméthyl sulfonyle (PMSF), vanadate de sodium et 1 mM. Après cette étape, PMSF est pas nécessaire dans tout tampon de rinçage. </li><li> Ajouter 20 ml de tampon kinase 10x: Tris 200 mM pH 7,5, 50 mM de bêta-glycérophosphate (FW 216), vanadate de sodium 2 mM. Aliquote de 1 ml tubes et conserver à -20 ° C. Immédiatement avant l&#39;utilisation, ajouter 5 mM de DTT. </li><li> Faire 20 ml de tampon 10x M-ATP: 300 um adénosine triphosphate (ATP), 66 mM de MgCl2, 33 mM MnCl 2. Aliquoter dans 1 ml tubes et conserver à -20 ° C. </li><li> Ajouter 100 ml de 2x du dodécylsulfate de sodium (SDS) de tampon de lyse: 1,5 g de base Tris, 20 ml de glycerol, 30 ml de H 2 O. Dissoudre et ajuster le pH à 6,8 avec HCl. Ajouter 40ml SDS à 10%, ajuster le volume à 100 ml. Ajouter 25 mg de bleu de bromophénol. </li><li> SPOT 4 pi de 25 ng / ul mammifère plasmide d&#39;expression codant pour un TPS-kinase 14 par puits dans des ensembles de plaques à 96 puits et les plaques d&#39;étiquettes en conséquence. Plaques d&#39;étanchéité et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> 1-2 jours avant la transfection, les cellules HEK293T culture dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco complet (DMEM) + 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et des antibiotiques dans un incubateur à 37 ° additionné de CO 2 (finale 5%). Passage à la trypsine et ne permettent pas le stock de devenir&gt; 80% de confluence lors de l&#39;expansion. Un minimum de 6 x 10 7 cellules sont nécessaires pour l&#39;écran (environ 3 x 15 cm boîtes de cellules HEK293T à 80% de confluence). </li></ol> 2. La transfection Remarque: Voir la Figure 1 pour un organigramme d&#39;ensemble du protocole. <ol><li> Si les plaques contenant des plasmides de kinases ont été gelés, les décongeler à la température ambiante, une centrifuger à 1900 g pendant 3 min pour recueillir l&#39;humidité au fond des puits. </li><li> Mélanger 8,6 ml de milieu de sérum réduit (par exemple, OPTI-MEM) avec 312,7 ul de réactif de transfection à base de lipides. Laisser reposer pendant 5 min. </li><li> Ajouter 10 ul de milieu de sérum réduit à chaque puits en utilisant un distributeur de liquide automatique équipé d&#39;une cassette de petit volume. </li><li> Ajouter 10 ul par puits de milieu de sérum / réactif de transfection mélange réduit de l&#39;étape 2.2 en utilisant un distributeur de liquide automatique équipé d&#39;une cassette de petit volume. Laisser reposer pendant 20 à 45 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules 293T à 7,5 x 10 5 cellules / ml dans 80 ml ​​de DMEM complet. Ajouter 100 ul de suspension cellulaire (soit 7,5 x 10 4 cellules) par puits en utilisant un distributeur de liquide automatique équipé d&#39;une cassette de volume standard. </li><li> Vérifiez puits au microscope pour la distribution de cellules uniforme et retourner à l&#39;incubateur pendant 24 heures. </li></ol> 3. déroulant TPS-kinase <ol><li> Assurez-fresh: 4 mM de solution pervanadate en mélangeant 60 ul de 0,2 M vanadate de sodium avec 540 ul de H 2 O. Dans un second tube de mélange de 2,7 ul de peroxyde de 30% et 1,4 ml de PBS. Ajouter les deux solutions ensemble et laisser reposer pendant 15 min avant utilisation. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux (ne pas utiliser un distributeur de liquide automatisé car elle crée trop de turbulence dans le puits) dispenser 2 pi de 0,25 M CaCl 2 dans chaque puits, suivi par 2,5 pi de la pervanadate préparé à l&#39;étape 3.1. Incuber chaque plaque à 37 ° C pendant 10 min, puis placer sur la glace. </li><li> Préparer 35 ml de tampon de lyse en ajoutant la TNT, PMSF, et vanadate de sodium comme indiqué à la section 1 (Préparation des réactifs). </li><li> Garder plaques sur de la glace, éliminer le milieu de chaque puits en utilisant un aspirateur à vide. Immédiatement ajouter 50 pl / puits de tampon de lyse froid de la glace en utilisant un distributeur de liquide automatisé muni d&#39;une cassette standard. Laisser reposer 30 min sur la glace de lyse (en option: peut arrêter là si nécessaire par plat d&#39;étanchéitée et le stockage à -80 ° C. Pour continuer, plaques dégel sur la glace). </li><li> Plaques de tourner à 1900 g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Grattez les cellules de chaque puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux et de transférer tous les contenus à dûment étiquetés plaques à 96 puits à fond en V. Plaques de tourner à 1900 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Lors de l&#39;essorage, remplissez glutathion revêtu plaques (une pour chaque plaque de 96 puits) avec 100 pl / puits de glace tampon de lyse froid (sans PMSF) comme un rinçage. Conserver les plaques sur de