Name: Létude de la protéine système de contrôle de la qualité des D. discoideum Utilisation de cellules vivantes dimagerie à température contrôlée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie en cellules vivantes avec contrôle thermique précis pour étudier l'agrégation protéique induite par le stress thermique chez Dictyostelium discoideum. Cette technique permet d'observer en temps réel les réponses cellulaires au stress.

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1. Préparation des cellules <ol><li> cellules de culture <ol><li> Cultivez D. cellules discoideum en milieu AX à 23 ° C sous la lumière dans des plaques de culture de tissus. Evitez de garder les cellules à des densités élevées, supérieures à 75% de confluence. NOTE: Pour une réponse optimale au stress thermique, les cellules doivent être en phase de croissance exponentielle et ne doivent pas avoir atteint la phase stationnaire. </li><li> La veille imagerie, les cellules divisées en faible moyenne de fluorescence (LFM) à 1 x 10 4 cellules / ml. REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond provoqué par le milieu AX. Le temps d&#39;incubation peut être réduite à un minimum de 2 heures. Cependant, les vésicules prises en milieu AX peuvent encore générer des signaux de fond après 2 h. </li></ol></li><li> Préparation des cellules pour la microscopie <ol><li> Avant l&#39;imagerie, les cellules de récolte de la plaque de tissu dans LFM et transférer un nombre suffisant de cellules dans des boîtes à fond de verre. NOTE: Habituellement,1 x 10 5 cellules / ml est suffisante; cependant, si le montage expérimental nécessite des périodes d&#39;imagerie longues (plus de 8 heures), le nombre de cellules doivent être ajustés avec soin, comme D. les cellules discoideum passeront au cycle de développement et de commencer à diffuser en continu et global si le nombre de cellules sont élevés tandis que les nutriments sont faibles. </li><li> Laisser les cellules sédimenter pendant 20 min. Retirer les cellules non-réglées en remplaçant soigneusement le support utilisé avec du milieu frais. </li></ol></li></ol> 2. Imaging NOTE: Le protocole peut être utilisé sur des systèmes à grand champ, ainsi que dans les configurations de microscopie confocale. L&#39;utilisation d&#39;une boîte d&#39;incubation à température contrôlée portant sur les objectifs et la platine du microscope est utile, mais pas indispensable pour le contrôle de la température. La température de la zone d&#39;incubation est réglée à la température la plus élevée utilisée dans l&#39;expérience, par exemple à 40 ° C si le stress thermique est effectué. Dans le cas contraire, la température est réglée à 256; C. Les changements de température doivent être faites à l&#39;avance pour permettre au système d&#39;adaptation, comme les changements de température au cours de l&#39;imagerie peuvent affecter la mise au point. Remarque: Au cours de l&#39;imagerie, la température est contrôlée à l&#39;aide d&#39;une chambre de refroidissement. La température par défaut pour l&#39;imagerie des cellules non souligné est de 23 ° C. Pour des conditions de stress dû à la chaleur, la température est augmentée en conséquence au niveau souhaité. L&#39;élément piézoélectrique dans la chambre de refroidissement peut répondre très rapidement au changement de température. Cependant, la mise au point des images change légèrement (il peut dévier jusqu&#39;à 20 um en fonction du changement de température). Ainsi recentrage manuel est nécessaire dans les premières minutes de l&#39;acquisition d&#39;images, à moins que le microscope utilisé est équipé d&#39;un matériel auto-focus. <ol><li> L&#39; acquisition des images dans des conditions non stressées <ol><li> les cellules de l&#39;image dans des conditions non stressées à 23 ° C, acquérir un minimum de 6 champs de vision (FOV). REMARQUE: la condition non-stress peut être visualized soit par l&#39;enregistrement d&#39;un time-lapse court (5-30 min) ou l&#39;acquisition d&#39;images fixes représentatives. Pour chaque ligne de condition ou de la cellule