Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les kinases qui phosphorylent un substrat d'intérêt en utilisant des méthodes de criblage à haut débit. Cela est réalisé en transfectant d'abord des cellules avec des plasmides exprimant des kinases FU fusionnées à la glutathion S-transférase ou GST. La deuxième étape consiste à effectuer une purification par affinité GST de la kinase.

Ensuite, les échantillons sont chargés dans des gels, qui sont ensuite électrophorésés et colorés avec le colorant bleu brillant kumasi. La dernière étape consiste à sécher les gels et à les exposer à un film d'autoradiographie. En développant et en interprétant les films obtenus, on peut identifier des paires kinase-substrat, chaque trace représentant un essai de kinase distinct.

Les méthodes existantes pour identifier une kinase associée à un substrat phosphorylé connu incluent l'utilisation d'approches bioinformatiques afin de rechercher un site consensus dans le substrat, la détection de complexes entre la kinase et les substrats à l'aide de techniques biochimiques combinées à une approche empirique, ainsi que la recherche de substrats consensus en se basant sur leur fonction biologique connue. Ces approches sont longues et ne débouchent pas toujours sur des résultats concluants. Notre méthode permet une identification rapide de paires kinase-substrat en se fondant sur les conséquences fonctionnelles.

Lorsque nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode, nous craignions qu'il n'y ait pas une spécificité suffisante in vitro. Il s'avère que la spécificité du substrat est excellente, et nous constatons souvent que seules les kinases appartenant à la même famille sont capables de phosphoryler un substrat donné lors du criblage. Cela est particulièrement évident lorsque nous effectuons un multiplexage en utilisant plusieurs substrats dans chaque criblage, ce qui démontre que la procédure sera Courtney, une technicienne de mon laboratoire. Commencez la procédure par la préparation des réactifs, des plaques et des cellules, comme décrit dans le protocole écrit.

Si les plaques contenant les plasmides de la kinase ont été congelées, décongeler à température ambiante et centrifuger à 1900 fois G pendant trois minutes afin de rassembler toute humidité au fond des puits. Mélanger 8,6 millilitres de milieu à sérum réduit avec 312,7 microlitres de réactif de transfection à base de lipides, et laisser le mélange reposer pendant cinq minutes avant d'ajouter 10 microlitres du milieu à sérum réduit dans chaque puit de la plaque 96 puits contenant les plasmides de la kinase.

À l’aide d’un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette à petit volume, ajouter ensuite 10 microlitres du mélange de réactif de transfection dans un milieu à faible teneur en sérum par puits, en utilisant un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette à petit volume, puis laisser le plateau reposer de 20 à 45 minutes. Ensuite, resuspendre 2 93 T à raison de 0,75 million de cellules par millilitre dans 80 millilitres de milieu DMEM complété modifié ou milieu équivalent, puis ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire par puits. À l’aide d’un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette à volume standard, vérifier les puits au microscope afin de s’assurer d’une répartition uniforme des cellules, puis replacer le plateau dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Pour commencer l'expérience de précipitation par GST kinase, préparez une solution de vanadate à quatre millimolaire en mélangeant 60 microlitres de vanadate de sodium à 0,2 molaire avec 540 microlitres d'eau. Dans un second tube, mélangez 2,7 microlitres de peroxyde à 30 % et 1,4 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Ajoutez les deux solutions ensemble et laissez le mélange reposer pendant 15 minutes avant utilisation.

À l’aide d’une pipette multicanal, distribuer deux microlitres de chlorure de calcium 0,25 molaire dans chaque puits, suivis de 2,5 microlitres de la solution de date éprouvée. Incuber chaque plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis placer sur de la glace, en gardant les plaques sur la glace. Retirer le milieu de chaque puits, en utilisant immédiatement un vide avec 50 microlitres de tampon de lyse froid par puits.

À l'aide d'un distributeur automatique de liquides équipé de la cassette standard, laisser la plaque poser 30 minutes sur de la glace pour lyser. Après avoir centrifugé les plaques à 1900 ×g pendant trois minutes à 4 °C, gratter les cellules de chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal et transférer l'intégralité du contenu vers des vbo correctement étiquetés. Pour les plaques 96 puits, centrifuger les plaques à 1900 ×g pendant 10 minutes à 4 °C ; pendant la centrifugation, remplir les plaques revêtues de glutathion avec 100 µL par puits de tampon de lyse glacé.

Comme rinçage, maintenir les plaques sur de la glace. Après centrifugation des plaques à fond en V, retourner les plaques contenant le glutathion au-dessus d'un évier pour éliminer le tampon de lyse et tamponner avec du papier absorbant. Transférer le tampon de lyse des plaques à fond en V vers les plaques contenant le glutathion en inclinant la plaque et en utilisant une pipette multicanal, en prenant soin de ne pas perturber le culot au fond.

Ensuite, couvrez les plaques et laissez-les sur de la glace pendant au moins deux heures. Juste avant la fin des deux heures d'incubation, préparez un poste de travail pour les radio-isotopes en veillant à ce que les précautions de sécurité nécessaires soient mises en place pour les manipulations radioactives. Réglez l'étuve d'hybridation à 30 degrés Celsius.

Retournez les plaques de glutathion au-dessus d'un évier pour éliminer le tampon de lyse et essuyez-les sur du papier absorbant. Rincez les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lyse sans PMSF. Ne laissez pas les puits sécher.