la glace. </li><li> Retirer des plaques à fond en V à partir de la centrifugeuse. Un à la fois, inverser les plaques de glutathion sur un évier pour secouer le tampon de lyse et tache sur une serviette en papier. Transfert de tampon de lyse à partir des plaques à fond en V aux plaques de glutathion en inclinant la plaque et à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, en faisant attention de ne pas perturber le culot au fond. Couvrir et laisser les plaques sur de la glace pendant au moins 2 heures à lier. </li><li> Près de la fin de l&#39;étape de liaison de deux heures, préparer une station de travail de la radioactivité, en veillant à til précautions de sécurité nécessaires sont en place pour le travail radioactifs. Set four d&#39;hybridation à 30 ° C. </li><li> Préparez 200 ml de tampon de lyse en ajoutant la TNT et de sodium vanadate comme indiqué à la section 1. PMSF est pas nécessaire à ce stade. </li><li> Inverser les plaques de glutathion sur un évier pour secouer le tampon de lyse et éponger sur un papier absorbant. Rincer puits 3x avec 100 tampon de lyse (sans PMSF). Ne pas laisser les puits sont assis à sec - garder dans rinçage jusqu&#39;à ce que prêt à procéder. </li><li> Préparer 55 ml de tampon kinase 1x (KB) en diluant le 10x stock et ajoutant la TNT comme indiqué à la section 1. Rincer les plaques une fois avec 50 pi de 1x KB aide d&#39;un distributeur de liquide automatisé muni d&#39;une cassette de volume standard. Laissez 1x KB dans les puits jusqu&#39;à ce que la solution A est prêt: <ol><li> Préparer la solution A en ajoutant 500 ug à 530 du substrat d&#39;intérêt, 500 ug de protéine basique de la myéline (MBP), 2,65 ml de 10x KB, 13,25 ul de DTT 1 M, et H 2 O 15,9 ml jusqu&#39;à. </li></ol></li&gt; <li> Un à la fois, inverser les plaques sur un évier pour enlever 1x KB rinçage, éponger sur du papier absorbant, et immédiatement ajouter 30 ul de la solution A l&#39;aide d&#39;un distributeur de liquide automatisé muni d&#39;une petite cassette de volume. Conserver les plaques sur de la glace. </li><li> Préparer la solution B dans la zone de travail de la radioactivité en ajoutant 2,5 ml 10x M-ATP, 32 P ATP de la 500 uCi, et H 2 O à 10 ml. <ol><li> Ajouter 20 pi de solution B par puits en utilisant une pipette à répétition qui aide à mélanger en raison de la force d&#39;éjection. Couvrir et incuber à 30 ° hybridation four C pendant 30 min. </li></ol></li><li> Après 30 minutes, transférer les plaques de retour à la glace. Ajouter 50 ul de tampon de lyse SDS 2x à chaque puits en utilisant une pipette multicanaux. Peut procéder à ce stade à l&#39;étape suivante, ou sceller les plaques avec une feuille d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à ce que pratique. </li></ol> 4. course, la coloration, et les gels de séchage Remarque: Tous les travaux doivent être effectués dans une désignation de zoneTed pour la radioactivité. <ol><li> Tournez sur l&#39;hybridation four et à 85 ° C. Plaques décongeler à température ambiante. Une fois que le four a atteint la température, plaques de transfert au four et incuber pendant 10 min pour dénaturer échantillons. </li><li> Charge: 26 puits gels pré-coulés à 15 ul de chaque mélange réactionnel à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux pour remplir plusieurs puits à la fois. Il faut veiller à ce que tous les conseils alignent correspondant bien avant d&#39;ajouter échantillons. Exécutez gel à 150 V. Ne laissez pas le colorant de suivi (ligne bleue) fonctionne hors du fond du gel car il contient de l&#39;ATP non constituée en société. </li><li> Démonter les gels et couper l&#39;ATP non constituée en société (ligne bleue) à l&#39;aide d&#39;un scalpel ou le bord droit comme il se surexposer les films. Placez les gels dans des contenants étiquetés et couvrir avec Coomassie pendant 15 min. </li><li> Enlever la tache de Coomassie, brièvement rincer les gels avec de l&#39;eau, et d&#39;ajouter Destain solution. Destain les gels jusqu&#39;à ce que les protéines sont clairement visibles. Une bande de MBP et une bande pour le substrat devraitêtre visible pour chaque échantillon. </li><li> Pour sécher les gels: <ol><li> Couper une grande feuille de papier-filtre et le placer sur la sécheuse. </li><li> Mouiller une feuille de cellophane dans de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit lisse et sans plis, et le placer sur le dessus du papier. </li><li> Disposez les gels sur le dessus de la feuille de cellophane, faire une note de l&#39;ordre de gels. Mouiller une deuxième feuille de cellophane et placer sur le dessus des gels. </li><li> Etaler toutes les bulles (un rouleau d&#39;étanchéité de la plaque fonctionne bien pour cela) pour une