Surveillance spatiale Ségrégation en surface Colonizing populations microbiennes

L’objectif général de cette procédure est d’observer la distribution spatiale des souches microbiennes pendant l’essaimage, le glissement ou la formation de biofilms à l’aide de la microscopie fluorescente. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie sociale, telles que la façon dont la ségrégation spatiale influence l’interaction microbienne. Le principal avantage de cette technique est que la valeur adaptative et la distribution spatiale des souches microbiennes peuvent être facilement évaluées à l’aide de techniques microscopiques et d’une analyse d’images de sous-segments.

Theresa Holscher, une chercheuse doctorante de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. La veille de l’expérience, ajoutez trois millilitres de milieu LB dans un tube de culture et inoculez-le à partir d’un stock de congélation de B. subtilis. Répétez cette inoculation avec un tube séparé pour chaque souche d’intérêt.

Placez les tubes dans un incubateur à agitation horizontale à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour préparer des plaques pour des expériences d’essaimage et de glissement, versez 20 millilitres de milieu LB trempé dans une boîte de Pétri en polystyrène de 90 millimètres. Fermez immédiatement le plat et placez-le sur un côté de la hotte stérile pour qu’il refroidisse pendant au moins une heure.

Ensuite, préparez des plaques pour les expériences sur le biofilm de colonie en versant 25 millilitres de gélose deux fois SG dans une boîte de Pétri de 90 millimètres. Fermez immédiatement les assiettes et laissez-les refroidir par piles de quatre ou moins pendant au moins une heure. Pour commencer, placez les plaques d’essaimage et de glissement de gélose LB dans une hotte à flux laminaire et retirez les couvercles.

Laissez sécher les plaques pendant 20 minutes. L’humidité des plaques dans ces expériences est critique. Alors que l’excès d’humidité permet aux bactéries de nager, un séchage prolongé empêche l’essaimage et le glissement.

De même, la structure du biofilm de la colonie dépend de la sécheresse du milieu. À l’aide d’un spectrophotomètre, déterminez les densités optiques des cultures de démarrage de nuit à 600 nanomètres. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, mélanger des quantités normalisées de protéines fluorescentes vertes et rouges produisant des souches pour un total de 200 microlitres.

Faites tourbillonner le tube pendant trois secondes. À l’aide d’une micro-pipette, placez deux microlitres de la culture mixte au centre d’une plaque de gélose LB de 90 millimètres pré-séchée dans la hotte à flux laminaire. Faites sécher la plaque pendant 10 minutes.

Enfin, incubez les plaques à 37 degrés Celsius en position verticale pour éviter que la condensation ne s’accumule à la surface de la gélose. Tout d’abord, placez les plaques de gélose deux fois SG dans une hotte à flux laminaire pendant 15 minutes pour qu’elles sèchent. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de chacune des souches de biofilm productrices de protéines fluorescentes vertes et rouges, les cultures de démarrage B.subtilis 168, dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Faites tourbillonner le tube pendant trois secondes. Préparez des tubes avec 100 microlitres de milieu LB et, en utilisant la culture mixte, créez une série d’inoculats de dilution 10 fois. À l’aide d’une micro-pipette, placez deux microlitres de culture mixte non diluée sur la plaque de gélose deux fois SG.

Répétez cette opération avec des inoculats pour les 10 à un, 10 à deux, 10 à trois et 10 à quatre dilutions, en espaçant les points à des distances égales pour permettre à six à neuf colonies d’être cultivées sur une seule boîte. Incuber les assiettes à la verticale à 30 degrés Celsius pendant un à trois jours. Pour commencer, placez les plaques sur la plate-forme d’imagerie d’un microscope à détection de fluorescence.

Pour les expériences de glissement et d’essaimage, placez l’origine de l’inoculation, le milieu de la boîte de Pétri, dans le coin du champ visible pour permettre la mesure de l’expansion radiale de la colonie. Ajustez le grossissement à la résolution la plus élevée qui permet d’imager la plus grande région possible de la plaque de 90 millimètres. Ajustez le temps d’exposition de manière appropriée, en fonction de l’intensité du signal fluorescent.

Pour l’analyse du biofilm, positionnez une colonie d’intérêt au centre du champ de vision. Réglez le grossissement à la résolution la plus élevée qui permet de voir toute la colonie. Les colonies sont maintenant prêtes pour la mesure et l’analyse.

Enfin, analysez les données comme décrit dans le protocole texte. Cette figure montre la croissance d’une colonie typique de Bacillus subtilis co-inoculée à deux souches. L’essaimage, qui est un mouvement collectif de surface dépendant des flagellants, entraîne une population très mélangée.

Dans cette vidéo en accéléré, l’inoculant initial a été placé au centre de la plaque étalée. Un essaimage en couche mince est clairement observé et, au fur et à mesure que la colonie se développe, les deux souches fluorescentes rouges et vertes apparaissent mélangées et se chevauchant. À l’inverse, les images de comportement de glissement montrent des secteurs de croissance définis correspondant aux souches fluorescentes étiquetées différemment

Cette vidéo montre la croissance d’une colonie co-inoculée glissante dans laquelle les souches n’ont pas de flagelles fonctionnels. Ces colonies sont toujours capables de se propager en utilisant une combinaison d’exo-polysaccharide sécrété, d’hydrophobine et de surfactine. Les colonies résultantes présentent un assortiment de croissance spatiale distinct par rapport à la souche d’essaimage.

Les densités cellulaires initiales des colonies productrices de biofilm ont fortement influencé l’assortiment spatial des colonies résultantes. Les colonies initiées avec une forte densité cellulaire des populations mixtes ont montré un assortiment spatial mineur ou nul. En revanche, lorsque la densité cellulaire au moment de l’initiation était faible, des secteurs fluorescents vert clair et rouge pouvaient être détectés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer les abondances relatives des souches marquées par fluorescence dans les colonies microbiennes, d’examiner la ségrégation spatiale et d’étudier l’influence de la densité cellulaire fondatrice.