d&#39;acquérir un minimum de 6 champs de vision (FOV). NOTE: Dans le cas où les cellules individuelles sont d&#39; un intérêt, positionner les cellules respectives dans le milieu de la FOV et d&#39; enregistrer une série de tuiles 3 x 3 avec le FOV contenant les cellules d&#39;intérêt dans le milieu D.. discoideum cellules sont motiles et peuvent migrer hors du champ de vision. Cependant, la série 3 x 3 tuiles augmente la zone potentiellement explorée par la cellule d&#39;intérêt et il reste traçable pour des périodes de ~ 6 h time-lapse. </li><li> Acquérir z maximale des piles de 7 um um 1-0.25 étapes consistant à capter la totalité du volume de la cellule. </li><li> Acquérir une image de champ lumineux de référence pour évaluer le nombre total de cellules. </li></ol></li><li> L&#39; acquisition des images pour le stress thermique <ol><li> Ajuster la température de la chambre de refroidissement à 30 ° C selon les instructions du fabricant. &lt;/ Li&gt; <li> Après l&#39;affichage de la température a atteint la valeur souhaitée, recentrer manuellement dans le canal de champ lumineux et vérifier tous les FOV enregistrées avant de commencer le time-lapse. </li><li> Lancer un time-lapse pendant 4 heures de stress thermique avec un intervalle de 5-10 min de temps entre les points de temps. Vérifiez mise au point correcte lors de l&#39;acquisition des deux premiers points de temps. </li></ol></li><li> L&#39; acquisition des images lors de la récupération <ol><li> Après le stress de chaleur, réduire la température de retour à 23 ° C, attendez que l&#39;affichage de la température pour ajuster et recentrer manuellement. </li><li> Enregistrez des films en accéléré dans la phase de récupération pour les 8-10 h en 10-20 intervalles de temps min. Vérifiez mise au point correcte lors de l&#39;acquisition du premier point de temps. </li></ol></li></ol> 3. Analyse de l&#39;image NOTE: Pour quantifier le nombre de cellules hébergeant des foyers cytosolique, évaluer le nombre total de cellules et le nombre de cellules avec des foyers cytosolique dans chaqueCadre. En raison de la difficulté de segmenter les cellules à partir d&#39;images de champ lumineux, la quantification doit être effectuée manuellement. Dans ce qui suit, l&#39;analyse des données est décrit pour le logiciel de traitement d&#39;image libre ((http://fiji.sc/Fiji). Il requiert le plugin &quot;Cell Counter&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Évaluer nombre total de cellules <ol><li> Chargez le brillant image de champ pile (XYT) en cliquant sur &quot;Fichier&quot; et &quot;Open&quot;. </li><li> Ouvrez le &quot;Cell Counter&quot; plugin ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Cell Counter&quot;). Chargez la pile d&#39;image en cliquant sur &quot;Initialisation&quot;. </li><li> Choisissez le type approprié de compteurs en cochant la case appropriée. REMARQUE: l&#39;utilisation de type 1 comme compteur pour le nombre total de cellules et de type 2 en tant que contre des cellules avec des foyers cytosolique. Comptez toutes les cellules. </li><li> Enregistrer les marqueurs en cliquant sur &quot;Enregistrer les marqueurs&quot;. </li></ol></li><li> L&#39; évaluation du nombre de cellules avec des foyers cytosolique <ol> &lt;li&gt; Charger HyperStack d&#39;image de fluorescence (XZYT) ( &quot;Fichier&quot; - &quot;Ouvrir&quot;) et faire une projection d&#39;intensité maximale en utilisant le &quot;Z-projecteur&quot; (image / Stacks). </li><li> Ouvrez le plug-in &quot;Cell Counter&quot;. Charger l&#39;image pile résultante (XYT) en cliquant sur &quot;Initialisation&quot;. </li><li> Chargez les marqueurs en cliquant sur &quot;marqueurs de charge». ATTENTION: Les noms de fichier de l&#39;image de référence et la pile de fluorescence doivent être identiques. Si nécessaire, renommer en conséquence avant l&#39;initialisation de la pile d&#39;images. </li><li> Choisissez le type de marqueur approprié (voir 3.1.3) et compter les cellules avec des foyers cytosolique. Les marqueurs existants peuvent être utilisés comme guide pour la position des cellules individuelles. </li><li> Récupérer le nombre de coups par tranche en cliquant sur &quot;Résultats&quot; et enregistrer les chiffres ailleurs pour d&#39;autres calculs. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li>