surface uniforme agréable. Fermer le clapet, tourner sur le vide, et sécher les gels pendant 3 heures à 80 ° C. </li></ol></li><li> Une fois que les gels sont secs, les exposer à un film XAR utilisant un écran d&#39;intensifier le signal. Enveloppez la cassette avec une pellicule ou un sac en plastique et sceller avec du ruban adhésif pour empêcher les gelées. Rangez la cassette à -80 ° C pendant la nuit. </li></ol> 5. Développer XAR Films <ol><li> Le lendemain, retirez la cassette du congélateur et laissez-les décongeler à la température ambiante. Développer le filmune chambre noire à l&#39;aide d&#39;un processeur de film selon les instructions du fabricant. Remarque: Examiner les films pour preuve de paires kinase-substrat. Une deuxième exposition plus longue peut également être utile pour détecter des événements de phosphorylation plus faibles. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Depuis les publications originales décrivant l&#39;approche 14,15, la bibliothèque originale de 180 TPS-kinases a été élargi à 420 membres, soit environ 80% de la kinome protéine humaine. Avec la bibliothèque élargi, le protocole comme décrit prend 4-5 jours, puis 1-4 jours pour développer des films (le juge nécessaire), qui pourrait être raccourcie par l&#39;utilisation de phosphorimaging et l&#39;amélioration de signal numérique. Il ya plusieurs étapes clés où les soins doivent être prises (voir</st...

Modifications post-traductionnelles de protéines (PTM) sont essentiels pour la communication intracellulaire. Peut-être le mieux étudié de PTM est tout phosphorylation, catalysée par la protéine-kinases, qui régulent une multitude de fonctions de protéines, y compris leur activité biochimique, la localisation subcellulaire, la conformation et la stabilité. L&#39;identification des sites de phosphorylation sur des protéines cibles peut être accomplie par la cartographie trypsique phosphopeptide ou par des techniques protéomiques maintenant standard en utilisant des échantillons enrichis pour des peptides phosphorylés 1,2. Alors que les trois quarts du protéome exprimé devraient être phosphorylée 3 et un identifiées 200.000 sites de phosphorylation 5, avec des estimations allant jusqu&#39;à 1 million 6, beaucoup d&#39;entre eux ont pas attribué la biologie, voie, ou la protéine kinase de signalisation. Bien que l&#39;identification des sites phosphorylés est relativement simple, comparativement plus grand défi est deidentifier la kinase apparenté (s) qui cible ces sites, un processus que nous appelons cartographie kinase: paires de substrat. Plusieurs approches pour l&#39;identification kinase: paires de substrats ont été décrits, que ce soit à partir d&#39;une kinase d&#39;intérêt et à la recherche de ses substrats ou à partir d&#39;un substrat d&#39;intérêt et d&#39;essayer de trouver une modification kinase expérimentalement ou par calcul 12 11.7. Pour identifier les kinases pour un substrat phosphorylé connu, la bioinformatique peuvent être utilisés pour identifier des protéines qui contiennent une séquence conservée courte d&#39;acides aminés flanquant le résidu phosphorylé (le site de consensus), ainsi que l&#39;identification des kinases qui forment un complexe précipitable avec le substrat. Cependant, ces approches sont longues et souvent ne répondent pas avec succès. Nous avons développé une approche fonctionnelle systématique pour identifier rapidement les kinases qui peut phosphoryler un substrat donné 13. Le test de l&#39;écran produit une excellente spécifiquelité, avec une sélection très clair pour les kinases apparentées potentiels. Compte tenu de la centralité de la phosphorylation de la signalisation biologique, l&#39;écran est utile pour la découverte dans la quasi-totalité des voies de signalisation cellulaires 14-16. L&#39;écran consiste à effectuer une analyse de kinase à grande échelle avec une bibliothèque de protéines kinases humaines. Les kinases ont été marqués avec du glutathion bactérienne S-transférase (GST) et sont purifiés à partir d&#39;extraits de cellules de mammifères, ce qui signifie que les enzymes recombinantes - à la différence de ceux qui sont préparés à partir de bactéries - sont générés en présence des protéines kinases en amont souvent requises pour la enzymes recombinantes ayant une activité in vitro. En effet, alors que l&#39;activité de kinase de sérine, de la thréonine, et la tyrosine requise pour l&#39;activation de la kinase en aval sont présents dans la levure 10, le génome de la levure codant pour 122 protéines kinases, ce qui indique que la kinome mammifère, plus de 500 gènes 17, est devenue nettement plus complexe dans le but de RegulaTe les processus uniques pour les organismes d&#39;ordre supérieur. De plus, l&#39;effet de différents stimuli pertinents pour la biologie cellulaire et la maladie humaine (tels que des petites molécules, facteurs de croissance, des hormones, etc.) peut être utilisé pour l&#39;activité de kinase de 14,15 moduler dans un contexte approprié.

