Name: CARACTERISATION Microbiome dynamique – écoulement Cytometry basé dans les Workflows de Cultures pures des communautés naturelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour analyser la dynamique des communautés microbiennes et des cultures pures. Ce protocole permet un suivi rapide et économique des microbiomes dans divers écosystèmes.

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Nous remercions Michael Jahn et Yuting Guo pour fournir la procédure et les ensembles de données de la culture pure et de la communauté de boues activées, respectivement. Nous remercions encore Katrin Mörters pour analyser les échantillons de communauté de biogaz. Ce travail a été financé par le Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.v. (FNR, projet biogaz-Fingerprint Nr. 22008313) pour le compte du ministère fédéral allemand pour l’alimentation et l’Agriculture (BMEL), le Programme d’Innovation pour les PME (ZIM) du ministère fédéral Central des affaires économiques et de l’énergie (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), la Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, projet sur-demande Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), le ministère fédéral allemand de l’éducation et La recherche (BMBF) (FZK 03XP0041G) et axés sur le programme de financement de l’Association Helmholtz (POF III R31 sujet 3 bioénergie).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une analyse réussie des populations microbiennes et des communautés nécessite des cytomètres de flux bien réglé, un choix approprié des paramètres de maille et un flux de travail fiable de prélèvement d’échantillons et de fixation vers l’évaluation de la mesure et de données. Les paramètres de la cellule sélectionnée doivent consort avec les longueurs d’onde d’excitation disponible ; Nous utilisons et recommandons DAPI, qui est très sensible à de faibles concentrations ; mais il faut être excité par un laser UV, ce qui n’est généralement pas compris dans les configurations standard cytomètre. Autres colorants, comme le SYBR Green I, aussi tache de populations entières ou communautés mais offrent généralement des résolutions inférieures. Nous ne recommandons pas en utilisant les procédures du poisson ou des tests de viabilité dans les communautés microbiennes. Ces approches sont impossibles à quantifier, de vérifier et de contrôler leurs effets sur les espèces individuelles dans la Communauté étant incertain. Ils ne peut pas être fiable testés, tant qu’une proportion importante des communautés typiques n’est toujours pas disponible comme une culture pure.
Des étapes cruciales dans le protocole comprennent des procédures d’échantillonnage et de fixation ainsi que tri cellulaire. L’échantillonnage peut être compliquée par la tendance de certaines cultures pures et les communautés microbiennes à agréger à flocs ou adhèrent aux particules de la matrice de l’échantillon. Il est essentiel de se dissiper ces agrégats et de séparer les cellules dans un échantillon avant de leur présenter de cytométrie pour garantir des résultats fiables. Les protocoles de préparation présentées ont été optimisées pour permettre l’analyse de cellule unique. Une filtration finale 50 µm est effectuée avant la mesure pour enlever n’importe quel agrégat résiduelle et empêcher la buse de 70 µm de la trieuse et la cuvette de l’écoulement de l’analyseur de boucher. Flocons de cellules des usines de traitement des eaux usées sont particulièrement abondante, robuste et vitale pour le fonctionnement du système. Nous avons étudié les planctoniques et boues fondé des communautés microbiennes dans les différents réservoirs d’une usine de traitement des eaux usées à grande échelle, pour tester le protocole établi. La boue formant cellule agrégats ont été clairement dissipées et la composition de la communauté est restée stables. En outre, les communautés planctoniques et axée sur les boues présentaient une similitude remarquable entre eux dans toutes les trois réservoirs échantillonnés (Figure 8, fichier complémentaire 1-S10). Ces résultats ont été vérifiés par comparatif 16 s rDNA amplicon séquençage d’une douce, une formaldéhyde traitées-, un formaldéhyde et l’éthanol fixé-et un échantillon trié10. Néanmoins, extraordinairement difficile des échantillons environnementaux, tels que les biofilms fortes ou bactéries qui poussent dans les chaînes étroitement connectés, peut être impossible de se dissiper. Des échantillons de sol peuvent être particulièrement problématiques, car les particules omniprésents apparaissent dans l’histogramme et peuvent masquer les cellules par pure abondance. Dans ce cas, les méthodes de séquençage traditionnelles doivent être appliquées.
La stabilité de la fixation de chaque nouvel ensemble de l’échantillon doit être testée avant de concevoir l’expérience pour garantir la validité du résultat. Stabilité de la bonne fixation permet également la mise en commun la souillure et la mesure de plusieurs points de temps d’échantillon sur une seule journée. Il permet en outre des mesures de réplication et rétrospective cellule Tri des moments décisifs, après la conclusion et l’évaluation finale de l’expérience. La stabilité de la fixation de la culture pure a été vérifiée pendant 28 jours (Figure 9). Pour des expériences sur place, y compris le transport de l’échantillon, la stabilité de la fixation doit être testée sur de longues périodes (dans ce cas, 60 jours pour la communauté de boues activées, 195 pour la communauté de biogaz, fichier complémentaire 1-S9).
La coloration n’est généralement pas problématique mais doit être contrôlée avec une norme biologique pour permettre l’application des outils d’évaluation de la bioinformatique. Nous avons utilisé la simulacre souche e. coli BL21 (DE3), qui a été fixé selon le protocole NCP et stockées pour une utilisation dans chaque lot de coloration.
Mis à part le DAPI, SYBR Green I a été appliquée avec succès pour résoudre des communautés microbiennes pour plusieurs années14,23,24,25,26. SYBR Green je peux résoudre les communautés en sous-ensembles de haute et basse des acides nucléiques (HNA et LNA) à l’aide de cellules vivantes dans un mode en ligne. DAPI, cependant, est plus précis dans sa liaison à l’ADN et permet la distinction de plus de 50 sous-communautés dans un seul échantillon ensemble mais nécessite une étape de fixation avant la coloration.
Cellule de tri est une caractéristique remarquable de cette approche et peut être appliquée si certaines sous-communautés présentent un intérêt supplémentaire. Il faut souligner que ni PFA-(jouée pendant seulement 30 min) ni traitement à l’éthanol ou DAPI coloration10 avait un effet négatif sur le séquençage d’amplicon 16 s ultérieures. Potentiel des influences de la fixation et coloration des procédures sur le métagénome sous-communauté analyses doivent encore à tester.
Beaucoup d’informations sur les fonctions communautaires et de la tendance dynamique peut être obtenu indépendamment de l’approche tri lorsqu’ils concernent des outils bioinformatiques qui résoudre des fonctions communautaires sur le plan de cellule par cellule virtuelle et ces fonctionnalités de connexion avec abiotiques paramètres.
Récemment, un certain nombre de nouveaux outils bioinformatiques évaluation, tous utiles pour les deux le SYBR vert j’ai et les approches DAPI, ont été développées pour résoudre des modèles communautaires par cytométrie en flux. Il s’agit de FlowFP27, les paquets utilisés dans cette étude (flowCHIC20, flowCyBar,28), un modèle de déconvolution établi avec eau douce communautés29 et un outil qui permet de discriminer les souches selon leur physiologique caractéristiques30. En outre, la diversité par cytométrie en flux peut être déterminée25 et propriétés de stabilité même des communautés microbiennes peuvent être suivies avec un outil en ligne de10.
Ainsi, les analyses de cytométrie en flux ont un énorme avantage quand il s’agit d’une évaluation rapide des communautés microbiennes et les corrélations de paramètres abiotiques. Cependant, il y a toujours les limites de la méthode. Il ne s’applique véritablement en ligne avec l’outil de flowCyBar, en raison de la procédure de réglage porte base expérimentés. En outre, le développement des cytomètres sur mesure, facile à utiliser favoriserait grandement la prolifération de l’approche d’analyse de flux par cytométrie en flux microbiome. Premiers pas dans cette direction sont entrepris28.
Les applications futures de la cytométrie microbienne peuvent imaginer en écologie microbienne, car il permet la surveillance de haute fréquence dans la plage de temps de génération bactérienne et il a été démontré que les paradigmes écologiques soient appliquent aux données par cytométrie en flux5 ,,10. La méthode est très utile pour des projections systématiques des milieux naturels comme les contrôles obligatoires de l’eau potable en Suisse31. Il peut également être un outil précieux pour des applications médicales comme humain15 ou animaux32 microbiome dépistage. En outre, derniers développements en bioinformatique permettrait la cytométrie microbienne à un capteur intégré dans les contrôles des systèmes microbiens gérés. Population microbienne cytometry fournit également un outil de dépistage pour le tri des cellules, qui permet une meilleure résolution recherches génomiques des sous-ensembles spécifiques communautaires.

