Name: High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Découvrez un test haut débit en temps réel pour identifier des antimicrobiens pénétrant dans les cellules eucaryotes et ciblant les pathogènes bactériens intracellulaires, tout en évaluant la cytotoxicité cellulaire simultanément.

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La recherche rapportée dans ce manuscrit a été soutenu par l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses des Instituts nationaux de la santé sous le numéro d&#39;attribution R01AI099122 à JEK Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Santé. Nous tenons à remercier Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu, et Rachel Warden de la Facilité de dépistage BICE-Longwood et / ou le Laboratoire national de dépistage pour les nouveaux centres régionaux d&#39;excellence en Angleterre biodéfense et les maladies infectieuses émergentes (pris en charge par U54AI057159) pour leur aide dans le développement et la performance des essais de criblage à haut débit. Nous tenons également à remercier Kenneth P. Smith pour leurs commentaires utiles sur le manuscrit.

1. Temps réel intracellulaires croissance et cellules eucaryotes Essai de cytotoxicité <ol><li> Préparation de cellules hôtes (Cellules J774A.1) <ol><li> Les cellules de type macrophage Culture J774A.1 Mus en suspension dans RPMI 1640 avec 9% de sérum de veau fer complété. Un premier passage dans des flacons de culture tissulaire. Après que les cellules sont devenues confluentes dans 75 cm 2 flacon de culture tissulaire dans 15 ml de milieu, divisé par grattage et de dilution à 65 ml avec le même type de support, dont 15 ml retourne dans le flacon de culture tissulaire et 50 ml est transféré à un 250 ml bactérienne flacon shaker. </li><li> Pour la mise à l&#39;échelle, la culture en suspension dans 250 ml et / ou 1000 flacons bactériens ml remplie à un cinquième du volume avec un milieu de culture tissulaire. Aérer en réglant la vitesse de rotation à environ 120 tours par minute. Pour une croissance constante, incuber à% exactement 5 CO 2 et 37 ° C. </li><li> Récolte des cellules quand ils atteignent une densité dans la gamme de 2,5 x 10 6 cellules/ ml à 5 x 10 6 cellules / ml. Assurer le pourcentage de cellules mortes (le plus facilement dosée par coloration au bleu trypan) ne dépasse pas 25%, comme les cellules mortes vont augmenter le bruit de fond dans les tests de cytotoxicité. </li><li> Plaque en blanc, culture de tissus traitée, 384 puits des microplaques à 5 x 10 4 cellules J774A.1 dans 30 ul de milieu de culture tissulaire par puits. Incuber microplaques pendant une nuit pour atteindre 90% de confluence le jour de l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Préparation luminescent ou fluorescent Legionella pneumophila <ol><li> Passage L. pneumophila (LP02 :: flaA :: lux 8) bactéries sur un milieu approprié, à savoir, tamponnée extrait du charbon de levure (BCYE) moyenne. Si vous utilisez une souche auxotrophe de thymidine, compléter le milieu avec 100 pg / ml de thymidine. Préparer des taches de bactéries pour des expériences par des organismes d&#39;étalement en couche épaisse sur une nouvelle plaque de BCYE et l&#39;incubation d&#39;une journée (si d&#39;un passage de la plaque précédente) ou deux à trois jours (si du stock congelé) pour obtenir confluentescroissance. <ol><li> Préparer des plaques de BCYE en dissolvant 10 g d&#39; extrait de levure, 10 g de N - (2-acétamido) -2-aminoéthanesulfonique, 0,35 g de K 2 HPO 4 et 1 g de potassium monobasique α-cétoglutarate dans 950 ml d&#39; eau déminéralisée. Ajuster le pH à 6,9 avec de l&#39;hydroxyde de potassium (≥ 2,5 ml d&#39;une solution de 11,9 molaires). </li><li> Ajouter 15 g d&#39;agar et 2 g de charbon activé; et porter à 1 L volume final. Ajouter une barre d&#39;agitation