<table><tbody><tr><td>Tampon de lyse</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>Voir l’étape 1.1 du protocole 10x</td></tr><tr><td>Tampon de kinase</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>Voir l’étape 1.2 du protocole 10x</td></tr><tr><td>M-ATP</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>Voir l’étape 1.3</td></tr><tr><td>du protocole Plasmides de kinase humaine</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>Étiqueté GST en maison</td></tr><tr><td>96 plaques</td><td>de puits Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293Cellules</td><td>T ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplément avec 100&nbsp ; U/ml de pénicilline, 100&nbsp ; &#956 ; g/ml de streptomycine, 10 % de sérum de veau fœtal.</td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire de 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Milieu sérique réduit</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection à base de lipides</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur automatique de liquide</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Petite cassette</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Cassette standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>Voir l’étape 3.1 du protocole</td></tr><tr><td>0,25 M CaCl2</td><td>Pipette</td> multicanaux fabriquée en interne <td></td><td></td></tr><tr><td>(20-200 &#956 ; l)</td><td>Pipette multicanaux Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>(1-10 &#956 ; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits à fond en V</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits recouvertes de glutathion</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Substrat marqué Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protéine de base de myéline (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Pipette répétitrice (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x tampon de lyse SDS (100&nbsp ; ml)</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>Voir l’étape du protocole 1.4</td></tr><tr><td>Gels TGX préfabriqués à 26 puits</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>Le pourcentage de gel requis dépend du poids moléculaire du substrat d’intérêt</td></tr><tr><td>Coloration Coomassie</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>0,1 % Coomassie R250, 10 % d’acide acétique, 40 % de méthanol</td></tr><tr><td>Décoloration de Coomassie</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>10 % d’acide acétique, 20 % de méthanol</td></tr><tr><td>Récipients de gel étiquetés</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>Couvercles en plastique usagés provenant de boîtes d’embouts vides, juste assez grands pour contenir un</td></tr><tr><td>gel Papier filtre Whatman</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Feuilles de cellophane (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Séchoir à gel</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Film d’autoradiographie à double émulsion</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de film</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Écran intensifiateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Rouleau d’étanchéité de plaques</td><td>en caoutchouc Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification de paires kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Nous avons développé une plate-forme de criblage pour identifier kinases dédiés de protéines humaines pour les substrats phosphorylés qui peuvent être utilisés pour élucider de nouvelles voies de transduction du signal. Notre approche comprend l&#39;utilisation d&#39;une bibliothèque de protéines kinases humaine étiquetée GST purifiées et un substrat de protéine recombinante d&#39;intérêt. Nous avons utilisé cette technologie pour identifier MAP / microtubules affinité de régulation de la kinase 2 (MARK2) en tant que kinase pour un site de glucose régulé sur CREB-réglementées transcription coactivateur 2 (CRTC2), une protéine nécessaire pour la prolifération des cellules bêta, ainsi que la famille de tyrosine kinases de Axl tant que régulateurs de la métastase des cellules de la phosphorylation de la protéine adaptatrice rétroprojecteur. Nous décrivons cette technologie et nous discutons comment elle peut aider à établir une carte complète de la façon dont les cellules répondent aux stimuli environnementaux.