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<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li>
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<li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li>
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</ol>

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Le protocole décrit ici peut être utilisé pour étudier le comportement d&#39;une protéine particulière d&#39;intérêt en réponse au stress induit par la chaleur. Augmentation de la température à 30 ° C a été rapporté pour déclencher la réponse au stress de la chaleur et dans ces conditions , la viabilité de D. discoideum est nettement réduite. Modifications Le protocole peut être modifié pour comparer le comportement des différentes protéines dans les mêmes conditions de stress. Pour cela, les cellules exprimant des protéines différentes avec le même marqueur fluorescent sont transférés dans des boîtes multi-puits, tels que quatre plats de chambre (section 1.3.1). Le protocole peut également être appliquée sur les cellules des protéines avec des marqueurs différents, tels que la GFP ou RFP co-exprimant. Cela peut être par exemple utilisé pour surveiller le comportement des différents composants du système de contrôle de la qualité des protéines (PQC). Les cellules exprimant GFP-tagged agrégation marqueur et différents composants PCQ DP marqués peuvent être observés à l&#39;aide multi-puitsprodiguées pour l&#39;imagerie. Cela garantit les mêmes conditions de stress (vitesse de montée en température / diminution, la durée de la température augmentation / diminution) et permet des études comparatives. En outre, le protocole peut être utilisé pour étudier l&#39;influence du système PQC sur la réponse au stress thermique. L&#39;activité des composants peut être modulée en modifiant les niveaux d&#39;expression en utilisant des outils génétiques tels que knock-out ou à la surexpression ou en utilisant des inhibiteurs spécifiques disponibles dans le commerce 6. Le protéasome peut être inhibée par l&#39;addition MG132 (100 uM) ou de lactacystine (10 uM) dans le milieu de croissance. Le chaperon Hsp90 peut être inhibée en utilisant geldanamycine (6 uM) ou radicicol (10 uM). Le chaperon Hsp70 peut être inhibée avec VER-155088, bien que nous ne pouvions pas confirmer l&#39;efficacité de l&#39;inhibition dans nos paramètres expérimentaux jusqu&#39;à présent. Les inhibiteurs devraient être ajoutés un jour avant l&#39;imagerie et les cellules sont incubées pendant 14 heures. Criti<html> cal étapes dans le protocole L&#39;étape critique pour l&#39;évaluation de la perturbation induite par la chaleur est l&#39;état des cellules avant l&#39;expérience d&#39;imagerie. Des études ont montré que la levure cellules acquièrent une résistance à divers stress environnementaux durant la phase stationnaire 13. Nous avons également observé la réactivité minimale à appliquer le stress thermique si D. cellules discoideum avaient atteint la phase stationnaire avant l&#39; imagerie. Par conséquent, le maintien d&#39; un numéro de cellule constante de &lt;5 x 10 5 cellules / ml est critique. En outre, un nombre élevé de cellules peuvent induire la transition du cycle végétatif de D. discoideum le cycle de développement, déclenchant ainsi des voies de famine, ce qui pourrait conduire à une réponse différente au stress thermique. Si un grand nombre de cellules sont atteintes dans la phase de récupération après un stress thermique, le streaming et les cellules d&#39; agrégation peuvent interférer avec l&#39; analyse des données que les cellules se déplacent hors du foyer (voir la figure 4). content &quot;&gt; Limitation de la Technique La perte de concentration est le goulot d&#39;étranglement du protocole. Au cours de changements de température, le plan focal peut changer de façon drastique, ce qui nécessite un recentrage manuel dans une période de temps immédiatement après un changement de température. Le saut dans le foyer peut parfois être trop extrême pour être vaincu par l&#39;autofocus du logiciel, surtout si le temps entre les points de temps est élevé. Cependant, si le microscope utilisé est équipé d&#39;une mise au point automatique du matériel, ce goulot d&#39;étranglement peut être contournée. Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes En comparaison avec les configurations existantes, telles que l&#39;utilisation des chambres climatisées, des boîtes d&#39;incubation à température contrôlée couvrant les objectifs et les étapes de la phase de microscope ou à température contrôlée et des colliers objectifs, l&#39;utilisation d&#39;une chambre de refroidissement fournit un contrôle plus précis de la température ambiante température. Le Peltier-élément dans la chambre de refroidissement peut maintenir un système constant et uniformetempérature tout au long du montage expérimental. Dans les configurations classiques, les différences locales de température peuvent conduire à des résultats différents d&#39;observation. En outre, il peut réagir rapidement et rapidement aux changements induits dans la température, tandis que des configurations classiques d&#39;adapter très lentement aux changements de température induits, en particulier l&#39;abaissement de la température. Le Peltier-élément dans la chambre de refroidissement peut également couvrir une gamme plus large de température (15-40 ° C) que les configurations classiques, avec lesquelles des températures atteignant telles que 15 ° C ou 40 ° C est très difficile. Dictyostelium discoideum est particulièrement sensible à la photo-toxicité. Des études antérieures utilisées ascorbate comme fixateur pour réduire la photo-toxicité. Toutefois, les périodes d&#39;imagerie longues nécessitent un supplément additionnel. De plus, l&#39;utilisation d&#39;ascorbate est limitée aux études où le mécanisme d&#39;intérêt ne sont pas affectés par le supplément d&#39;antioxydants. Nous proposons que l&#39;imagerie à température contrôlée peut être utilisé comme une solution de rechange approche pour minimiser la photo-toxicité et peut être combiné avec l&#39;addition d&#39;ascorbate de diminuer encore la toxicité. effets phototoxiques peuvent être réduits au minimum en prévoyant une température constante et uniforme de 23 ° C en utilisant une chambre de refroidissement. Les cellules imagées en utilisant le contrôle de la température montrent moins de signes de photo-toxicité, tels l&#39;arrondissement des cellules, pour une période de temps plus longue. Cela permet également l&#39;imagerie avec des intensités plus élevées, des intervalles de temps plus petits ou plus champs de vision (FOV). Application générale Le stress thermique à des températures plus élevées a été montré pour déclencher une réaction de stress de chaleur différente 14. Par conséquent, l&#39;augmentation de la température à 34 ° C ou 37 ° C, peut induire une réponse différente. En plus de la contrainte de la température appliquée, la durée d&#39;une situation de stress particulière peut être modifié de manière à étudier la réponse immédiate ou à l&#39;adaptation à long terme du stress thermique. En général, le protocole décrit peut êtreétendu à un large éventail d&#39;applications. Parce que le contrôle précis de la température permet de réduire considérablement les effets photo-toxiques, le protocole peut être utilisé dans des environnements qui nécessitent des temps d&#39;exposition élevés et / ou des intensités de lumière d&#39;excitation, par exemple pour visualiser les protéines avec un faible niveau d&#39;expression, ou en combinaison avec des intervalles de temps courts entre l&#39; imagerie, par exemple, lors de l&#39; imagerie time-lapse. Il peut également être avantageux pour l&#39; imagerie d&#39; objets couvrant toute la cellule, par exemple, les microtubules, étant donné que ces paramètres nécessitent un grand nombre de profilés en Z optiques.