Les microorganismes jouent un rôle essentiel dans de nombreux aspects de l’homme vivant. Ils sont les principaux facteurs biotiques de la carbone de planètes, azote, phosphore et soufre cycles1et acte comme dégradant2,3 comme synthèse4 biocatalyseurs dans diverses industries, telles que le traitement des eaux usées 6 5 ou la biotechnologie. Ils constituent même le microbiome humain, qui a une influence directement sur la santé humaine et métabolisme7,8. Par conséquent, les informations sur la structure, fonction et comportement dynamique des micro-organismes, en réponse à leur environnement immédiat, sont nécessaires si nous voulons bien comprendre et manipuler ces systèmes. Next generation sequencing (NGS) est la technologie établie pour résoudre microbiome structure et la fonction9. Cependant, l’analyse et l’évaluation des données de l’end ne peut pas donner des informations quantitatives et est toujours coûteux, chronophages et pas du tout prête à fournir des résultats sur place dans les couloirs de la performance. Certaines bactéries affichent l’heure de génération au-dessous de 1 h et cause de structures communautaires dans certains environnements10en constante évolution. Suite à cette dynamique, en utilisant des approches de séquençage dépasserait la capacité financière et de la main-d'œuvre des laboratoires plus scientifiques.
En revanche, cytométrie peut fournir des empreintes communautaires similaires aux données de l’end, tout en conservant une efficacité plus grande du temps, du travail et coût. Nous présentons ici les techniques de cytométrie en flux d’écoulement en mesure de suivre la dynamique communauté microbienne à ligne au niveau de la cellule unique. Contrairement à NGS, cytométrie de flux ne fournit pas d’affiliation phylogénétique ou informations sur gènes fonctionnels, mais fournit le nombre de cellules quantitative. À l’aide de cytométrie en flux, les communautés microbiennes pouvant être résolues en sous-communautés avec facteur de dispersion distinct et des propriétés de fluorescence (forward scatter (FSC) et la diffusion latérale (SSC) fournissent des indications sur la taille des cellules et la granularité, respectivement). L’approche présentée utilise principalement cell taille - et ADN s’élèvent des informations connexes qui sont associés à certains types de cellules et les États physiologiques (croissance). Le contenu en ADN est quantifié à l’aide de l’UV-excitables 4', 6-diamidino-2'-phénylindole (DAPI) colorant, se lie aux régions riches A-T de l’ADN et peut même résoudre différents niveaux chromosomiques. En combinant fluorescence DAPI et FSC plus de 50 sous-communautés peuvent distinguer et surveillées pour la commutation des abondances de temps11. Les variations d’abondance sous-communauté peuvent être corrélées avec les changements dans les environs de micro-environnementales, telles que le pH et produit des titres12, avec des paramètres globaux, tels que la météo13,14, ou en cas d’intestin ou de la salive microbiomes avec certains traitements médicaux15. Ces corrélations révèlent sous-communautés clées responsables des fonctions particulières dans le réseau métabolique de l’ensemble de la communauté. Les sous-communautés clées peuvent ensuite être spécifiquement promues supprimées en altérant les micro-environnements environnantes ou triées pour séquençage subséquent15 ou proteomic investigation16.
Cependant, cytométrie en flux communauté microbienne n’est pas encore largement établi en raison du nombre relativement faible de dispositifs de cytométrie en flux capables de résoudre correctement les populations microbiennes ou communautés. En outre, le manque d’expérience, communauté analyse pipelines et évaluation des données efficace peut poser une barrière à l’entrée des chercheurs face à des défis de l’analyse sur le microbiome. Nous avons créé des flux de travail complet pour s’attaquer à ces questions. Pour illustrer leur applicabilité générale, nous allons présenter eux sur trois ensembles d’échantillons exemplaire (fichier complémentaire 1-S1), à savoir j’ai) une culture pure (PC) pour des applications biotechnologiques, cultivées dans un milieu défini clairement (l'Pseudomonas putida KT 2440 sur le glucose), ii) une communauté de labo complexes dans un milieu transparent (Communauté de boues activées (ASC) dans les eaux usées synthétiques) et iii) une communauté complexe de milieux naturels dans une matrice dense (Communauté de biogaz (BC) en maïs ensilage).
Plusieurs facteurs influencent le choix du protocole pour chacun de ces ensembles d’échantillons. Cryogénique renonce à l’utilisation de produits chimiques toxiques, mais est essentiellement limitée à des environnements de laboratoire grâce à l’utilisation d’azote liquide pour le glaçage au choc. La stabilisation du formaldéhyde et éthanol ultérieur fixation permet un échantillonnage en vrac sans la nécessité d’une préparation aliquote et s’est avéré pour être stable sur de longues périodes. Toutefois, les échantillons riches en protéines tels que la salive humaine15 peuvent être problématiques, flocs de protéine, denaturized par la formaldéhyde, pourraient provoquer un défavorable rapports signal sur bruit. Le séchage des échantillons aura le plus de temps (environ 1 h au total) des procédures dans cette comparaison, mais peut être effectué sur place sans produits chimiques toxiques. Il donne des granulés stables en tubes, qui peuvent être facilement expédiés sans prendre de précautions supplémentaires ou refroidissement risque. En outre, beaucoup de méthodes de fixation alternative ont été proposées11. Nous conseillons vivement de tester la stabilité de résolution et de la fixation de différents protocoles lors de l’introduction d’un nouvel ensemble de l’échantillon.
Nous avons utilisé deux cytomètres différent afin d’analyser les ensembles : i) une recherche hautement sophistiqué et coûteux, centrée trieuse et ii) un analyseur haut de la page application axée banc, qui semble plus approprié pour application sur5. La Colombie-Britannique a été mesurée avec l’analyseur de dessus de banc, tandis que le PC et l’ASC ont été mesurés avec le trieur de cellules. L’analyse de l’échantillon trois exemplaires définit des procédures différentes requis pour la reproductibilité optimisée, de stabilité de l’échantillon et de commodité de flux de travail. Le protocole suivant spécifie les sections pour les trois systèmes différents.