Des résultats représentatifs de l&#39;écran sont représentés sur la figure 2. 180 kinases ont été criblés en utilisant un peptide de substrat GST-marqué correspondant à aa 268-283 de CRTC2 ainsi que la protéine basique classique dosage de kinase substrat de la myéline (MBP). Seuls deux kinases, MARK2 et de la MARK3 de kinase hautement liés phosphorylés le peptide CRTC2. MBP est incluse en tant que contrôle interne dans tous les dosages, car il contient beaucoup de résidus phosphorylable...

La phosphorylation des protéines est une caractéristique centrale de la façon dont les cellules interprètent et répondent à l’information dans leur milieu extracellulaire. Ici, nous présentons un protocole de criblage à haut débit utilisant des kinases purifiées à partir de cellules de mammifères pour identifier rapidement les kinases qui phosphorylent un ou plusieurs substrats d’intérêt.

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les kinases qui phosphorylent un substrat d'intérêt en utilisant des méthodes de criblage à haut débit. Cela est réalisé en transfectant d'abord des cellules avec des plasmides exprimant des kinases FU fusionnées à la glutathion S-transférase ou GST. La deuxième étape consiste à effectuer une purification par affinité GST de la kinase.Ensuite, les échantillons sont chargés dans des gels, qui sont ensuite électrophorésés et colorés avec le colorant bleu brillant kumasi. La dernière étape consiste à sécher les gels et à les exposer à un film d'autoradiographie. En développant et en interprétant les films obtenus, on peut identifier des paires kinase-substrat, chaque trace représentant un essai de kinase distinct.Les méthodes existantes pour identifier une kinase associée à un substrat phosphorylé connu incluent l'utilisation d'approches bioinformatiques afin de rechercher un site consensus dans le substrat, la détection de complexes entre la kinase et les substrats à l'aide de techniques biochimiques combinées à une approche empirique, ainsi que la recherche de substrats consensus en se basant sur leur fonction biologique connue. Ces approches sont longues et ne débouchent pas toujours sur des résultats concluants. Notre méthode permet une identification rapide de paires kinase-substrat en se fondant sur les conséquences fonctionnelles.Lorsque nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode, nous craignions qu'il n'y ait pas une spécificité suffisante in vitro. Il s'avère que la spécificité du substrat est excellente, et nous constatons souvent que seules les kinases appartenant à la même famille sont capables de phosphoryler un substrat donné lors du criblage. Cela est particulièrement évident lorsque nous effectuons un multiplexage en utilisant plusieurs substrats dans chaque criblage, ce qui démontre que la procédure sera Courtney, une technicienne de mon laboratoire. Commencez la procédure par la préparation des réactifs, des plaques et des cellules, comme décrit dans le protocole écrit.Si les plaques contenant les plasmides de la kinase ont été congelées, décongeler à température ambiante et centrifuger à 1900 fois G pendant trois minutes afin de rassembler toute humidité au fond des puits. Mélanger 8,6 millilitres de milieu à sérum réduit avec 312,7 microlitres de réactif de transfection à base de lipides, et laisser le mélange reposer pendant cinq minutes avant d'ajouter 10 microlitres du milieu à sérum réduit dans chaque puit de la plaque 96 puits contenant les plasmides de la kinase.À l’aide d’un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette à petit volume, ajouter ensuite 10 microlitres du mélange de réactif de transfection dans un milieu à faible teneur en sérum par puits, en utilisant un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette à petit volume, puis laisser le plateau reposer de 20 à 45 minutes. Ensuite, resuspendre 2 93 T à raison de 0,75 million de cellules par millilitre dans 80 millilitres de milieu DMEM complété modifié ou milieu équivalent, puis ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire par puits. À l’aide d’un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette à volume standard, vérifier les puits au microscope afin de s’assurer d’une répartition uniforme des cellules, puis replacer le plateau dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Pour commencer l'expérience de précipitation par GST kinase, préparez une solution de vanadate à quatre millimolaire en mélangeant 60 microlitres de vanadate de sodium à 0,2 molaire avec 540 microlitres d'eau. Dans un second tube, mélangez 2,7 microlitres de peroxyde à 30 % et 1,4 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Ajoutez les deux solutions ensemble et laissez le mélange reposer pendant 15 minutes avant utilisation.