magnétique et autoclave. milieu frais à 55 ° C et ajouter des solutions stérilisées par filtration contenant 0,4 g de L-cystéine et 0,42 g d&#39;ammonium fer (III), le citrate dissous dans de l&#39;eau déminéralisée. Utilisez l&#39;aimant plaque d&#39;agitation pour mélanger avant de verser des boîtes de Pétri. </li><li> Pour les essais de L. pneumophila dans la croissance du milieu de croissance axénique, préparer un bouillon d&#39;extrait ACES-levure (AYE) en combinant tous les réactifs chimiques utilisés pour BCYE sauf pour le charbon de bois et d&#39; agar. Filtre stériliser et utiliser immédiatement ou congeler pour des expériences ultérieures. </li></ol></li><li> Remettre en suspension dans les organismes SAMe milieu de culture de tissu utilisé pour les cellules J774A.1 avec 100 pg / ml de thymidine complémentation selon le cas. </li></ol></li><li> infection Macrophage <ol><li> Ajouter des composés d&#39;essai d&#39;intérêt (criblage de composés, ainsi que des contrôles positifs et négatifs pour l&#39;inhibition de la croissance bactérienne et la lyse des cellules eucaryotes). De préférence, on dissout les solutions mères à ≥500x dans du DMSO (diméthylsulfoxyde) ou une solution aqueuse pour permettre une dilution suffisante du véhicule. <ol><li> Bien que les solutions d&#39;achat d&#39;actions peuvent être conservés congelés, éviter les cycles de gel-dégel pour les composés labiles et antimicrobien. </li></ol></li><li> Diluer les bactéries luminescentes à une cible de 2,5 x 10 6 UFC (unité formant colonie) / m et des bactéries marqué par un rapporteur fluorescent à 1,0 x 10 7 UFC / ml dans un milieu de culture tissulaire et ajouter non toxique, membrane imperméant aux acides nucléiques appropriés un colorant de liaison à 2,5x concentration analytique finale. </li><li> Ajouter 20 pi de mélange pour chaque culture J774A.1 bien, le volume d&#39;essai final50 ul, la concentration bactérienne finale 1 x 10 6 UFC / ml (lux opéron reporter) ou 4 x 10 10 6 UFC / ml (fluorescent reporter de la protéine). </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 1-3 jours dans 5% de CO2 à 100% d&#39; humidité relative pour éviter les effets de bord par évaporation. </li></ol></li><li> Assay Readout <ol><li> Lire la croissance bactérienne et la toxicité des cellules eucaryotes sur un luminomètre de microplaques et fluorimètre selon le cas pour les journalistes utilisé. <ol><li> Pour éviter les effets de bord associé à la température, thermiquement équilibrer microplaques avant luminescence lecture par le placement dans une seule couche sur un banc de laboratoire avec des couvercles entrebâillée pendant environ 20 min (ou dans une enceinte de sécurité biologique avec des couvercles off pendant environ 10 min). </li></ol></li><li> Retour microplaques à incubateur si la lecture en temps réel à des points de temps plus tard, est souhaitée. </li></ol></li></ol> Analyse 2. Données <ol><li> Normaliser les données à con positive et négativecommandes pour calculer pour cent ou pliez-inhibition de la croissance bactérienne intracellulaire et la cytotoxicité pour cent pour les cellules eucaryotes. </li><li> Pour évaluer dosage robustesse, calculer la séparation statistique entre les contrôles positifs et négatifs à la fois pour l&#39; inhibition de la croissance bactérienne et la cytotoxicité à l&#39; aide du facteur Z (Z &#39;) l&#39; analyse dans laquelle Z&#39; = 1 - 3 (σ p + σ n) / | u p + u n |. Dans cette équation, σ σ p et n sont les écarts - types pour les puits témoins positifs et négatifs, respectivement; μ p et u n sont les valeurs moyennes des puits témoins positifs et négatifs, respectivement. <ol><li> Pour les essais de criblage à haut débit, calculer z-scores standard (ou autre alternative, des mesures statistiques quantitatives) pour évaluer les effets des