préparation et In vitro Caractérisation des aimanté miR-modifié cellules endothéliales

Ce manuscrit décrit l'efficacité, la livraison non virale de miR aux cellules endothéliales par un vecteur PEI / MNP et leur aimantation. Ainsi, en plus de la modification génétique, cette approche permet d'orientation magnétique des cellules et l'IRM détectabilité. La technique peut être utilisée pour améliorer les caractéristiques des produits thérapeutiques cellulaires.

L’objectif global de cette procédure est d’introduire une technique qui assure la modification cellulaire avec des microARN et en parallèle l’aimantation cellulaire. Cette méthode peut relever des défis clés dans le domaine de la médecine régénérative. Comme le génie génétique des cellules avant la transplantation.

En plus d’une modification cellulaire efficace avec des microARN, ils l’ont permise avec de l’oxyde de fer. Cela peut être utilisé pour améliorer la rétention des cellules du côté d’intérêt par l’application d’un champ magnétique. La thérapie cellulaire est très prometteuse pour le traitement des maladies cardiaques, la rétention hypocellulaire et la survie cellulaire doivent être améliorées de toute urgence.

Commencer cette procédure par une culture de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine en préparation de complexes de transfection comme décrit dans le protocole de texte. 48 heures avant la transfection, ensemencer les HUVECs sur des plaques de puits de culture cellulaire en plastique de taille appropriée. Avec une densité cellulaire de départ d’environ 13 000 cellules par centimètre carré de surface de croissance.

Ensuite, préparez des nanoparticules fraîches de miR/polyéthylèneimène/super oxyde de fer paramagnétique. Diluez d’abord 2,5 picomoles de microARN par centimètre carré de surface de croissance cellulaire et une solution de glucose à cinq pour cent pour obtenir une concentration finale de 0,125 picomoles de microARN par microlitre. Ensuite, diluez le PEI dans un volume égal de solution de glucose à cinq pour cent.

Ajouter le PEI dilué à la solution de microARN et agiter le mélange obtenu pendant 30 secondes. Ensuite, incubez le mélange miR/PEI pendant 30 minutes à température ambiante. Soniquez les MNP pendant au moins 20 minutes dans le bain d’eau soniquant à température ambiante.

Ajoutez ensuite la quantité appropriée de solution de MNP au mélange miR/PEI prêt. Après avoir tourbillonné pendant 30 secondes, incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez le mélange miR/PEI/MNP préparé goutte à goutte directement dans le milieu de culture sur les cellules.

Remplacez ce mélange par un milieu de culture frais six heures après la transfection. Après l’analyse de l’innocuité des vecteurs telle que décrite dans le protocole de texte, confirmer et caractériser la localisation intracellulaire des complexes de transfection par microscopie confocale et à illumination structurée à super-résolution. Pour ce faire, ensemencez les HUVECs sur des lamelles de verre recouvertes de gélatine placées dans les puits des plaques de culture à 24 puits comme précédemment.

Transfectez les cellules avec des miR/PEI/MNP marqués en 3 couleurs et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant cinq pour cent de dioxyde de carbone. Lavez d’abord les lamelles avec une solution saline tamponnée à deux pour cent d’albumine sérique bovine et de phosphate, puis avec du PBS uniquement. Fixez les cellules en les incubant dans quatre pour cent de paraformaldéhyde ou de PFA à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Laver avec du PBS puis colorer les noyaux avec du DAPI en suivant les protocoles standard. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS trois fois 15 minutes sur le shaker pour éliminer l’excès de colorant. Placez les lamelles préparées sur les lames de microscope à l’aide d’un support de montage approprié et laissez sécher les lames pendant au moins une heure avant de les utiliser pour la microscopie.

Acquérez des images à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 63 fois dans les paramètres SIM trouvés dans le protocole texte. Pour le ciblage cellulaire et les conditions dynamiques simulées in vitro, transfectez d’abord les HUVEC dans une plaque à 24 puits comme précédemment. Après les avoir incubées pendant 24 heures, lavez les cellules.