À l’aide d’une pipette multicanal, distribuer deux microlitres de chlorure de calcium 0,25 molaire dans chaque puits, suivis de 2,5 microlitres de la solution de date éprouvée. Incuber chaque plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis placer sur de la glace, en gardant les plaques sur la glace. Retirer le milieu de chaque puits, en utilisant immédiatement un vide avec 50 microlitres de tampon de lyse froid par puits.À l'aide d'un distributeur automatique de liquides équipé de la cassette standard, laisser la plaque poser 30 minutes sur de la glace pour lyser. Après avoir centrifugé les plaques à 1900 ×g pendant trois minutes à 4 °C, gratter les cellules de chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal et transférer l'intégralité du contenu vers des vbo correctement étiquetés. Pour les plaques 96 puits, centrifuger les plaques à 1900 ×g pendant 10 minutes à 4 °C ; pendant la centrifugation, remplir les plaques revêtues de glutathion avec 100 µL par puits de tampon de lyse glacé.Comme rinçage, maintenir les plaques sur de la glace. Après centrifugation des plaques à fond en V, retourner les plaques contenant le glutathion au-dessus d'un évier pour éliminer le tampon de lyse et tamponner avec du papier absorbant. Transférer le tampon de lyse des plaques à fond en V vers les plaques contenant le glutathion en inclinant la plaque et en utilisant une pipette multicanal, en prenant soin de ne pas perturber le culot au fond.Ensuite, couvrez les plaques et laissez-les sur de la glace pendant au moins deux heures. Juste avant la fin des deux heures d'incubation, préparez un poste de travail pour les radio-isotopes en veillant à ce que les précautions de sécurité nécessaires soient mises en place pour les manipulations radioactives. Réglez l'étuve d'hybridation à 30 degrés Celsius.Retournez les plaques de glutathion au-dessus d'un évier pour éliminer le tampon de lyse et essuyez-les sur du papier absorbant. Rincez les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lyse sans PMSF. Ne laissez pas les puits sécher.Les conserver dans la solution de rinçage jusqu'au moment de poursuivre. Ensuite, préparer 55 millilitres de tampon kinase 1X ou de 1X KB comme décrit dans le protocole écrit. Ajouter 50 microlitres de 1X KB dans chaque puits de la plaque à l’aide d’un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette de volume standard.Ensuite, préparez la solution A en préparant une solution contenant le substrat d'intérêt et la protéine de base de la myéline ou MVP, comme indiqué dans le protocole écrit, un à la fois. Retournez les plaques au-dessus d'un évier pour éliminer la solution de rinçage XKB, puis déposez-les sur une serviette en papier. Ajoutez immédiatement 30 microlitres de la solution A à l’aide d’un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette de petit volume. Maintenez les plaques sur de la glace.Ensuite, préparez la solution B dans la zone de travail avec des matières radioactives comme décrit dans le protocole, soit 20 microlitres de solution B par puits. À l’aide d’une pipette répétitive, qui facilite le mélange grâce à la force d’éjection, recouvrez et incubez la plaque dans une étuve d’hybridation à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, transférez les plaques de nouveau sur de la glace.Ensuite, ajoutez 50 microlitres de deux x tampon de lyse au sodium dodecyl sulfate (SDS) dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal. Tous les travaux dans cette section doivent être effectués dans un secteur désigné pour les activités radioactives. Allumez le four d’hybridation et réglez-le à 85 degrés Celsius.Une fois que le four a atteint la