préparation et

L'objectif général de cette procédure est de présenter une technique permettant d'assurer la modification cellulaire par microARN et, parallèlement, la magnétisation des cellules. Cette méthode peut répondre à des défis majeurs dans le domaine de la médecine régénérative, tels que l'ingénierie génétique des cellules avant leur transplantation.

En plus de permettre une modification cellulaire efficace avec des microARN, ils l'ont également permise avec de l'oxyde de fer. Cela peut être utilisé pour améliorer la rétention cellulaire au niveau du site d'intérêt par l'application d'un champ magnétique. La thérapie cellulaire est très prometteuse pour le traitement des maladies cardiaques, mais la faible rétention cellulaire et la survie cellulaire doivent être améliorées de toute urgence.

Commencez cette procédure avec une culture de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine en vue de la préparation des complexes de transfection, comme décrit dans le protocole écrit. 48 heures avant la transfection, ensemencez les HUVECs dans des plaques de culture cellulaire en plastique de taille appropriée. Utilisez une densité cellulaire initiale d'environ 13 000 cellules par centimètre carré de surface de croissance.

Ensuite, préparez des nanoparticules fraîches de microARN/polyéthylènimine/ oxyde de fer superparamagnétique. Diluez d'abord 2,5 picomoles de microARN par centimètre carré de surface de croissance cellulaire et une solution de glucose à cinq pour cent pour obtenir une concentration finale de 0,125 picomole de microARN par microlitre. Ensuite, diluez le PEI dans un volume égal de solution de glucose à cinq pour cent.

Ajouter le PEI dilué à la solution de microARN et vortexer le mélange obtenu pendant 30 secondes. Incuber ensuite le mélange miARN/PEI pendant 30 minutes à température ambiante. Soniquer les MNP pendant au moins 20 minutes dans un bain sonique à température ambiante.

Ensuite, ajoutez la quantité appropriée de solution de MNP au mélange prêt de miR/PEI. Après avoir vortexé pendant 30 secondes, incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite goutte à goutte le mélange préparé de miR/PEI/MNP directement dans le milieu de culture sur les cellules.

Remplacez ce mélange par du milieu de culture frais six heures après la transfection. Après l'analyse de la sécurité du vecteur décrite dans le protocole textuel, confirmez et caractérisez la localisation intracellulaire des complexes de transfection par microscopie confocale et par microscopie à illumination structurée en super-résolution. Pour ce faire, semez les HUVECs sur des lamelles en verre recouvertes de gélatine placées dans les puits de plaques de culture 24 puits, comme précédemment.

Transfectez les cellules avec le miR/PEI/MNP marqué avec trois colorants et incubez-les pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant cinq pour cent de dioxyde de carbone. Lavez d'abord les lamelles avec une solution contenant deux pour cent d'albumine sérique de bovin et du tampon phosphate salin, puis uniquement avec du tampon phosphate salin. Fixez les cellules en les incubant dans une solution à quatre pour cent de paraformaldéhyde ou PFA à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Laver avec du PBS, puis colorer les noyaux avec du DAPI en suivant les protocoles standard. Ensuite, laver les cellules avec du PBS trois fois pendant 15 minutes sur un agitateur afin d'éliminer l'excès de colorant. Placer les lamelles préparées sur des lames de microscope en utilisant un milieu de montage approprié et laisser les lames sécher pendant au moins une heure avant de les utiliser pour la microscopie.

Acquérir des images à l’aide d’un objectif à immersion huile de 63 fois dans les paramètres SIM indiqués dans le protocole écrit. Pour le ciblage cellulaire et les conditions dynamiques simulées in vitro, transfecter d’abord les HUVECs dans une plaque de 24 puits comme précédemment. Après une incubation de 24 heures, laver les cellules.

Ensuite, ajoutez un bain de trois minutes dans l'EDTA dilué dans du PBS et incubez les cellules pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius avant de les récupérer. Centrifugez les cellules recueillies à 300 × g pendant 10 minutes. Mélangez le culot cellulaire obtenu à partir d'un puits avec un millilitre de milieu de culture frais.

