Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les kinases qui phosphorylent un substrat d’intérêt à l’aide de méthodes de criblage à haut débit. Ceci est accompli en transectant d’abord des cellules avec des plasmides exprimant des kinases FU en glutathion sous forme de transférase ou GST. La deuxième étape consiste à effectuer un tirage de la kinase GST.

Ensuite, les échantillons sont chargés dans des gels, qui sont ensuite analysés et colorés avec un colorant bleu brillant kumasi. La dernière étape consiste à sécher les gels et à les exposer à un film d’autoradiographie. En fin de compte, en développant et en interprétant les films résultants, on est en mesure d’identifier les paires de substrats de kinase, car chaque voie est représentative d’un dosage de kinase distinct.

Les méthodes existantes pour identifier une kinase pour un substrat phosphorylé connu comprennent l’utilisation d’approches bioinformatiques pour rechercher un site consensus dans le substrat, la détection de complexes entre les kinases et les substrats à l’aide de techniques biochimiques et d’une approche par essais et erreurs, la recherche de substrats consensuels conte sur la base de leur fonction biologique connue. Ces démarches sont chronophages et ne rencontrent pas toujours le succès. Notre approche permet d’identifier rapidement des paires de substrats de kinases sur la base de résultats fonctionnels.

Lorsque nous avons eu l’idée de cette méthode, nous craignions qu’il n’y ait pas assez de spécificité in vitro. Il s’avère que la spécificité du substrat est excellente et que nous constatons souvent que seules les kinases des membres de la famille sont capables de phosphoryler un substrat donné dans l’écran. Cela est particulièrement évident lorsque nous multiplexons en utilisant plusieurs substrats dans chaque écran, démontrant la procédure sera Courtney, une technicienne de mon laboratoire. Commencez la procédure par la préparation des réactifs, des plaques et des cellules comme décrit dans le protocole de texte.

Si les plaques contenant des plasmides de kinases ont été congelées, décongeler à température ambiante et centrifuger à 1900 fois G pendant trois minutes pour recueillir l’humidité au fond des puits. Mélangez 8,6 millilitres de milieu sérique réduit avec 312,7 microlitres de réactif de transfection à base de lipides, et laissez le mélange reposer pendant cinq minutes dans chaque puits. Sur la plaque à 96 puits contenant les plasmides kinases à 10 microlitres du milieu sérique réduit.

À l’aide d’un distributeur de liquide automatisé équipé d’une cassette de petit volume, ajoutez ensuite 10 microlitres du mélange de réactifs de transfection de sérum moyen réduit par puits, à l’aide d’un distributeur de liquide automatisé équipé d’une cassette de petit volume et laissez la plaque reposer pendant 20 à 45 minutes. Ensuite, résus suspend 2 93 cellules T à 0,75 million de cellules par millilitre dans 80 millilitres de delcos modifiés complets égaux à medium ou DMEM à 100 microlitres de suspension cellulaire par puits. À l’aide d’un distributeur de liquide automatisé équipé d’une cassette de volume standard, vérifiez les puits au microscope pour une distribution uniforme des cellules avant de remettre la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Pour commencer l’expérience de réduction de la kinase GST. Préparez une solution de quatre millimolaires par vanadate en mélangeant 60 microlitres de vanadate de sodium à 0,2 molaire avec 540 microlitres d’eau dans un deuxième tube mélangé à 2,7 microlitres de peroxyde à 30 % et 1,4 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Ajoutez les deux solutions ensemble et laissez reposer le mélange pendant 15 minutes avant de l’utiliser.

À l’aide d’une pipette multicanaux, distribuez deux microlitres de chlorure de calcium à 0,25 molaire dans chaque puits, suivis de 2,5 microlitres de la solution de datte éprouvée. Incuber chaque assiette à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis placer sur de la glace, en gardant les assiettes sur de la glace. Retirez le milieu de chaque puits, en utilisant immédiatement un vide de 50 microlitres par puits de tampon de lyse glacé.

À l’aide d’un distributeur de liquide automatisé équipé de la cassette standard, laissez l’assiette reposer pendant 30 minutes sur de la glace pour les poux. Après avoir fait tourner les plaques à 1900 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, grattez les cellules de chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux et transférez tout le contenu dans un vbo correctement étiqueté. Des plaques à 96 puits font tourner les plaques à 1900 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pendant le spin et remplissent des plaques recouvertes de glutathion avec 100 microlitres par puits de tampon de lyse glacée.

En guise de rinçage, gardez les assiettes sur de la glace. Après la centrifugation des plaques inférieures, retournez les plaques de glutathion au-dessus d’un évier pour secouer le tampon de lyse et épongez sur une serviette en papier. Transférez le tampon de lyse des plaques inférieures en V vers les plaques de glutathion en inclinant la plaque et en utilisant une pipette multicanaux, en prenant soin de ne pas déranger la pastille sur le fond.

Couvrez ensuite les assiettes et laissez sur de la glace pendant au moins deux heures. Pour lier vers la fin de l’étape de liaison de deux heures, préparez un poste de travail pour la radioactivité en vous assurant que les précautions de sécurité nécessaires sont en place pour les travaux radioactifs. Réglez le four d’hybridation à 30 degrés Celsius.

Retournez les plaques de glutathion au-dessus d’un évier pour secouer le tampon de lyse et épongez sur une serviette en papier. Rincer les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lyse sans PMSF. Ne laissez pas les puits sécher.

