L'étude de la protéine système de contrôle de la qualité des

L'objectif général de cette technique d'imagerie est d'observer les perturbations cellulaires induites par un stress thermique chez les cellules de Dictyostelium discoideum. Cette méthode peut aider à comprendre les mécanismes de réponse au stress thermique et de contrôle de la qualité des protéines chez l'amibe Dictyostelium discoideum. Le principal avantage de cette technique réside dans le contrôle précis et rigoureux de la température appliquée aux cellules lors de l'acquisition d'images.

Pour commencer la procédure, préparez les cellules de Dictyostelium comme décrit dans le protocole écrit. La veille de l'observation, divisez les cellules dans un milieu à faible fluorescence à raison de 10 000 cellules par millilitre. Avant l'observation, récoltez les cellules à partir de la plaque de culture dans du LFM, puis transférez un nombre adéquat de cellules dans des boîtes en verre à fond de verre.

Laisser les cellules se déposer pendant 20 minutes, puis remplacer soigneusement le milieu utilisé par du milieu frais afin d'éliminer les cellules non déposées. Observer les cellules dans des conditions non stressantes à 23 degrés Celsius et acquérir un minimum de six champs. Enregistrer des séries en Z d'un maximum de sept micromètres par pas de 1 à 0,25 micromètre afin de capturer tout le volume cellulaire.

Ensuite, acquérez une image de référence en champ clair pour évaluer le nombre total de cellules. Ajustez ensuite la température de la chambre de refroidissement à 30 degrés Celsius. Une fois que l'affichage de la température a atteint la valeur souhaitée, recentrez manuellement dans le canal champ clair.

Vérifiez tous les champs observés enregistrés avant de commencer le laps de temps, puis lancez un laps de temps de quatre heures de stress thermique avec un intervalle de cinq à dix minutes entre chaque point temporel. Vérifiez que la mise au point est correcte pendant l'acquisition des deux premiers points temporels. Une fois le stress thermique terminé, réduisez la température à 23 degrés Celsius.

Attendre que l'affichage de la température se stabilise et effectuer une mise au point manuelle. Ensuite, enregistrer des films en laps de temps pendant la phase de récupération pendant huit à dix heures à des intervalles de dix à vingt minutes. Vérifier que la mise au point est correcte pendant l'acquisition du premier point temporel.

Commencez par ouvrir le logiciel de traitement d'images équipé du module complémentaire Cell Counter. Chargez la pile d'images en champ clair en cliquant sur Fichier, puis sur Ouvrir. Ensuite, ouvrez le module complémentaire Cell Counter et chargez la pile d'images en cliquant sur Initialiser.

Choisissez le type de compteurs en cliquant sur la case appropriée. Ensuite, comptez le nombre total de cellules et enregistrez les marqueurs en cliquant sur Enregistrer les marqueurs. Une fois les marqueurs enregistrés, chargez la projection maximale de la hyperpile d'images de fluorescence.

Ouvrez le plugin Cell Counter et chargez les marqueurs en cliquant sur Charger les marqueurs. Ensuite, choisissez le type de marqueur pour les foyers cytosoliques et comptez les cellules. Les marqueurs existants peuvent servir de guide pour la position des cellules individuelles.

Récupérez le nombre de comptages par coupe en cliquant sur Résultats, puis enregistrez les comptages ailleurs pour des calculs ultérieurs. Dans cette étude, la distribution de la protéine polyglutamine marquée par GFP, Q103, a été observée dans des cellules de Dictyostelium. Dans des conditions de croissance normales, Q103-GFP est répartie de manière diffuse dans le cytoplasme.

Lors d'un stress thermique, le marqueur Q103-GFP s'agglomère en structures ponctuées. Après la disparition du stress et la reprise de la croissance dans des conditions normales, ces structures se dissolvent. La redistribution du Q103-GFP et la formation de foyers cytosoliques induits par le stress thermique sont quantifiées à l'aide d'une analyse d'image.

Les résultats représentatifs de la réponse au stress thermique peuvent être observés ici. Le nombre de cellules présentant des foyers cytosoliques de Q103-GFP augmente avec la prolongation du stress thermique. Pendant le stress thermique, le système de contrôle de qualité des protéines est saturé, de sorte que les protéines enclines à l'agrégation ne peuvent pas rester à l'état soluble.

Après un stress thermique, le nombre de cellules présentant des foyers cytosoliques diminue, ce qui suggère que les protéines agrégées se dissolvent. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment surveiller les perturbations induites par un stress thermique chez l'amibe Dictyostelium discoideum. Pendant l'acquisition d'images, il est important de se rappeler de bien ajuster la mise au point, si votre microscope ne possède pas de mise au point automatique matérielle.

Le contrôle de température décrit dans ce protocole peut être utilisé au-delà du domaine de la réponse au stress thermique. L’imagerie effectuée dans des conditions normales de croissance en utilisant un contrôle de température peut réduire notablement les effets phototoxiques.