<table><tbody><tr><td>Système Milli-Q Synthèse A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Cartouche d’ultrafiltration</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules MoFlo Legacy</td><td>Beckman-Coulter, Brea, Californie (États-Unis)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (États-Unis)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&nbsp ;</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (États-Unis)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (États-Unis)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, Californie, États-Unis</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Tubes photomultiplicateurs R928 et R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td> <td>Summit 4.3Beckman-Coulter, Brea, Californie (États-Unis)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 & micro ; m&nbsp ; Sondes moléculaires FluoSpheres</td><td>, Eugene, Oregon (États-Unis)</td><td>F8815</td><td>350/440 bleu fluorescent</td></tr><tr><td>2 &mu ; m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-8827</td><td>505/515 perles fluorescentes jaune-vert&nbsp ;</td></tr><tr><td>0,5 &mu ; m Fluoresbrite BB Carboxylate microsphères</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &mu ; m Fluoresbrite BB Carboxylate microsphères</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 bleu fluorescent</td></tr><tr><td>1 &micro ; sondes moléculaires mYG FluoSpheres</td><td>, Eugene, Oregon (États-Unis)</td><td>F-13081</td><td>505/515 perles fluorescentes jaune-vert&nbsp ;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>N° CAS 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>N° CAS 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&nbsp ;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser UV Genesis CX,Coherent</td><td>, Inc , Santa Clara (États-Unis)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 series PMTs</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel FloMax</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&ouml ; rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tous les filtres optiques</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>N° CAS 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>Numéro de build : 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><<td>a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterisation microbiome dynamique – écoulement cytometry basé dans les workflows de cultures pures des communautés naturelles

