L'étude de la protéine système de contrôle de la qualité des D. discoideum Utilisation de cellules vivantes d'imagerie à température contrôlée

L’objectif global de cette technique d’imagerie est d’observer les perturbations cellulaires induites par le stress thermique dans les cellules de Dictyostelium discoideum. Cette méthode peut aider à comprendre les mécanismes de la réponse au stress thermique et du contrôle de la qualité des protéines dans l’amibe Dictyostelium discoideum. Le principal avantage de cette technique est le contrôle serré et précis de la température appliquée à l’imagerie des fichiers des cellules.

Pour commencer la procédure, préparez les cellules Dictyostelium comme indiqué dans le protocole texte. La veille de l’imagerie, divisez les cellules en milieu à faible fluorescence à 10 000 cellules par millilitre. Avant l’imagerie, récoltez les cellules de la plaque tissulaire dans le LFM, puis transférez un nombre adéquat de cellules dans des boîtes à fond de verre.

Laissez les cellules se déstabiliser pendant 20 minutes, puis remplacez soigneusement le milieu utilisé par un milieu frais, pour éliminer les cellules non fixées. Les cellules d’image, dans des conditions non contraintes à 23 degrés Celsius, acquièrent un minimum de six champs de vision. Acquérez des empilements Z d’un maximum de sept micromètres par pas de 0,25 micromètre pour capturer tout le volume de la cellule.

Ensuite, acquérez une image de référence en fond clair pour évaluer le nombre total de cellules. Ensuite, ajustez la température de la chambre de refroidissement à 30 degrés Celsius. Une fois que l’affichage de la température a atteint la valeur souhaitée, refaites la mise au point manuellement dans le canal en fond clair.

Vérifiez tous les FOV enregistrés avant de commencer le time-lapse, puis démarrez un time-lapse pour quatre heures de stress thermique avec un intervalle de temps de cinq à 10 minutes entre les points temporels. Assurez-vous que la mise au point est correcte lors de l’acquisition des deux premiers points temporels. Une fois le stress thermique terminé, réduisez la température à 23 degrés Celsius.

Attendez que l’affichage de la température s’ajuste et refaites la mise au point manuellement. Ensuite, enregistrez des vidéos en accéléré pendant la phase de récupération pendant huit à 10 heures à des intervalles de temps de 10 à 20 minutes. Assurez-vous que la mise au point est correcte lors de l’acquisition du premier point temporel.

Commencez par ouvrir le package de traitement d’images équipé du plugin Cell Counter. Chargez la pile d’images en fond clair en cliquant sur Fichier, puis sur Ouvrir. Ensuite, ouvrez le plugin Cell Counter, chargez la pile d’images en cliquant sur Initialiser.

Choisissez le type de compteurs en cliquant sur la case appropriée. Après cela, comptez le nombre total de cellules, enregistrez les marqueurs en cliquant sur Enregistrer les marqueurs. Une fois les marqueurs enregistrés, chargez la projection maximale de l’hyperpile de l’image de fluorescence.

Ouvrez le plugin Cell Counter et chargez les marqueurs en cliquant sur Charger les marqueurs. Ensuite, choisissez le type de marqueur pour les foyers cytosoliques et comptez les cellules. Les marqueurs existants peuvent être utilisés comme guide pour la position des cellules individuelles.

Récupérez le nombre de comptages par tranche en cliquant sur Résultats, puis enregistrez les comptages ailleurs pour des calculs ultérieurs. Dans cette étude, la distribution de la protéine polyglutamine Q103 marquée à la GFP a été observée dans les cellules de Dictyostelium. Dans des conditions de croissance normales, la Q103-GFP est distribuée de manière diffuse dans le cytoplasme.

Lors d’un stress thermique, le marqueur Q103-GFP s’unit pour ponctuer les structures. Lors de la libération du stress et de la croissance dans des conditions de croissance normales, ces structures se dissolvent. La redistribution de Q103-GFP et la formation de foyers cytosoliques induits par le stress thermique sont quantifiées à l’aide de l’analyse d’images.

Les résultats représentatifs de la réponse au stress thermique peuvent être consultés ici. Le nombre de cellules avec des foyers cytosoliques Q103-GFP augmente avec le stress thermique continu. En cas de stress thermique, le système de contrôle de la qualité des protéines est submergé, de sorte que les protéines sujettes à l’agrégation ne peuvent pas être maintenues dans un état soluble.

Après un stress thermique, le nombre de cellules avec des foyers cytosoliques diminue, ce qui suggère que les protéines agrégées se dissolvent. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller les perturbations induites par le stress thermique dans l’amibe Dictyostelium discoideum. Tout au long de l’imagerie, il est important de ne pas oublier de s’assurer que la mise au point est correctement ajustée, si votre microscope ne dispose pas d’un autofocus matériel.

Le contrôle de la température montré dans ce protocole peut être utilisé au-delà du domaine de la réponse au stress thermique. L’imagerie dans des conditions normales de croissance à l’aide du contrôle de la température peut réduire considérablement les effets phototoxiques.