Les conserver dans la solution de rinçage jusqu'au moment de poursuivre. Ensuite, préparer 55 millilitres de tampon kinase 1X ou de 1X KB comme décrit dans le protocole écrit. Ajouter 50 microlitres de 1X KB dans chaque puits de la plaque à l’aide d’un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette de volume standard.

Ensuite, préparez la solution A en préparant une solution contenant le substrat d'intérêt et la protéine de base de la myéline ou MVP, comme indiqué dans le protocole écrit, un à la fois. Retournez les plaques au-dessus d'un évier pour éliminer la solution de rinçage XKB, puis déposez-les sur une serviette en papier. Ajoutez immédiatement 30 microlitres de la solution A à l’aide d’un distributeur automatique de liquides équipé d’une cassette de petit volume. Maintenez les plaques sur de la glace.

Ensuite, préparez la solution B dans la zone de travail avec des matières radioactives comme décrit dans le protocole, soit 20 microlitres de solution B par puits. À l’aide d’une pipette répétitive, qui facilite le mélange grâce à la force d’éjection, recouvrez et incubez la plaque dans une étuve d’hybridation à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, transférez les plaques de nouveau sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de deux x tampon de lyse au sodium dodecyl sulfate (SDS) dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal. Tous les travaux dans cette section doivent être effectués dans un secteur désigné pour les activités radioactives. Allumez le four d’hybridation et réglez-le à 85 degrés Celsius.

Une fois que le four a atteint la température, transférez les plaques dans le four et incubez pendant 10 minutes afin de dénaturer les échantillons. Ensuite, chargez des gels préfabriqués de 26 puits avec 15 microlitres de chaque réaction.

En utilisant une pipette multicanal pour remplir plusieurs puits simultanément, il faut veiller à ce que toutes les pointes s'alignent correctement avec les puits correspondants. Avant d'ajouter les échantillons, faites migrer le gel à 150 volts. Ne laissez pas la ligne bleue sortir par le bas du gel, car elle contient les nucléotides A TP non incorporés. Ensuite, démontez les gels et retirez les nucléotides a TP non incorporés, car ils assombriraient l'exposition du gel sur les films.

Placer les gels dans des récipients étiquetés et les recouvrir de colorant kumasi pendant 15 minutes. Ensuite, retirer le colorant kumasi. Rincer brièvement les gels à l'eau et ajouter la solution de révélation.

Conservez les gels jusqu'à ce que les protéines soient clairement visibles. Une bande correspondant à MVP et une bande correspondant au substrat doivent être visibles pour chaque échantillon. Pour sécher les gels, découpez une grande feuille de papier filtre et placez-la sur le séchoir.

Humidifiez une feuille de cellophane avec de l'eau distillée jusqu'à ce qu'elle soit lisse et sans plis, puis placez-la au-dessus du papier. Disposez les gels sur la feuille de cellophane en notant l'ordre des gels. Humidifiez une deuxième feuille de cellophane et placez-la au-dessus des gels.

Étaler uniformément pour éliminer toutes les bulles d'air et obtenir une surface homogène. Fermer le rabat, activer le vide et faire sécher les gels pendant trois heures à 80 degrés Celsius. Une fois les gels complètement secs, les exposer à une autoradiographie par émulsion double en utilisant un écran pour amplifier le signal.

Enveloppez la cassette avec du film plastique ou un sac en plastique et scellez-la avec du ruban adhésif afin d’éviter le givre avant de stocker la cassette à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, retirez la cassette du congélateur et laissez-la dégeler à température ambiante. Révélez le film dans une chambre noire à l’aide d’un révélateur automatique, conformément aux instructions du fabricant indiquées.

Voici des résultats représentatifs d'un criblage au cours duquel 180 kinases ont été testées à l'aide d'un substrat peptidique marqué par un GST, correspondant aux acides aminés 268 à 283 du coactivateur transcriptionnel régulé par Krebs deux ou CRTC deux, ainsi que le substrat classique pour le dosage de kinase, la protéine basique de la myéline ou MBP. Les kinases mark deux et la kinase étroitement apparentée mark trois ont été phosphorylées. Le peptide CRTC deux et MBP sont inclus comme témoins internes dans tous les dosages, car ils contiennent de nombreux résidus pouvant être phosphorylés et migrent à 18 kilodaltons, en bas du gel.

Cela permet une interprétation de la spécificité. Certaines kinases phosphoryleront de manière robuste un substrat ainsi que le MVP. Il est à noter que les puits contenant uniquement GST purifient toujours une certaine activité kinase endogène.

Ainsi, il existe toujours une phosphorylation de fond dans le test. Bien que cela n'exclue pas que la phosphorylation du substrat soit réelle, cela suggère que, dans un système in vitro, la kinase pourrait être moins sélective. Il est particulièrement instructif d'inclure plusieurs substrats de masses moléculaires différentes afin de tirer des conclusions sur la spécificité de la kinase vis-à-vis de ses substrats.

Étant donné que l'écran est réalisé in vitro et que des niveaux supplémentaires de complexité interviennent in vivo, un kinases candidat doit être validé dans des cellules. Par exemple, un kinases candidat peut être capable de phosphoryler un substrat in vitro, mais ne pas être exprimé dans le même type cellulaire ou dans les mêmes sous-cellules d'un compartiment que le substrat. Cette validation est généralement effectuée à l'aide d'une inhibition médiée par ARNi du gène candidat.

Il est également possible de réaliser un écran secondaire en utilisant un mutant non phosphorylable du substrat pour confirmer la spécificité.