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

L’enquête des cultures pures et le suivi de la dynamique des communautés microbiennes sont essentiels pour comprendre et maîtriser les écosystèmes naturels et les applications techniques grâce aux micro-organismes. Prochaine génération méthodes de séquençage sont largement utilisés pour résoudre les microbiomes, mais ils sont généralement des ressources et temps intensif et offrent pour la plupart des informations qualitatives. Microbiome cytométrie ne souffre pas de ces inconvénients et peut fournir l’abondance sous-communauté relative et absolue cellule numérote en-ligne. Bien qu’il ne livre pas directes informations phylogénétiques, il peut augmenter la profondeur de l’analyse et la résolution des approches de séquençage. Contrairement aux applications médicales dans la recherche et les paramètres courants, cytométrie en flux est encore peu utilisée microbiome analyse. Informations manquantes sur les pipelines analyse préparation et données échantillon peuvent créer une barrière à l’entrée pour les chercheurs face à des défis d’analyse microbiome qui seraient souvent des demandes de cytométrie en flux montant pour manuels. Ici, nous présentons trois flux de production complète pour des cultures pures, communautés complexes en clairement moyennes et complexes des communautés dans des matrices difficiles, respectivement. Nous décrivent les procédures d’échantillonnage et fixation individuelles et optimisé souillant des protocoles pour les ensembles d’échantillons respectifs. Nous élaborer l’analyse par cytométrie en flux, avec une recherche complexe centrée et un dispositif d’application de haut banc ciblée, décrire la cellule procédure de tri et proposons des ensembles d’analyse de données. En outre, nous proposons des contrôles expérimentaux importants et appliquer les flux de travail présentée à l’ensembles d’échantillons respectifs.