composés d&#39;essai d&#39;intérêt. Vous pouvez également calculer un pli-simple réduction ou log-fold réduction comme potentiellement physiologiquement plus pertinent<html> mesure de l&#39;effet grandeur pour les bactéries répliquant géométriquement. </li></ol></li></ol> 3. Simple et multi-dimensionnelle (c. -à- Synergy) dose-réponse Test et données Interprétation <ol><li> Préparer les macrophages et les bactéries comme décrit dans la section 1 du protocole. </li><li> Juste avant l&#39;infection ou l&#39; incubation axénique, ajouter des antimicrobiens d&#39;intérêt expérimental dans une série, doublant la série de dilution, dans le but de spanning sur le haut de gamme une concentration qui élimine complètement la croissance (ie, la concentration ou MIC minimale inhibitrice) et sur le bas mettre fin à une concentration qui ne montre aucune activité évidente. </li><li> Utilisez un système de manipulation de liquide automatisé pour faciliter seule dose-réponse et la configuration de test de synergie combinatoire à travers, plus direct automatisé de dilutions antimicrobiennes selon le protocole du fabricant. </li><li> Envisager l&#39;utilisation de dilutions sous-doublement, par exemple,841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - pliez série de dilution, et le dosage réplique pour augmenter la précision et la reproductibilité des données. </li><li> Pour l&#39; infection des macrophages, diluer les bactéries luminescentes pour cibler de 2,5 x 10 6 CFU (colonie unité formant) / ml dans un milieu de culture de tissus. Ajouter 20 pi de mélange à chaque culture de J774A.1 bien, volume final d&#39;essai de 50 pi, la concentration bactérienne finale 1 x 10 6 UFC / ml; et incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 à 100% d&#39; humidité relative. <ol><li> Pour les essais de croissance axénique, on dilue les bactéries luminescentes à une concentration finale de 1 x 10 6 UFC / ml dans un milieu AYE, ajouter 50 ul à chaque puits d&#39;une plaque à 384 puits et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 à 100% d&#39;humidité relative. </li></ol></li><li> Calculer l&#39;indice de concentration d&#39;inhibiteur fractionnaire pour des combinaisons antimicrobiennes qui inhibent la croissance des bactéries. Pour chaque médicament dans la combinaison (a, b,.. N), qui se traduit par une inhibition totale ou&gt; 99% des bactéries groissance, calculer la concentration inhibitrice fractionnelle individuelle (FIC a, b, n...) de la manière suivante: FIC A = la concentration du composé &quot;a&quot; divisée par la concentration inhibitrice minimale de &quot;a&quot; par lui - même. . En utilisant la même formule, calculer FIC b, etc. Ensuite , calculer l&#39;indice FIC combinatoire ou <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FIC = FIC a + b + FIC. . .FIC N pour chaque combinaison inhibitrice. <ol><li> Utilisez l&#39;index combinatoire qui dévie le plus éloigné de 1,0 pour évaluer la synergie. Considérons une coupure de ≤0.5 comme une indication prudente d&#39;un effet synergique et ≥4, un effet antagoniste. 12 </li><li> Terrain isobologrammes, isocontour isobologrammes, et / ou isosurface isobologrammes 6 représentations graphiques comme alternatives d&#39;effets combinatoires. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons des tests en temps réel pour la détection simultanée de la croissance bactérienne intracellulaire et la cytotoxicité des cellules hôtes. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. D&#39;abord, pour les performances du test robuste, il doit y avoir une séparation spectrale suffisante entre les lectures bactériennes et cytotoxicité. Une telle séparation est intrinsèque des combinaisons de reporters opéron luciférase et des colorants de liaison à l&#39;ADN fluorescents. Cependant, sur la base de no...

