CARACTERISATION Microbiome dynamique – écoulement Cytometry basé dans les Workflows de Cultures pures des communautés naturelles

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en écologie microbienne et en biotechnologie, par exemple, quels concepts écologiques sont à l’origine d’un écosystème donné. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour fermer la dynamique rapide du microbiome suivante avec le régime d’échantillonnage à intervalles courts tout en restant très rentable. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir des informations sur les communautés microbiennes biotechnologiques et naturelles, ainsi que sur les microbiomes animaux et humains pour les états nutritionnels et de santé.

Florian Schattenberg, technicien et opérateur du SediMeter dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour sécher un échantillon de biogaz communautaire, utilisez une pointe de pipette modifiée d’un millilitre pour transférer 200 microlitres de digestat visqueux dans un tube de deux millilitres contenant 1,7 millilitre de PBS. Après un mélange minutieux, placez les tubes dans un bain à ultrasons pendant une minute pour dissoudre tous les gros agrégats cellulaires et fixer les cellules collées aux résidus de cellules végétales.

Après la sonication, mélangez soigneusement l’échantillon et filtrez les cellules à travers une crépine à mailles interstitielles de 50 micromètres dans un tube en plastique de 2 millilitres. Divisez le filtrat en quatre aliquotes de 400e microlitre et centrifugez les aliquotes deux fois, en éliminant complètement le surnageant les deux fois pour déshydrater mécaniquement l’échantillon de microbes aussi complètement que possible. Ensuite, séchez l’échantillon dans une centrifugeuse à vide chauffée pour créer une pastille stable et stockez-la à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière.

Pour la stabilisation et la fixation d’échantillons de boues activées, centrifuger quatre millilitres de cellules et remettre en suspension la pastille dans quatre millilitres de formaldéhyde à deux pour cent dans du PBS. Après 30 minutes à température ambiante, centrifugez l’échantillon de cellule stabilisé et fixez la pastille dans quatre millilitres d’éthanol à 70 % pour un stockage à moins 20 degrés Celsius. Mélangez et transférez 0,6 millilitre de suspension à cellules fixes dans un tube de verre contenant 1,4 millilitre de PBS et, après un mélange minutieux, faites du sonicate pendant 10 minutes, comme il est démontré.

À la fin de la sonication, récupérez les cellules par centrifugation, et remettez en suspension la pastille dans deux millilitres de PBS frais. Après un mélange minutieux, sonicez les cellules comme nous venons de le démontrer pendant cinq minutes et ajustez l’OD 700 nanomètres à 035 avec du PBS frais. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de perméabilisation contenant 0,11 molaire d’acide citrique et 4,1 millimolaire entre 20, avec un mélange minutieux, pour une incubation de 20 minutes à température ambiante.

Ensuite, collectez les cellules par centrifugation et remettez complètement la pastille en suspension dans deux millilitres de solution de coloration contenant 0,68 DAPI micromolaire, pour une incubation d’au moins 60 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Pour l’étalonnage des billes, chargez le mélange de billes pour l’étalonnage linéaire dans le cytomètre en flux et mesurez les billes en continu tout en manipulant les positions de la buse et de l’optique laser pour pré-étalonner l’instrument dans la plage linéaire. Lorsque les pics de billes peuvent être intégrés dans un modèle d’étalonnage prédéfini, passez en mode journal et chargez un échantillon de billes d’étalonnage logarithmique.

Ajustez les pics de billes logarithmiques à leur modèle d’étalonnage prédéfini pour affiner le matériel de l’instrument, et utilisez le réglage de gain du tube photomultiplicateur pour effectuer les ajustements finaux nécessaires à la position de la perle. L’aspect le plus critique de cette procédure est de maintenir des mesures cohérentes pour permettre la comparabilité entre les expériences. Par conséquent, l’étalonnage quotidien du cytomètre et l’utilisation de billes dans les paupières biologiques sont essentiels au succès de la dialyse lente du microbiome cytromique. Lorsque les cellules sont prêtes, mélangez et filtrez les échantillons et ajoutez le mélange de billes logarithmiques aux cellules.