Les résultats représentatifs suivants mettent l’accent sur la nécessité de réplicats et illustrent les techniques de visualisation et d’analyse de données différentes sur chacune des trois séries d’échantillon. Ils présentent les résultats des données possible évaluation pipelines adapté pour répondre aux questions de recherche sur le jeu respectif. Cependant, les techniques présentées ne sont pas exclusifs à l’ensemble de l’échantillon qui elles sont présentent. Les données brutes de cytométrie de flux a été rendues publique avec l’ID FlowRepository FR-FCM-ZY46. Précédemment les données téléchargées de NCP sont disponibles sous l’ID FR-FCM-ZYD7.
Réplicats techniques et biologiques ont été prises, préparés et analysés selon les protocoles publiés11. Réplicats biologiques du PC et ASC proviennent de trois flacons parallèles. Réplicats biologiques de la Colombie-Britannique ont servi de trois prélèvements ultérieurs à un endroit dans une usine pilote. Trois aliquotes d’un échantillon ont été fixés, teintés et analysées afin d’assurer la reproductibilité technique. La reproductibilité des méthodes a été évaluée conformément aux procédures précédemment publiées11. Un modèle de portail pour tous les échantillons d’ensemble d’un seul échantillon (fichier complémentaire 1-S6) a été utilisé pour le calcul de l’écart (%) par la porte.
Pour le PC, l’écart maximal de l’abondance relative se 3,44 %, l’écart moyen est de 2,13 % (Figure 1). Pour l’ASC et la Colombie-Britannique, l’écart maximal de la norme de l’abondance relative ont été 1,27 % et 0,88 %, tandis que les moyennes des écarts étaient 2,13 % et 0,21 % (fichier complémentaire 1-S8).
Une procédure standard, lors d’enquêtes sur une culture pure souche, est la préparation d’une courbe de croissance d’analyser la phase de latence, temps de génération et la densité des cellules dans des conditions spécifiques. Nous avons combiné cette procédure avec le flux de travail analyse de cytométrie en flux pour atteindre une meilleure compréhension du système (Figure 2). Le FSC vs DAPI fluorescence parcelles révèlent les États de cycle cellulaire de la culture à différents moments de la culture de lot. Un modèle de portail principal (fichier complémentaire 1-S6) a été créé afin de quantifier la proportion de cellules avec un (c1n), deux (c2n) et plusieurs chromosomes (cXn, Figure 2 b). La proportion prédominante de cellules inoculées n'eu qu’un seul chromosome (93,7 % 0 h). Cela a changé radicalement au cours de la phase exponentielle de croissance où presque toutes les cellules contiennent plus d’un (99,6 %, 4 h) et plus de la moitié de la population (53,1 %) contenaient même plus de deux chromosomes. Cela illustre la capacité de s P. putidade reproduire ses chromosomes plus vite que son temps de génération.
Analyse en cytométrie en flux s’est avéré très utile pour suivre l’évolution des communautés microbiennes. Il peut suivre la dynamique des communautés beaucoup plus proche que la méthodes moléculaires intensive des ressources plus5,10. Nous avons mis en lumière ces dynamiques dans un film et a gagné un aperçu des changements de communauté boues activées au fil du temps. Chaque image une seconde montre une parcelle de fluorescence FSC vs DAPI d’un point de prélèvement (2 de fichier supplémentaire). Un déplacement très distinct entre 0 et jour 4 a été suivi de la mise en place d’une communauté de base après le 7e jour. Sous-communautés supplémentaires est venu au jour 21. Nous avons établi un modèle de portail principal (fichier complémentaire 1-S6) permettant l’évaluation des dynamiques microbiennes au niveau sous-communauté. Les sous-communautés dominantes dans les différentes étapes de l’expérience ont été clairement identifiées à l’aide de l’outil CyBar (Figure 3). Combinant avec la distribution des fréquences de l’abondance relative sous-communauté viable et a aidé à choisir les portes qui sont intéressant (changement significatif en abondance déclenchée à un moment clé) (abondance relative à plus de 5 %) pour le tri et plus analyse22.
Demandes de bioréacteur à échelle industrielle peuvent affronter des hétérogénéités spatiales potentielles en raison des limites de l’agitation. Ils sont également fréquemment exposés à l’évolution des paramètres opérationnels, comme les déviations dans la qualité des substrats non synthétique. La Colombie-Britannique représente un tel système et a été échantillonnée dans diverses localités dans un réacteur à flux dynamiquement par fiche. Parcelles de fluorescence de la FSC vs DAPI (Figure 4) de l’exemplaire points montrent l’hétérogénéité temporelle seulement peu spatiale, mais prononcée. La Colombie-Britannique a été étudiée plus loin en utilisant les deux, le CHIC rapide automatisée et le modèle de maître porte plus approfondi basée CyBar approche.
Sa nature automatisée, rapide et impartiale, rend le CHIC particulièrement intéressante pour le contrôle sur place des bioprocédés en milieu industriel. Il compare les données brutes .fcs de tous les échantillons disponibles. Deux de ces comparaisons sont affichés dans la Figure 5. Les valeurs résultantes de dissimilarité confirment les observations précédentes concernant l’hétérogénéité spatiale et temporelle. La forme de parcelles générées JNM la dissimilarités outils CHIC (Figure 6) plus justifie ce résultat et il visualise en conséquence.
En outre, nous avons calculé les abondances relatives des 23 sous-communautés de la Colombie-Britannique en utilisant un modèle de portail principal (fichier complémentaire 1-S6). Une analyse de corrélation de 48 échantillons prélevés dans une période d’un an a été réalisée pour comprendre les relations fonctionnelles dans la communauté microbienne. Ceci peut aider à identifier les portes de l’intérêt pour complément d’enquête (4 cellules tri). Fortes corrélations positives ou négatives avec des paramètres abiotiques comme produit des titres peuvent aider à comprendre et à optimiser des écosystèmes et des processus biotechnologiques. Le taux de charge organique inclus dans cette corrélation (Figure 7) illustre un tel paramètre abiotique. G5, G4 et G10 présentent de fortes corrélations positives et pouvaient contenir éventuellement espèces fermentatives, tandis que la corrélation négative au G8 pourrait soupçon vers methanogenic archaea.