température, transférez les plaques dans le four et incubez pendant 10 minutes afin de dénaturer les échantillons. Ensuite, chargez des gels préfabriqués de 26 puits avec 15 microlitres de chaque réaction.En utilisant une pipette multicanal pour remplir plusieurs puits simultanément, il faut veiller à ce que toutes les pointes s'alignent correctement avec les puits correspondants. Avant d'ajouter les échantillons, faites migrer le gel à 150 volts. Ne laissez pas la ligne bleue sortir par le bas du gel, car elle contient les nucléotides A TP non incorporés. Ensuite, démontez les gels et retirez les nucléotides a TP non incorporés, car ils assombriraient l'exposition du gel sur les films.Placer les gels dans des récipients étiquetés et les recouvrir de colorant kumasi pendant 15 minutes. Ensuite, retirer le colorant kumasi. Rincer brièvement les gels à l'eau et ajouter la solution de révélation.Conservez les gels jusqu'à ce que les protéines soient clairement visibles. Une bande correspondant à MVP et une bande correspondant au substrat doivent être visibles pour chaque échantillon. Pour sécher les gels, découpez une grande feuille de papier filtre et placez-la sur le séchoir.Humidifiez une feuille de cellophane avec de l'eau distillée jusqu'à ce qu'elle soit lisse et sans plis, puis placez-la au-dessus du papier. Disposez les gels sur la feuille de cellophane en notant l'ordre des gels. Humidifiez une deuxième feuille de cellophane et placez-la au-dessus des gels.Étaler uniformément pour éliminer toutes les bulles d'air et obtenir une surface homogène. Fermer le rabat, activer le vide et faire sécher les gels pendant trois heures à 80 degrés Celsius. Une fois les gels complètement secs, les exposer à une autoradiographie par émulsion double en utilisant un écran pour amplifier le signal.Enveloppez la cassette avec du film plastique ou un sac en plastique et scellez-la avec du ruban adhésif afin d’éviter le givre avant de stocker la cassette à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, retirez la cassette du congélateur et laissez-la dégeler à température ambiante. Révélez le film dans une chambre noire à l’aide d’un révélateur automatique, conformément aux instructions du fabricant indiquées.Voici des résultats représentatifs d'un criblage au cours duquel 180 kinases ont été testées à l'aide d'un substrat peptidique marqué par un GST, correspondant aux acides aminés 268 à 283 du coactivateur transcriptionnel régulé par Krebs deux ou CRTC deux, ainsi que le substrat classique pour le dosage de kinase, la protéine basique de la myéline ou MBP. Les kinases mark deux et la kinase étroitement apparentée mark trois ont été phosphorylées. Le peptide CRTC deux et MBP sont inclus comme témoins internes dans tous les dosages, car ils contiennent de nombreux résidus pouvant être phosphorylés et migrent à 18 kilodaltons, en bas du gel.Cela permet une interprétation de la spécificité. Certaines kinases phosphoryleront de manière robuste un substrat ainsi que le MVP. Il est à noter que les puits contenant uniquement GST purifient toujours une certaine activité kinase endogène.Ainsi, il existe toujours une phosphorylation de fond dans le test. Bien que cela n'exclue pas que la phosphorylation du substrat soit réelle, cela suggère que, dans un système in vitro, la kinase pourrait être moins sélective. Il est particulièrement instructif d'inclure plusieurs substrats de masses moléculaires différentes afin de tirer des conclusions sur la spécificité de la kinase vis-à-vis de ses substrats.Étant donné que l'écran est réalisé in vitro et que des niveaux supplémentaires de complexité interviennent in vivo, un kinases candidat doit être validé dans des cellules. Par exemple, un kinases candidat peut être capable de phosphoryler un substrat in vitro, mais ne pas être exprimé dans le même type cellulaire ou dans les mêmes sous-cellules d'un compartiment que le substrat. Cette validation est généralement effectuée à l'aide d'une inhibition médiée par ARNi du gène candidat.Il est également possible de réaliser un écran secondaire en utilisant un mutant non phosphorylable du substrat pour confirmer la spécificité.

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