Dictyostelium discoideum sont solitaires amibes vivant du sol qui se nourrissent de bactéries et d&#39; autres micro - organismes, qui sont prises par phagocytose. Il a un cycle de vie unique et remarquable qui a été un domaine de recherche important depuis sa découverte 1. L&#39;intérêt précoce pour le développement multicellulaire 2 et la base moléculaire de la chimiotaxie 3 a été rapidement complétée par des études portant sur la motilité cellulaire, la polarité cellulaire, l&#39; immunité innée. En outre, D. discoideum a été introduit en tant que système modèle pour la recherche biomédicale 4,5. Récemment, nous avons établi D. discoideum comme un nouveau système pour étudier le contrôle de la qualité des protéines (PQC) 6,7 système. Son protéome est enrichi en protéines prion-like d&#39;agrégation sujettes, ce qui pose un défi à la protéine de contrôle de la qualité 8. Afin de déterminer si D. discoideum a développé des mécanismes moléculaires spécifiques pour contrôler sa très aggrégation sujettes protéome, nous avons étudié le comportement des marqueurs de protéines d&#39;agrégation sujettes à la fois dans des conditions de croissance normales et pendant le stress. Les conditions de stress, tels que le stress thermique, peuvent être utilisés pour augmenter le taux de protéines repliement 9. Par conséquent, nous avons cherché un système où l&#39;on pouvait induire des changements de température et simultanément suivre le comportement des protéines marqueurs. A cet effet, nous avons combiné l&#39;imagerie des cellules vivantes avec chauffage Peltier contrôlé en utilisant une (chambre de refroidissement) insert de scène thermique. Cette méthode nous a permis de maintenir une température constante et uniforme, ainsi que pour induire un changement rapide de la température, mais précis. Imagerie des cellules vivantes est utilisé pour étudier une variété de processus biologiques dans D. discoideum. Cependant, cette approche se heurte à deux limites majeures. Tout d&#39;abord, les cellules présentent une grande mobilité et ont tendance à migrer hors du champ de vision, donc le suivi de cellules individuelles nécessite souvent l&#39;imagerie d&#39;une grande surface. La mobilité cellulaire peutêtre réduite par Agar overlay 10, cependant, ces conditions ne conviennent pas pour imagerie longue durée en raison d&#39;une baisse de la viabilité. En second lieu , D. cellules discoideum montrent une sensibilité particulièrement élevée à la photo-toxicité, qui se traduit par l&#39; arrondissement des cellules et arrêt de la mitose 11. Protocoles précédents ont abordé cette question par addition d&#39;ascorbate comme fixateur et la réduction des temps d&#39; exposition 12 radical. Ce dernier peut être critique si la protéine d&#39;intérêt est exprimée à des niveaux bas et montre un signal de fluorescence faible. Les auteurs suggèrent également de fournir une température constante de 21 ° C , soit par imagerie dans une salle climatisée ou en utilisant des boîtes d&#39;incubation à température contrôlée, qui couvrent l&#39;objectif et microscope étape 12. Ici, nous décrivons une méthode avec un meilleur contrôle de la température à l&#39;aide d&#39;une chambre de refroidissement fixé à 23 ° C. Au cours de l&#39;imagerie notre set-up améliore considérablement la résistance à la photo-toxicité. Ilpermet l&#39;utilisation de l&#39;augmentation des temps d&#39;exposition et intensités lumineuses plus élevées d&#39;excitation. Ceci est d&#39;une importance particulière lors de l&#39;imagerie time-lapse, les intervalles de temps doivent être soigneusement équilibrée par rapport au nombre de positions imagées et le temps d&#39;exposition utilisé. La possibilité d&#39;augmenter le nombre de postes imagées permet également la couverture d&#39;une zone de formation d&#39;image plus large et facilite le suivi de cellules individuelles pendant une période de temps plus longue.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo</td><td>medium</td><td>ForMedium LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Antenne parabolique d’imagerie à fond</td></tr> de <tr><td>verre CellViell Antenne de culture cellulaire</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>Antenne d’imagerie à fond de verre à 4 compartiments</td></tr><tr><td>Chauffage de scène/Refroidisseur Insert</td><td>Warner Instruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de température bipolaire</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Système de refroidissement liquide</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;étude de la protéine système de contrôle de la qualité des<em&gt; d. discoideum</em&gt; utilisation de cellules vivantes d&#39;imagerie à température contrôlée

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Le mode de vie complexe de l’amibe sociale Dictyostelium discoideum en fait un modèle précieux pour l’étude de divers processus biologiques. Récemment, nous avons montré que D. discoideum est remarquablement résistant à l’agrégation des protéines et peut être utilisé pour obtenir des informations sur le système de contrôle de la qualité des protéines cellulaires. Cependant, l’utilisation de D. discoideum comme système modèle pose plusieurs défis aux approches expérimentales basées sur la microscopie, tels que la motilité élevée des cellules et leur sensibilité à la phototoxicité. Ce dernier s’avère particulièrement difficile lors de l’étude de l’homéostasie des protéines, car les effets phototoxiques peuvent induire une réponse cellulaire au stress et ainsi modifier le comportement du système de contrôle de la qualité des protéines. 