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> Figure 1 : reproductibilité de l’analyse par cytométrie en flux de la culture pure. Fluorescence FSC vs DAPI parcelles avec perles de contrôle (A, B) et un bar de parcelles de l’abondance de 3 sous-communauté [%] avec des barres d’erreur qui représente un écart ± (C, D). Les abondances relatives ont été déterminées avec le modèle de portail illustré fichier complémentaire 1-S6. Trois réplicats biologiques A, B et C ont été prises de la courbe de croissance à 4 h trois répétitions techniques P1, P2, P3 et ont été préparée à partir d’échantillon A mesuré trois fois, respectivement : M1, M2, M3 et sont donnés avec leurs écarts respectifs. 50 000 événements ont été enregistrés dans la porte de la cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> Figure 2 : analyse du cycle cellulaire de la culture pure préléves par une courbe de croissance expérimenter plus 12 h. (A). Fluorescence FSC vs DAPI parcelles des bi-horaire des échantillonnages qui montrent un changement de la teneur en ADN pendant la phase de croissance exponentielle. Cette série de mesures n’inclut pas les perles (voir fichier complémentaire 1-S3). (B). courbe de croissance axée sur la densité optique avec des barres d’erreur qui représente un écart de ± et abondances dans les sous-communautés au fil du temps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> Figure 3 : Evolution de la structure communautaire de boues activées pendant 24 jours. (A) le flowCyBar avec des distributions de fréquence visualisées en boîtes pour les portes individuelles qui sont conclues par la similitude des tendances qui vient se superposer, le correspondant de couleur touche (B) et une analyse de similarité dans un esprit d’intrigue JNM R &lt; 0,001 () C). les parcelles sous-jacentes sont présentées dans la séquence de film supplémentaire 2 fichier. Abondances relatives ont été déterminées en utilisant le modèle de porte dans le fichier complémentaire 1 - S6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> Figure 4 : hétérogénéité spatiale et temporelle de la structure de la communauté microbienne à l’échelle industrielle brancher réacteur biogaz. D’échantillonnage (A) la comparaison de la structure de la communauté microbienne des quatre ports I à IV jour 223. (B) la comparaison entre les variations de structure temps communautaire dépendant du jour 0 au jour 384 en port II. Le bruit a été coupé tardivement pour améliorer la visualisation. 250 000 événements ont été mesurées dans la porte de la cellule (fichier complémentaire 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> Figure 5 : comparaison par cytométrie en flux histogramme de l’Image — CHIC. Le principe de l’algorithme de CHIC est illustré en comparant deux échantillons représentant l’hétérogénéité spatiale et temporelle, respectivement. (i) CHIC images sont créés à partir des fichiers .fcs après avoir sélectionné deux paramètres pour afficher (fluorescence FSC vs DAPI). Le niveaux de gris (0-255) codes le nombre d’événements à un pixel. (ii) CHIC sous-ensembles sont générés après la spécification de la zone contenant des cellules (ici : 200 &lt; x &lt; 4000, 200 &lt; y &lt; 2200). (iii) XOR combinaison image est créée en comparant des pixels entre les sous-ensembles. Aucune différence est égale à 0 et s’affiche en noir. Écart maximal est égal à 200 et s’affiche en blanc. La valeur correspondante de XOR est calculée en additionnant les valeurs de l’échelle de gris de tous les pixels dans l’image XOR. (iv) superposition combinaison image est créé en ajoutant les valeurs de niveaux de gris des pixels des sous-ensembles. La valeur correspondante de la superposition est calculée à partir des pixels d’une image de superposition qui ne pas égal à zéro et donc contiennent des informations. (v) la dissimilitude valeurs sont calculées en divisant les valeurs XOR et superposition. Voici la base de l’intrigue de JNM dans la Figure 6. Aussi bien les valeurs de dissimilarité et le spectacle de terrain JNM une négligeable spatiale- et une hétérogénéité de la communauté temporelle prononcé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> Figure 6 : CHIC base analyse de la similitude des échantillons communauté biogaz. L’échantillon 0-day a été exclu de ce complot grâce à sa structure communautaire extrêmement différentes qui faussent l’analyse (fichier complémentaire 1-S11). L’intrigue de JNM confirme l’hypothèse au sujet peu spatiale- et supérieure hétérogénéité temporelle à l’aide de l’outil CHIC et expliquait à la Figure 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> Figure 7 : analyse de corrélation sur la communauté biogaz. La matrice a été calculée à l’aide du coefficient de rang de Spearman et repose sur l’abondance relative des 23 sous-communautés qui ont été déterminées avec le modèle de la porte principale dans fichier complémentaire 1-S6. Ils sont en corrélation avec le taux de charge organique (OLR) pour 48 échantillons prélevés dans une période d’un an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> Figure 8 : analyse de similarité des planctoniques (P) et des boues basé dans les eaux usées, les communautés de (S). Échantillons ont été prélevés sur le bassin de boues de clarificateur primaire (PCL), activé (AS) et le réservoir de digesteur (DT) d’une usine de traitement des eaux usées à grande échelle (parcelles de dot dans fichier complémentaire 1-S10). Abondances relatives ont été déterminées à l’aide du modèle portail indiqué dans le fichier complémentaire 1-S6. L’abondance de ces sous-communauté a également analysé avec l’outil flowCyBar pour créer un CyBar (fichier complémentaire 1-S10) et JNM intrigue (R &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> Figure 9 : stabilité de la Fixation de la culture pure. Échantillons provenant de l’expérience de courbe de croissance prise à 0 h ont été stockées pendant 28 jours à-80 ° C après fixation à 15 % de glycérol. Fluorescence FSC vs DAPI parcelles avec contrôle perles sont indiqués. Série de mesures n’inclut pas les perles (fichier complémentaire 1-S3). 50 000 événements ont été enregistrés dans la porte de la cellule (fichier complémentaire 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Analyse en cytométrie en flux s’est avérée précieuse pour enquêter sur des cultures pures et le contrôle dynamique des communautés microbiennes. Nous présentons trois flux de travail complet, de prélèvement d’échantillons pour l’analyse des données, des cultures pures et communautés complexes dans un milieu claire ainsi que dans des matrices difficiles, respectivement.