Maintenant, mélangez et chargez l’échantillon sur le cytomètre et créez une porte pour inclure les cellules colorées et exclure le bruit et les billes. Ensuite, analysez l’ensemble d’échantillons consécutivement à une vitesse maximale de 3 000 événements par seconde jusqu’à ce que 250 000 cellules soient détectées à l’intérieur de la porte de la cellule. Pour analyser les données de cytométrie en flux, développez un modèle de porte maître à utiliser sur tous les échantillons.

Commencez par charger les fichiers standard de cytométrie en flux dans un programme d’analyse de cytométrie en flux approprié et traitez les échantillons successivement. Chargez les échantillons, double-cliquez sur une mesure et sélectionnez les paramètres des axes X et Y, dans leurs menus déroulants respectifs, pour ouvrir un graphique de fluorescence de diffusion directe en fonction de DAPI. Utilisez l’outil de dessin de polygone pour reproduire la porte de cellule de mesure générée précédemment afin d’exclure les perles et le bruit, et nommez la porte en conséquence.

Faites glisser l’entrée de la porte de cellule dans la liste de groupe tous les échantillons, puis double-cliquez sur la porte de cellule pour afficher de manière sélective uniquement les événements de cellule. Définissez les sous-communautés prévalant dans un échantillon à l’aide de l’outil de porte elliptique et regroupez-les. Ajoutez ensuite des allocations de sous-communautés supplémentaires et des échantillons ultérieurs jusqu’à ce que le modèle de porte maître s’adapte à tous les échantillons.

Contrôlez le modèle de la porte principale à l’aide de la méthode de balayage par diffusion latérale pour résoudre les sous-communautés qui se regroupent à proximité les unes des autres. Ensuite, ajoutez toutes les sous-communautés à l’éditeur de table et définissez la statistique de sortie sur la fréquence du parent. Utilisez l’éditeur de tableaux pour exporter les abondances relatives des sous-communautés dans un tableur approprié, et adaptez le formatage des données selon les directives du manuel de la barre latérale.

Ensuite, pour visualiser la dynamique et les corrélations de la sous-communauté, installez et chargez le package R, puis chargez et normalisez le fichier txt. Les graphiques de fluorescence par diffusion directe par rapport à la fluorescence DAPI révèlent les états du cycle cellulaire des cultures de souches pures à différents points d’une culture par lots. L’utilisation d’un modèle de porte maître permet alors de quantifier la proportion de cellules ayant un, deux ou plusieurs chromosomes, révélant, par exemple, la capacité de ce microbe représentatif à répliquer ses chromosomes plus rapidement que son temps de génération.

Lors de l’étude de communautés microbiennes complexes au fil du temps, le rythme et l’importance du changement de communauté peuvent être facilement visualisés à l’aide d’une séquence de diagrammes à points. Les sous-communautés dominantes aux différentes étapes de l’expérience peuvent être clairement identifiées à l’aide de l’outil de code-barres cytométrique. La combinaison de ces données avec la distribution fréquentielle des abondances relatives des sous-communautés permet de sélectionner des portes démontrant des changements d’abondance significatifs à des points clés dans le temps.

La visualisation de ces données dans un graphique de mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique peut faciliter une compréhension plus approfondie de la dynamique de la communauté. Les communautés de biogaz peuvent potentiellement être confrontées à des hétérogénéités spatiales en raison des limites d’agitation. Les points d’échantillonnage de la communauté du biogaz présentent une faible hétérogénéité spatiale, mais une hétérogénéité temporelle prononcée.

De fortes corrélations positives ou négatives avec des paramètres abiotiques, tels que les resserreurs de produits, peuvent aider à comprendre et à optimiser les écosystèmes et les processus biotechnologiques. De plus, ils facilitent l’identification des points de contrôle présentant un intérêt particulier pour le tri et l’analyse ultérieurs. Lors de l’établissement de cette procédure, il est conseillé d’évaluer différentes procédures de fixation et de coloration afin d’évaluer leurs performances et leur stabilité pour chaque nouvel ensemble d’échantillons.

Après le tri, d’autres approches telles que la clôture ampliconsique, la métagénomique et la protéomique peuvent être appliquées pour sélectionner les meilleures communautés qui fournissent des informations sur l’affiliation protogénétique sur les états d’activité hors des voies métaboliques. Cette méthode a ouvert la voie aux écologistes microbiens et aux ingénieurs en bioprocédés pour suivre la dynamique du microbiome des écosystèmes naturels et contrôlés avec un investissement raisonnable en ressources.