Pathogens qui poussent ou résident temporairement dans des compartiments intracellulaires sont difficiles à éradiquer thérapeutique. OBLIGER ou relativement obliger les agents pathogènes intracellulaires tels que Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, et Mycobacterium spp. nécessitent souvent des cours de thérapie antimicrobienne prolongée pour la guérison qui peut aller de quelques mois à voire des années. En outre, les agents pathogènes extracellulaires peuvent transitoirement occuper des niches intracellulaires et de cette façon échapper à un dégagement de cours normales de traitement antimicrobien et de sortir plus tard pour commencer de nouveaux cycles d&#39;infection virulente. Staphylococcus aureus 1 et uropathogènes entérobactéries 2,3 infections sont deux exemples de plus en plus reconnus. Par conséquent, un objectif fondamental de découverte de médicament consiste à identifier de nouveaux agents antimicrobiens qui pénètrent dans les compartiments intracellulaires. Le traitement optimal pour éradiquer rapidementorganismes intracellulaires et de prévenir le développement de la résistance aux antimicrobiens par l&#39;exposition sous-inhibitrice est particulièrement souhaitable. À cette fin, nous avons développé une technologie de criblage à haut débit pour identifier les antimicrobiens intracellulaires-ressuage ciblant la croissance intracellulaire de l&#39;agent pathogène du modèle, Legionella pneumophila. 4 observations cliniques antérieures indiquent que les tests de sensibilité aux antimicrobiens norme n&#39;a pas prédire avec précision in vivo l&#39; efficacité thérapeutique contre cet organisme. 5 Plus précisément, ce fut parce que les principales catégories d&#39;antimicrobiens tels que les ß-lactamines et aminosides, bien que très efficace contre axéniquement cultivé Legionella, ne pénètrent pas suffisamment dans les compartiments intracellulaires où Legionella réside. 5,6 preuves plus tard suggéré que les essais de croissance intracellulaire techniquement plus complexes de manière efficace prédit l&#39; efficacité clinique. 7 </sup&gt; Malheureusement, ces essais ont été extrêmement laborieux points d&#39;extrémité des essais, ce qui nécessite des macrophages infectés, traités avec des antimicrobiens, être lysées à différents moments de points pour former des colonies unité dénombrement. De tels essais ne sont pas pratiques à faire sur une grande échelle et ne conviennent pas à haut débit de découverte de médicaments. Par conséquent, nous avons développé la technologie pour la détermination en temps réel de la croissance bactérienne intracellulaire. 6 Cela a été réalisé par l&#39; utilisation d&#39;une souche bactérienne modifiée par l&#39; intégration soit une luciférase bactérienne opéron 8 (dosage de première génération a été décrite précédemment) , 4 ou protéine fluorescente 9 reporters (deuxième génération, le dosage orthogonaux, décrit ici) dans le chromosome bactérien. De cette façon, luminescent ou signal fluorescent fournit un substitut, la lecture en temps réel du nombre de bactéries. Cependant, ces attributs ne traitent pas un facteur de confusion majeure dans infectio intracellulairen essais, les effets hors-cible sur les cellules hôtes. En particulier, la mort de la cellule hôte limite intrinsèquement la croissance intracellulaire et conduit à l&#39;identification de faux positifs de l&#39;effet antimicrobien. Comme de nombreux composés dans les bibliothèques de criblage sont cellules eucaryotes toxiques, ces faux positifs submergent vrais antimicrobiens, ce qui nécessite un grand nombre de suivi, des tests de cytotoxicité point final pour la résolution. Ainsi, il était d&#39;un grand intérêt pour être en mesure d&#39;évaluer la viabilité des cellules eucaryotes et la croissance intracellulaire simultanément. En particulier, une caractéristique des cellules eucaryotes non viables est la perte d&#39;intégrité de la membrane cellulaire. Les sondes qui testent la perméabilité de la membrane cellulaire peuvent donc être utilisés pour évaluer la viabilité cellulaire. Nous avons précédemment caractérisé l&#39;aptitude d&#39;une série de cellules putativement membrane, imperméants, des colorants de liaison à l&#39;ADN fluorescent d&#39;accès et de souiller l&#39;ADN nucléaire des cellules mortes. 