CARACTERISATION Microbiome dynamique – écoulement Cytometry basé dans les Workflows de Cultures pures des communautés naturelles

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en écologie microbienne et en biotechnologie, par exemple, quels concepts écologiques sont à l’origine d’un écosystème donné. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour fermer la dynamique rapide du microbiome suivante avec le régime d’échantillonnage à intervalles courts tout en restant très rentable. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir des informations sur les communautés microbiennes biotechnologiques et naturelles, ainsi que sur les microbiomes animaux et humains pour les états nutritionnels et de santé.Florian Schattenberg, technicien et opérateur du SediMeter dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour sécher un échantillon de biogaz communautaire, utilisez une pointe de pipette modifiée d’un millilitre pour transférer 200 microlitres de digestat visqueux dans un tube de deux millilitres contenant 1,7 millilitre de PBS. Après un mélange minutieux, placez les tubes dans un bain à ultrasons pendant une minute pour dissoudre tous les gros agrégats cellulaires et fixer les cellules collées aux résidus de cellules végétales.Après la sonication, mélangez soigneusement l’échantillon et filtrez les cellules à travers une crépine à mailles interstitielles de 50 micromètres dans un tube en plastique de 2 millilitres. Divisez le filtrat en quatre aliquotes de 400e microlitre et centrifugez les aliquotes deux fois, en éliminant complètement le surnageant les deux fois pour déshydrater mécaniquement l’échantillon de microbes aussi complètement que possible. Ensuite, séchez l’échantillon dans une centrifugeuse à vide chauffée pour créer une pastille stable et stockez-la à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière.Pour la stabilisation et la fixation d’échantillons de boues activées, centrifuger quatre millilitres de cellules et remettre en suspension la pastille dans quatre millilitres de formaldéhyde à deux pour cent dans du PBS. Après 30 minutes à température ambiante, centrifugez l’échantillon de cellule stabilisé et fixez la pastille dans quatre millilitres d’éthanol à 70 % pour un stockage à moins 20 degrés Celsius. Mélangez et transférez 0,6 millilitre de suspension à cellules fixes dans un tube de verre contenant 1,4 millilitre de PBS et, après un mélange minutieux, faites du sonicate pendant 10 minutes, comme il est démontré.À la fin de la sonication, récupérez les cellules par centrifugation, et remettez en suspension la pastille dans deux millilitres de PBS frais. Après un mélange minutieux, sonicez les cellules comme nous venons de le démontrer pendant cinq minutes et ajustez l’OD 700 nanomètres à 035 avec du PBS frais. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de perméabilisation contenant 0,11 molaire d’acide citrique et 4,1 millimolaire entre 20, avec un mélange minutieux, pour une incubation de 20 minutes à température ambiante.Ensuite, collectez les cellules par centrifugation et remettez complètement la pastille en suspension dans deux millilitres de solution de coloration contenant 0,68 DAPI micromolaire, pour une incubation d’au moins 60 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Pour l’étalonnage des billes, chargez le mélange de billes pour l’étalonnage linéaire dans le cytomètre en flux et mesurez les billes en continu tout en manipulant les positions de la buse et de l’optique laser pour pré-étalonner l’instrument dans la plage linéaire. Lorsque les pics de billes peuvent être intégrés dans un modèle d’étalonnage prédéfini, passez en mode journal et chargez un échantillon de billes d’étalonnage logarithmique.Ajustez les pics de billes logarithmiques à leur modèle d’étalonnage prédéfini pour affiner le matériel de l’instrument, et utilisez le réglage de gain du tube photomultiplicateur pour effectuer les ajustements finaux nécessaires à la position de la perle. L’aspect le plus critique de cette procédure est de maintenir des mesures cohérentes pour permettre la comparabilité entre les expériences. Par conséquent, l’étalonnage quotidien du cytomètre et l’utilisation de billes dans les paupières biologiques sont essentiels au succès de la dialyse lente du microbiome cytromique. Lorsque les cellules sont prêtes, mélangez et filtrez les échantillons et ajoutez le mélange de billes logarithmiques aux cellules.Maintenant, mélangez et chargez l’échantillon sur le cytomètre et créez une porte pour inclure les cellules colorées et exclure le bruit et les billes. Ensuite, analysez l’ensemble d’échantillons consécutivement à une vitesse maximale de 3 000 événements par seconde jusqu’à ce que 250 000 cellules soient détectées à l’intérieur de la porte de la cellule. Pour analyser les données de cytométrie en flux, développez un modèle de porte maître à utiliser sur tous les échantillons.Commencez par charger les fichiers standard de cytométrie en flux dans un programme d’analyse de cytométrie en flux approprié et traitez les échantillons successivement. Chargez les échantillons, double-cliquez sur une mesure et sélectionnez les paramètres des axes X et Y, dans leurs menus déroulants respectifs, pour ouvrir un graphique de fluorescence de diffusion directe en fonction de DAPI. Utilisez l’outil de dessin de polygone pour reproduire la porte de cellule de mesure générée précédemment afin d’exclure les perles et le bruit, et nommez la porte en conséquence.Faites glisser l’entrée de la porte de cellule dans la liste de groupe tous les échantillons, puis double-cliquez sur la porte de cellule pour afficher de manière sélective uniquement les événements de cellule. Définissez les sous-communautés prévalant dans un échantillon à l’aide de l’outil de porte elliptique et regroupez-les. Ajoutez ensuite des allocations de sous-communautés supplémentaires et des échantillons ultérieurs jusqu’à ce que le modèle de porte maître s’adapte à tous les échantillons.Contrôlez le modèle de la porte principale à l’aide de la méthode de balayage par diffusion latérale pour résoudre les sous-communautés qui se regroupent à proximité les unes des autres. Ensuite, ajoutez toutes les sous-communautés à l’éditeur de table et définissez la statistique de sortie sur la fréquence du parent. Utilisez l’éditeur de tableaux pour exporter les abondances relatives des sous-communautés dans un tableur approprié, et adaptez le formatage des données selon les directives du manuel de la barre latérale.Ensuite, pour visualiser la dynamique et les corrélations de la sous-communauté, installez et chargez le package R, puis chargez et normalisez le fichier txt. Les graphiques de fluorescence par diffusion directe par rapport à la fluorescence DAPI révèlent les états du cycle cellulaire des cultures de souches pures à différents points d’une culture par lots. L’utilisation d’un modèle de porte maître permet alors de quantifier la proportion de cellules ayant un, deux ou plusieurs chromosomes, révélant, par exemple, la capacité de ce microbe représentatif à répliquer ses chromosomes plus rapidement que son temps de génération.Lors de l’étude de communautés microbiennes complexes au fil du temps, le rythme et l’importance du changement de communauté peuvent être facilement visualisés à l’aide d’une séquence de diagrammes à points. Les sous-communautés dominantes aux différentes étapes de l’expérience peuvent être clairement identifiées à l’aide de l’outil de code-barres cytométrique. La combinaison de ces données avec la distribution fréquentielle des abondances relatives des sous-communautés permet de sélectionner des portes démontrant des changements d’abondance significatifs à des points clés dans le temps.La visualisation de ces données dans un graphique de mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique peut faciliter une compréhension plus approfondie de la dynamique de la communauté. Les communautés de biogaz peuvent potentiellement être confrontées à des hétérogénéités spatiales en raison des limites d’agitation. Les points d’échantillonnage de la communauté du biogaz présentent une faible hétérogénéité spatiale, mais une hétérogénéité temporelle prononcée.De fortes corrélations positives ou négatives avec des paramètres abiotiques, tels que les resserreurs de produits, peuvent aider à comprendre et à optimiser les écosystèmes et les processus biotechnologiques. De plus, ils facilitent l’identification des points de contrôle présentant un intérêt particulier pour le tri et l’analyse ultérieurs. Lors de l’établissement de cette procédure, il est conseillé d’évaluer différentes procédures de fixation et de coloration afin d’évaluer leurs performances et leur stabilité pour chaque nouvel ensemble d’échantillons.Après le tri, d’autres approches telles que la clôture ampliconsique, la métagénomique et la protéomique peuvent être appliquées pour sélectionner les meilleures communautés qui fournissent des informations sur l’affiliation protogénétique sur les états d’activité hors des voies métaboliques. Cette méthode a ouvert la voie aux écologistes microbiens et aux ingénieurs en bioprocédés pour suivre la dynamique du microbiome des écosystèmes naturels et contrôlés avec un investissement raisonnable en ressources.