L’augmentation de la température est un moyen couramment utilisé pour induire un stress cellulaire. Nous décrivons ici un protocole d’imagerie contrôlable en température, qui permet d’observer les perturbations induites par la température chez D. discoideum. De plus, lorsqu’il est appliqué à une température de croissance normale, ce protocole d’imagerie peut également réduire sensiblement la phototoxicité, permettant ainsi une imagerie avec des intensités plus élevées. Cela peut être particulièrement utile lors de l’imagerie de protéines à très faible niveau d’expression. De plus, la grande mobilité des cellules nécessite souvent l’acquisition de plusieurs champs de vision pour suivre les cellules individuelles, et le nombre de champs doit être équilibré par rapport à l’intervalle de temps et au temps d’exposition souhaités.

Le protocole d&#39;imagerie décrit peut être utilisé pour analyser le comportement des protéines prion-like agrégation sujettes à l&#39;amibe D. discoideum lors d&#39;un stress thermique. La figure 1 montre la distribution de la GFP-tagged polyglutamine protéine Q103 dans les cellules dans des conditions de croissance normales (figure 1A), après 2 heures de stress thermique à 30 ° C (figure 1B) et après 6 heures de récupération du stress et la croissance dans des conditions de croissance normales (figure 1c). Lors d&#39;une augmentation de température de 23 ° C à 30 ° C, le marqueur de Q103-GFP coalesce d&#39;une distribution diffuse à ponctuée structures. Après la libération du stress et de la croissance à la température normale, ces structures se dissolvent. La redistribution des Q103-GFP et la formation de stress induit par cytosolique foyers de chaleur peuvent être quantifiés en utilisant l&#39; analyse de l&#39; image. La figure 2A montre l&#39;analyse des FOV individuels en utilisant les Fidji et le plug - in &quot;Cell counter &quot;. La figure 2B montre la quantification de la réponse au stress de chaleur. Cela montre que l&#39;augmentation de cytosolique de foyers Q103-GFP en nombre avec la poursuite du stress thermique. Lors d&#39;un stress thermique, le contrôle de la qualité des protéines du système (PQC) est débordé, ainsi aggregation- protéines sujettes telles que la protéine Q103 prion-like ne peuvent pas être maintenus dans un état soluble et de plus en plus global dans les foyers cytosolique. les cellules montrent aussi un arrondi caractéristique, comme représenté sur la figure 1B. la réduction des foyers cytosolique après l&#39; élimination du stress suggère que la agrégée les protéines sont dissoutes. La qualité d&#39;image est sensible à la densité cellulaire initiale. La figure 3 montre un exemple des cellules après la récupération du stress, en comparant la densité initiale de cellules appropriée (figure 3A) et la densité cellulaire initiale élevée (figure 3B). Si la densité cellulaire initiale était trop élevé, les cellules étoilested pour former des courants comme représenté sur la figure 3b. Ce qui impose des difficultés sur la quantification ultérieure lorsque les cellules sont déplacées hors du plan focal. Le procédé décrit peut être utilisé pour surveiller les modifications induites par la température, comme décrit ci-dessus. Il peut également être utilisé pour réduire la photo-toxicité lors de l&#39; imagerie à la température de croissance physiologique. La figure 4 montre une comparaison des cellules imagées à 23 ° C dans une chambre de refroidissement (figure 4A) et des cellules imagées sans contrôle de la température dans une pièce climatisée, définie à 25 ° C (figure 4B). Lors de l&#39;exposition constante à la lumière d&#39;excitation, les cellules complètent lorsqu&#39;ils ne sont pas imager dans des conditions à température contrôlée. Ce changement de forme de la cellule est indiquant stress. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figure 1: <strong&gt; protéines prion-like agrégation sujettes modifier leur distribution cellulaire lors d&#39;un stress thermique. GFP-tagged polyglutamine riche huntingtine exon 1 (Q103) est constitutivement exprimée en AX2-214 D. cellules discoideum (signal GFP représenté dans inversé table de conversion d&#39;échelle de gris). (A) Dans des conditions normales de croissance à 23 ° C, Q103-GFP est répartie de manière diffuse dans le cytoplasme. (B) Après 2 heures de stress thermique à 30 ° C, Q103-GFP coalescence dans des foyers cytosolique (flèches rouges). Les cellules montrent un changement de forme caractéristique et complètent. (C) Après la libération du stress et de la croissance à 23 ° C, les foyers cytosolique sont dissous. Au bout de 6 heures, aucun foyer cytosolique peut être observée. Barre d&#39;échelle = 10 pm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 2: Quantification de cytosolique formation de foyers induite par la chaleur (A) Analyse des cellules en utilisant le paquet de traitement d&#39; image libre Fidji et le plug - in &quot;Cell Counter&quot;.. La quantité totale de cellules (type 1, contre marqueurs bleus) est déterminée dans l&#39;image lumineuse de champ. Les marqueurs sont chargés dans le canal de la GFP et le nombre de cellules avec des foyers cytosolique (type 2, les contre marqueurs rouges) est déterminée. (B) Quantification des foyers après 3 heures de stress thermique à 30 ° C et 3 heures de récupération du stress à 23 ° C (n = 4 champs de vision, erreur bar = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figure 3: Effet de la densité cellulaire sur l&#39; imagerie time-lapse à long terme (A) Les cellules imagées à des densités initiales de cellules &lt;10 5 cellules / ml.. Après 3 heures de stress thermique à 30 ° C et 6 h de récupération de stress à 23 ° C, les cellules restent dans le cycle végétatif et se divisent. Seulement quelques cellules sortent du plan focal. (B) des cellules imagées à des densités cellulaires initiales&gt; 10 6 cellules / ml. Après 9 heures d&#39;imagerie (paramètres comme dans A), les cellules sont entrées dans le cycle de développement et a commencé le streaming et l&#39;agrégation. Les cellules dans les agrégats ne peuvent pas être clairement distingués. Une grande partie des cellules sort du plan focal et ne peut pas être analysé. Barre d&#39;échelle = 10 pm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figure 4:. Effet de la régulation de la température sur les effets phototoxiques (A) Les cellules imagées pendant 10 min avec contrôle de température à 23 ° C: 6 champs de vision, z-stack (espacement 0,5 uM, épaisseur de l&#39; échantillon 8 uM), laps de temps (total temps 10 min, laps 1 min), le canal GFP (0,07 msec temps d&#39;exposition, l&#39;intensité du laser de 10%), le canal de RFP (0,1 msec de temps d&#39;exposition, 10% l&#39;intensité du laser). Les cellules ne montrent aucun signe de changements morphologiques caractéristiques associées au stress phototoxique. (B) des cellules imagées pendant 10 minutes sans contrôle de la température (mêmes conditions que dans A). Les cellules présentent des signes de phototoxique induit arrondi, ce qui indique le stress. Barre d&#39;échelle = 10 pm. Les cellules ont été imagées sur un système basé sur un microscope avec un 100x / 1.4 ouverture numérique (NA) objectif. Les images ont été recueillies à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD en tant que 1,024 x 1,024 fichiers de pixel à l&#39;aide de 1 x 1 binning.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L’amibe sociale Dictyostelium discoideum a récemment été établie comme système pour étudier le mauvais repliement des protéines et la protéostasie. Ici, nous décrivons une nouvelle méthodologie basée sur l’imagerie pour étudier l’agrégation de protéines induite par la température et la réponse au stress cellulaire chez D. discoideum.