4 sur la liaison de l&#39; ADN nucléaire, ces colorants présentent une forte augmentation Quantum rendement de fluorescence entraînant une augmentation de signal sur la fluorescence de la solution de fond. Par conséquent, ces colorants ont fourni une lecture quantitative de la mort cellulaire eucaryote. 4 Notamment, nous avons constaté que plusieurs étaient non toxiques eux - mêmes pendant la co-incubation prolongée avec les macrophages J774. Lorsqu&#39;il est ajouté au cours de l&#39;infection initiale, ils ont fourni en temps réel, la lecture de fluorescence de la mort cellulaire eucaryote qui peut être mesurée par un fluorimètre à microplaques ou observée au microscope. Par conséquent, en combinant l&#39;utilisation d&#39;un journaliste bactérienne et non toxique, membrane-impermeant, colorants de liaison d&#39;ADN, nous avons pu mettre au point un non-destructif, simple essai, en temps réel pour mesurer à la fois la charge bactérienne et eucaryote cytotoxicité cellulaire simultanément. Ce test nous a permis d&#39;écran dans 384 puits format de plaque ~ 10.000 bioactifs connus, y compris ~ 250 antimicrobiens et&gt; 240.000 petites molécules ayant une activité fonctionnellement non caractérisée par la capacité à inhiber la croissance intracellulaire deLegionella pneumophila, tandis que dans le même temps , la génération de données de cytotoxicité des cellules eucaryotes pour chaque composé. 6 Notre analyse des antimicrobiens connus contre la croissance intracellulaire de Legionella était l&#39;exploration la plus complète de ce type à ce jour. 6 Sur la base de l&#39;efficacité de notre format d&#39;essai, nous avons également exploré ensuite les effets synergiques potentiels des antimicrobiens connus lorsqu&#39;ils sont utilisés en combinaison. L&#39;un des essais de synergie les plus courants, le dosage que l&#39;on appelle damiers, est réalisée en évaluant la manière standard les effets combinatoires des dilutions en série de deux en deux de deux ou plusieurs agents antimicrobiens. 10 Dans ces essais, la synergie est définie par l&#39;observation d&#39; un effet plus important lorsque deux ou plusieurs agents antimicrobiens sont appliqués en même temps que la somme des effets de chacun appliqués séparément. Il convient de noter, jusqu&#39;à présent, uniquement axé et les tests de synergie sélective a été réalisée contre intracellulaire Legionella pneumophila </em&gt; à cause du grand effort impliqué dans les essais finaux traditionnels multiplié par les permutations combinatoires nécessaires. Pour faciliter les tests de synergie, nous avons fait usage de notre temps réel la croissance intracellulaire / test de cytotoxicité eucaryote en combinaison avec la technologie de distribution numérique automatisé 6. Cette automatisation nous a permis de distribuer des dilutions en série des composés dissous dans du DMSO ou de la solution aqueuse seuls ou en combinaison dans un format à 384 puits. 11 En outre, cette technologie de traitement des liquides robuste nous a permis d&#39;effectuer facilement une résolution plus élevée, la racine carrée de deux enfants (plutôt que la norme, une résolution inférieure, doublant) combinaisons de dilution pour atteindre des niveaux plus élevés de spécificité dans nos deux dimensions, checkerboard synergie une analyse. Cette résolution a été particulièrement précieuse pour répondre aux préoccupations en matière de synergie sur les reproductibilité lors de l&#39; utilisation double série de dilutions 12. Enfin, notre analyse était quantitative et aussi thervant gradations d&#39;inhibition mesurée. En conséquence, l&#39;essai a capturé la totalité de l&#39;information d&#39;inhibition, exprimables dans isocontour isobologrammes dans lequel isocontours relier les concentrations combinatoires avec des niveaux similaires d&#39;inhibition de la croissance. 6 Cette stratégie a permis la visualisation de tracé des courbes dose-réponse combinatoires. Pour illustrer notre méthodologie, nous décrivons notre protocole pour effectuer ces tests et montrer des résultats représentatifs.