Et transférez les cellules dans un seul puits d'une plaque de 12 puits. Fixez un petit aimant localement à l'aide de ruban adhésif. Placez la plaque de culture sur l'agitate

Ensuite, lavez les cellules et fixez-les à l’aide de PFA à quatre pour cent. Coloriez les noyaux avec le DAPI. Enregistrez l’attachement cellulaire par microscopie confocale à balayage laser en mode z-stack, en utilisant des lasers d’excitation à 405 et 504 nanomètres, afin d’obtenir les données brutes.

Utiliser un traitement d'image par projection d'intensité maximale pour créer des images destinées à l'analyse. Pour l'analyse quantitative des cellules magnétiquement sensibles et non sensibles, transfecter d'abord les HUVECs dans une plaque de 24 puits. Incuber les cellules pendant 24 heures avant de les laver et de les récupérer comme décrit précédemment.

Resuspendre le culot cellulaire obtenu à partir de chaque puits avec 500 microlitres de tampon stérile de tri cellulaire réchauffé. Appliquer la suspension cellulaire sur une colonne de tri magnétique fixée par l'aimant fourni. Puis laver les colonnes sur l'aimant trois fois avec du tampon frais de tri cellulaire.

Recueillir l'écoulement comme la fraction non sensible au champ magnétique. Retirer les colonnes de l'aimant et recueillir immédiatement la fraction cellulaire sensible au champ magnétique en faisant passer un tampon frais de tri cellulaire à travers la colonne à l’aide d’un piston. Centrifuger les deux fractions, Mag– et Mag+, à 300 × g pendant 10 minutes.

Après avoir re-suspendu le culot cellulaire dans du PBS, comptez les cellules et évaluez la viabilité cellulaire à l’aide d’un test d’exclusion au bleu de trypan. Isolées à partir de cordons ombilicaux, les HUVECs se caractérisent par l’expression du marqueur endothélial CD31 et par la formation de tubes sur une matrice de membrane basale. Toutes les HUVECs transfectées avec le complexe miR/PEI/MNP internalisent le miR marqué.

Et leur survie reste inchangée 24 heures après la transfection. De plus, la microscopie de super-résolution montre une localisation paranucléaire de complexes de transfection marqués avec trois couleurs. La toxicité du PEI est confirmée par la fonctionnalité réduite des cellules transfectées avec miR/PEI.

Importamment, les MNP restaurent les propriétés cellulaires. Les cellules modifiées par les miR/PEI/MNP ne diffèrent pas des cellules non traitées en ce qui concerne la formation de tubes. De plus, ces cellules conservent la communication jonctionnelle intercellulaire, comme le révèle la récupération de fluorescence après photodécoloration.

Une fois qu'une suspension de cellules modifiées par miR/PEI/MNP est ensemencée dans les puits d'une plaque de culture placée sur un agitateur rotatif, les cellules ont tendance à migrer et à s'attacher dans la zone d'application locale d'un aimant. Des images représentatives illustrent la croissance cellulaire dans la zone soumise à l'aimant. En l'absence d'application d'aimant.

Et au centre du puits de culture, là où l'écoulement du liquide concentrait les cellules. Une fois maîtrisée, la transfection cellulaire peut être réalisée en deux heures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne idée de la manière de modifier de façon transitoire mais hautement efficace les cellules endothéliales, y compris leur magnétisation.

Ainsi que la manière de caractériser de façon définitive le produit cellulaire. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de respecter les quantités indiquées de cellules à semer, des composants pour la préparation des complexes de transfection, du temps d'incubation et de l'étape de lavage après la transfection. Nous sommes très optimistes quant à la bonne transposabilité de cette approche à d'autres types cellulaires pour le traitement d'autres organes affectés.

À la suite de cette procédure, des études in vivo avec des cellules magnétisées modifiées peuvent être réalisées. Celles-ci pourraient répondre à des questions supplémentaires sur l'efficacité du chargement en fer des cellules afin d'assurer leur rétention du côté d'intérêt, ainsi que sur la définition des limites de détection par IRM in vivo.