L&#39;étude de la protéine système de contrôle de la qualité des<em&gt; D. discoideum</em&gt; Utilisation de cellules vivantes d&#39;imagerie à température contrôlée

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

L'objectif général de cette technique d'imagerie est d'observer les perturbations cellulaires induites par un stress thermique chez les cellules de Dictyostelium discoideum. Cette méthode peut aider à comprendre les mécanismes de réponse au stress thermique et de contrôle de la qualité des protéines chez l'amibe Dictyostelium discoideum. Le principal avantage de cette technique réside dans le contrôle précis et rigoureux de la température appliquée aux cellules lors de l'acquisition d'images.Pour commencer la procédure, préparez les cellules de Dictyostelium comme décrit dans le protocole écrit. La veille de l'observation, divisez les cellules dans un milieu à faible fluorescence à raison de 10 000 cellules par millilitre. Avant l'observation, récoltez les cellules à partir de la plaque de culture dans du LFM, puis transférez un nombre adéquat de cellules dans des boîtes en verre à fond de verre.Laisser les cellules se déposer pendant 20 minutes, puis remplacer soigneusement le milieu utilisé par du milieu frais afin d'éliminer les cellules non déposées. Observer les cellules dans des conditions non stressantes à 23 degrés Celsius et acquérir un minimum de six champs. Enregistrer des séries en Z d'un maximum de sept micromètres par pas de 1 à 0,25 micromètre afin de capturer tout le volume cellulaire.Ensuite, acquérez une image de référence en champ clair pour évaluer le nombre total de cellules. Ajustez ensuite la température de la chambre de refroidissement à 30 degrés Celsius. Une fois que l'affichage de la température a atteint la valeur souhaitée, recentrez manuellement dans le canal champ clair.Vérifiez tous les champs observés enregistrés avant de commencer le laps de temps, puis lancez un laps de temps de quatre heures de stress thermique avec un intervalle de cinq à dix minutes entre chaque point temporel. Vérifiez que la mise au point est correcte pendant l'acquisition des deux premiers points temporels. Une fois le stress thermique terminé, réduisez la température à 23 degrés Celsius.Attendre que l'affichage de la température se stabilise et effectuer une mise au point manuelle. Ensuite, enregistrer des films en laps de temps pendant la phase de récupération pendant huit à dix heures à des intervalles de dix à vingt minutes. Vérifier que la mise au point est correcte pendant l'acquisition du premier point temporel.Commencez par ouvrir le logiciel de traitement d'images équipé du module complémentaire Cell Counter. Chargez la pile d'images en champ clair en cliquant sur Fichier, puis sur Ouvrir. Ensuite, ouvrez le module complémentaire Cell Counter et chargez la pile d'images en cliquant sur Initialiser.Choisissez le type de compteurs en cliquant sur la case appropriée. Ensuite, comptez le nombre total de cellules et enregistrez les marqueurs en cliquant sur Enregistrer les marqueurs. Une fois les marqueurs enregistrés, chargez la projection maximale de la hyperpile d'images de fluorescence.Ouvrez le plugin Cell Counter et chargez les marqueurs en cliquant sur Charger les marqueurs. Ensuite, choisissez le type de marqueur pour les foyers cytosoliques et comptez les cellules. Les marqueurs existants peuvent servir de guide pour la position des cellules individuelles.Récupérez le nombre de comptages par coupe en cliquant sur Résultats, puis enregistrez les comptages ailleurs pour des calculs ultérieurs. Dans cette étude, la distribution de la protéine polyglutamine marquée par GFP, Q103, a été observée dans des cellules de Dictyostelium. Dans des conditions de croissance normales, Q103-GFP est répartie de manière diffuse dans le cytoplasme.Lors d'un stress thermique, le marqueur Q103-GFP s'agglomère en structures ponctuées. Après la disparition du stress et la reprise de la croissance dans des conditions normales, ces structures se dissolvent. La redistribution du Q103-GFP et la formation de foyers cytosoliques induits par le stress thermique sont quantifiées à l'aide d'une analyse d'image.Les résultats représentatifs de la réponse au stress thermique peuvent être observés ici. Le nombre de cellules présentant des foyers cytosoliques de Q103-GFP augmente avec la prolongation du stress thermique. Pendant le stress thermique, le système de contrôle de qualité des protéines est saturé, de sorte que les protéines enclines à l'agrégation ne peuvent pas rester à l'état soluble.Après un stress thermique, le nombre de cellules présentant des foyers cytosoliques diminue, ce qui suggère que les protéines agrégées se dissolvent. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment surveiller les perturbations induites par un stress thermique chez l'amibe Dictyostelium discoideum. Pendant l'acquisition d'images, il est important de se rappeler de bien ajuster la mise au point, si votre microscope ne possède pas de mise au point automatique matérielle.Le contrôle de température décrit dans ce protocole peut être utilisé au-delà du domaine de la réponse au stress thermique. L’imagerie effectuée dans des conditions normales de croissance en utilisant un contrôle de température peut réduire notablement les effets phototoxiques.

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