Gardez-les dans le rinçage jusqu’au moment de continuer. Ensuite, préparez 55 millilitres d’un tampon de kinase X ou d’un tampon de kinase de X, comme décrit dans le protocole texte. Ajouter 50 microlitres d’un x kb dans chaque puits de la plaque à l’aide d’un distributeur automatique de liquide équipé d’une cassette de volume standard.

Préparez ensuite la solution A en préparant une solution contenant le substrat d’intérêt et la protéine basique de la myéline ou MVP comme détaillé dans le protocole textuel, un par un. Retournez les plaques au-dessus d’un évier pour retirer le tracé de rinçage XKB sur une serviette en papier et ajoutez immédiatement 30 microlitres de solution A. À l’aide d’un distributeur de liquide automatisé équipé d’une cassette de petit volume. Gardez les assiettes sur de la glace.

Ensuite, préparez la solution B dans la zone de travail sur la radioactivité comme décrit dans le protocole textuel à raison de 20 microlitres de solution B par puits. À l’aide d’une pipette à répéteur, qui facilite le mélange en raison de la force d’éjection, couvrez et incubez la plaque dans un four d’hybridation à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Au bout de 30 minutes, remettez les assiettes dans de la glace.

Ajoutez ensuite 50 microlitres de deux tampons de lyse à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Tous les travaux de cette section doivent être effectués dans une zone désignée pour l’activité radio. Allumez le four d’hybridation et réglez-le à 85 degrés Celsius.

Une fois que le four a atteint la température, transférez les plaques dans le four et incubez pendant 10 minutes pour dénaturer les échantillons. Prochaine charge. 26 gels préfabriqués avec 15 microlitres de chaque réaction.

À l’aide d’une pipette multicanaux pour remplir plusieurs puits à la fois, il faut veiller à ce que toutes les pointes soient alignées avec les puits correspondants. Avant d’ajouter les échantillons, faites fonctionner le gel à 150 volts. Ne laissez pas la ligne bleue s’écouler du bas du gel car il contient le A TP non incorporé. Ensuite, démontez les gels et retirez le TP non incorporé car il assombrira l’exposition au gel sur les films.

Placez les gels dans des récipients étiquetés et recouvrez de teinture kumasi pendant 15 minutes. Ensuite, enlevez la tache de kumasi. Rincez brièvement les gels à l’eau et ajoutez la solution de retenue.

Conservez les gels jusqu’à ce que les protéines soient clairement visibles. Une bande pour le MVP et une bande pour le substrat doivent être visibles pour chaque échantillon. Pour sécher les gels, coupez une grande feuille de papier filtre et placez-la sur le sèche-linge.

Mouillez une feuille de cellophane dans de l’eau distillée jusqu’à ce qu’elle soit lisse et infroissable et placez-la sur le papier. Posez les gels sur la feuille de cellophane en notant l’ordre des gels. Mouillez une deuxième feuille de cellophane et placez-la sur les gels.

Étalez toutes les bulles pour une belle surface uniforme. Fermez le volet, allumez l’aspirateur et conduisez les gels pendant trois heures à 80 degrés Celsius. Une fois que les gels sont secs, exposez-les à un film de radiographie automatique à double émulsion à l’aide d’un écran pour intensifier le signal.

Enveloppez la cassette avec une pellicule saran ou un sac en plastique et fermez-la avec du ruban adhésif pour empêcher le gel d’entrer avant de ranger la cassette à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, sortez la cassette du congélateur et laissez-la décongeler à température ambiante. Développez le film dans une chambre noire à l’aide d’un développeur, conformément aux instructions du fabricant.

Voici les résultats représentatifs d’un criblage : 180 kinases ont été criblées à l’aide d’un substrat peptidique marqué par GST correspondant aux acides aminés 268 à 283 du coactivateur transcriptionnel régulé par kreb deux ou C RTC deux, ainsi que du substrat de dosage kinase classique protéine basique de myéline ou MBP seulement deux. Les kinases marquent deux et la kinase très apparentée, marque trois phosphorylée. Le MBP à deux peptides du CRTC est inclus comme contrôle interne dans tous les essais, car il contient de nombreux résidus de phosphoryle pertinents et s’écoule à 18 kilodaltons vers le bas du gel.

Cela permet une interprétation de la spécificité. Certaines kinases phosphorylent de manière robuste un substrat et un MVP. Il est à noter ici que les puits contenant uniquement de la GST purifient toujours une partie de l’activité kinase endogène.

Ainsi, il y a toujours une phosphorylation de fond dans le dosage. Bien que cela n’exclue pas que la phosphorylation du substrat soit réelle, cela suggère que dans le cadre in vitro, la kinase peut être moins sélective. Il est particulièrement instructif d’inclure plusieurs substrats de poids moléculaires différents pour tirer des conclusions concernant la spécificité du substrat kinase.

Comme le crible est in vitro et que des niveaux supplémentaires de complexité se produisent in vivo, une kinase candidate doit être validée dans les cellules. Par exemple, une kinase candidate peut avoir la capacité de phosphoryler un substrat in vitro si elle n’est pas exprimée dans le même type de cellule ou dans les mêmes sous-cellules d’un compartiment que le substrat. Cela se fait généralement en utilisant le silençage médié par l’ARNi du candidat.

Il est également possible d’effectuer un criblage secondaire à l’aide d’un mutant non phosphorylable du substrat pour confirmer la spécificité.