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Biofilms microbiens sont généralement constitués par des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Analyse unicellulaire de ces sous-populations nécessite l'utilisation de reporters fluorescents. Nous décrivons ici un protocole de visualiser et de contrôler plusieurs...

Analyse unicellulaire des<emBacillus subtilis> Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Les populations microbiennes contiennent hétérogénéité cellulaire importante, qui peut dicter le comportement global. L'analyse de la sonde moléculaire par cytométrie en flux peut déterminer états physiologiques de cellules, mais son application varie selon les espèces. Cette étude fournit un protocole de déterminer avec précision la mortalité cellulaire dans une population de cyanobactérie, sans sous-estimer ou l'enregistrement des résultats faussement positifs.

Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Par cytométrie en flux

Cytométrie en combinaison avec les clusters visual vous propose une méthode rapide et facile à utiliser pour l’étude des biofilms aquatiques. Il peut être utilisé pour la caractérisation de biofilm, détection des changements dans la structure des communautés biofilm et détection des particules abiotiques incorporé dans le biofilm.

Caractérisation des Biofilms aquatiques avec écoulement Cytometry

Cet article illustre une méthode puissante pour quantifier les mitochondries ou lysosomes dans les cellules vivantes. La combinaison de colorants spécifiques lysosome ou mitochondries avec des anticorps fluorescent conjugués contre marqueurs de surface permet la quantification de ces organites chez les populations de cellules mixtes, comme les cellules primaires récoltées dans des échantillons de tissus, en utilisant cytométrie en flux multicolore.

Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

Les courbes révolutionnaires sont des outils efficaces pour étudier le transport des bactéries dans les médias poreux. Ici, nous introduisons des outils basés sur des dispositifs fluidiques en combinaison avec la microscopie et le comptage cytométrique de flux pour obtenir des BTCs.

Combiner des dispositifs fluides avec la microscopie et la cytométrie de débit pour étudier le transport microbien dans les médias poreux à travers les échelles spatiales

Nous décrivons ici une analyse simple de l’hétérogénéité du compartiment des cellules B immunitaires murines dans le péritoine, la rate et les tissus de la moelle osseuse par cytométrie en flux. Le protocole peut être adapté et étendu à d’autres tissus de souris.

Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

Ce protocole décrit une approche quantitative pour mesurer l’auto-agrégation microbienne à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie.

Cytométrie en flux d’imagerie pour étudier l’auto-agrégation microbienne

Ce protocole fournit une ligne directrice complète pour la mise en place et le suivi quantitatif des co-cultures, y compris les cyanobactéries photoautotrophes sécrétant du sucre et les levures hétérotrophes.

Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

Nous proposons une technique pour préserver intact le phloème des arbres et le préparer à l’observation.  Nous créons un appareil appelé sandwich de phloème qui permet l’introduction et l’observation d’arthropodes, de microbes et d’autres organismes qui habitent les tissus du phloème.

Technique pour l&#39;étude des arthropodes et communautés microbiennes dans les tissus des arbres

Les animaux sauvages sont couramment parasités par un large éventail d’helminthes. Les quatre principaux types d’helminthes sont les « vers ronds » (nématodes), les « vers à tête épineuse » (acanthocéphales), les « douves » (trématodes) et les « ténias » (cestodes). Nous décrivons ici comment les helminthes sont collectés sur un animal vertébré et comment ils sont conservés et identifiés taxonomiquement.

Collecte et identification d’helminthes de la faune

Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour analyser la dynamique des communautés microbiennes et des cultures pures. Ce protocole permet un suivi rapide et économique des microbiomes dans divers écosystèmes.

CARACTERISATION Microbiome dynamique – écoulement Cytometry basé dans les Workflows de Cultures pures des communautés naturelles (Vidéo) | JoVE Journal

CARACTERISATION Microbiome dynamique – écoulement Cytometry basé dans les Workflows de Cultures pures des communautés naturelles

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