Ajoutez ensuite un x trips dans de l’EDTA dilué dans du PBS et incubez les cellules pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius avant de collecter les cellules. Centrifugez les cellules collectées à 300 fois G pendant 10 minutes. Mélangez la pastille cellulaire obtenue à partir d’un puits avec un millilitre de milieu de culture frais.

Et transférez les cellules dans un seul puits d’une plaque à 12 puits. Fixez un petit aimant localement à l’aide de ruban adhésif. Placez la plaque de culture sur l’agitateur et incubez la suspension cellulaire pendant 12 heures à 150 tr/min pour simuler des conditions dynamiques.

Ensuite, lavez les cellules et fixez-les avec quatre pour cent de PFA. Colorer les noyaux avec du DAPI. Enregistrez l’attachement de la cellule à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser avec des lasers d’excitation d’un adolescent nanomètre de 405 et 504 en mode z-stack pour obtenir les données brutes.

Utilisez le traitement d’image de projection à intensité maximale pour créer des images à analyser. Pour l’analyse quantitative des cellules magnétiquement réactives et non réactives, transfectez d’abord les HUVECs dans une plaque à 24 puits. Incuber les cellules pendant 24 heures avant de les laver et de les prélever comme décrit précédemment.

Remettre en suspension la pastille cellulaire obtenue dans chaque puits avec 500 microlitres de tampon de tri cellulaire stérile chauffé. Appliquez la suspension de la cellule sur une colonne de tri magnétique fixée par l’aimant fourni. Ensuite, lavez trois fois les colonnes sur l’aimant avec un tampon de tri cellulaire frais.

Collectez le flux continu sous forme de fraction magnétiquement non réactive. Retirez les colonnes de l’aimant et collectez immédiatement la fraction cellulaire réactive magnétiquement en poussant un nouveau tampon de tri cellulaire à travers la colonne à l’aide d’un piston. Centrifugez les fractions Mag-et Mag++, à 300 fois G, pendant 10 minutes.

Après avoir remis en suspension la pastille cellulaire dans du PBS, comptez les cellules et évaluez la viabilité cellulaire à l’aide d’un test d’exclusion au bleu trypan. Isolés à partir de cordons ombilicaux, les HUVECs sont caractérisés par l’expression du marqueur endothélial CD31 et par la formation de tubes sur une matrice de membrane basale. Les HUVECs transfectés avec miR/PEI/MNP prennent tous étiqueté miR.

Et leur survie reste intacte 24 heures après la transfection. De plus, la microscopie à super-résolution montre la localisation paranucléaire de complexes de transfection marqués en 3 couleurs. La toxicité de l’IPE est confirmée par la diminution de la fonctionnalité des cellules transfectées miR/PEI.

Il est important de noter que les cellules modifiées par miR/PEI/MNP ne diffèrent pas des cellules non traitées en termes de formation de tubes. De plus, ces cellules maintiennent la communication jonctionnelle intercellulaire comme le révèle la récupération de fluorescence après photo-blanchiment.

Une fois qu’une suspension de cellules modifiées par miR/PEI/MNP est ensemencée dans les puits d’une plaque de culture placée sur l’agitateur rotatif, les cellules ont tendance à migrer et à se fixer dans la zone d’application de l’aimant local. Des images représentatives représentent la croissance cellulaire dans la zone avec l’application d’un aimant. Sans application d’aimant.

Et au centre du puits de culture où l’écoulement du liquide concentrait les cellules. Une fois maîtrisée, la transfection cellulaire peut être réalisée en deux heures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne impression sur la façon de modifier transitoirement mais très efficacement les cellules endothéliales, y compris la magnétisation.

Et aussi comment caractériser terminalement le produit cellulaire. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de suivre les chiffres donnés pour l’ensemencement cellulaire, les quantités de composants pour la préparation des complexes de transfection, le temps d’incubation et l’étape de lavage après la transfection. Nous sommes très optimistes quant au fait que cette approche sera bien transférable à d’autres types de cellules pour le traitement d’autres organes touchés.

Suite à cette procédure, des études in vivo avec des cellules magnétisées modifiées peuvent être réalisées. Ils pourraient répondre à d’autres questions sur l’efficacité de la charge en fer des cellules pour assurer leur rétention dans le côté d’intérêt. Et aussi de définir les limites de détection avec l’IRM in vivo.