<table><tbody><tr><td>J774A.1 cellules</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-67</td><td>Cellule hôte</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp ;</td><td>Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure de charbon de bois tamponnée et d’un milieu d’extrait de levure tamponné</td></tr><tr><td>Extrait de levure, ultrafiltré</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure au charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné ; les grades inférieurs peuvent entraîner une altération de la croissance et/ou altérer la sensibilité de Legionella aux inhibiteurs de croissance</td></tr><tr><td>Acide alpha-cétoglutarique, sel monopotassique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure au charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure au charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium, dibasique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure de charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné</td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure au charbon de bois tamponné et d’un milieu</td></tr> <tr><td>d’extrait de levure tamponnéCitrate de fer d’ammonium(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure de charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné ; le pyrophosphate ferrique peut être utilisé à la place, mais il est plus difficile à peser avec précision</td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de potassium, concentrée</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>Pour la fabrication d’une gélose d’extrait de levure de charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné</td></tr><tr><td>Eau déonisée</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure de charbon de bois tamponnée et d’un milieu d’extrait de levure tamponné</td></tr><tr><td>Thymidine (qualité culture tissulaire)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Pour compléter à la fois le RPMI 1640 et l’extrait de levure tamponné agar/medium &mdash ; la thymidine de grade inférieur peut être utilisée pour ce dernier, mais peut entraîner une altération de la croissance cellulaire et/ou la mort cellulaire dans le RPMI 1640</td></tr><tr><td>RPMI 1640, formulation standard</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>Pour la croissance des cellules J774A.1 avant le placage ; comprend 2 mM de L-glutamine</td></tr><tr><td>RPMI 1640 sans rouge de phénol</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>Pour le placage des cellules J774A.1 dans des boîtes à 384 puits (ne convient pas à la croissance avant le placage) ; manque également de L-glutamine &mdash ; supplément à 2 mM avant utilisation</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM dans 0,85 % de NaCl (qualité culture tissulaire)</td><td>HyClone via Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>Pour compléter le RPMI 1640 manquant de L-glutamine, à une concentration finale de 2 mM</td></tr><tr><td>Sérum de veau supplémenté en fer</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>Pour compléter le RPMI 1640, à une concentration finale de 9,1 %</td></tr><tr><td>Solution de Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Pour la coloration pour J774A.1 Détermination de la mort cellulaire lors du comptage de la densité cellulaire</td></tr><tr><td>SYTOX Green, solution de 5 mM dans du DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Pour la coloration pour J774A.1, la détermination de la mort cellulaire par lecture de fluorescence ou microscopie d’épifluorescence (en conjonction avec des bactéries fluorescentes rouge orangé ou rouge lointain). Utilisation à une concentration finale de 125 nM.</td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>Pour l’incubation des cellules J774A.1 (avant et après l’infection) ; peut également être utilisé pour l’incubation de bactéries, ou un incubateur à atmosphère standard peut être utilisé à la place)</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>Pour l’incubation agitée des cellules J774A.1 avant l’infection ; s’insère dans l’incubateur de culture cellulaire ; comprend une base d’agitateur 7744-01000 et un plateau 7740-01010 (ils sont également disponibles séparément)</td></tr><tr><td>Flacons agitateurs (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>Pour l’incubation agitée des cellules J774A.1 avant l’infection</td></tr><tr><td>Pinces vibrantes pour flacons (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>Pour agiter l’incubation des cellules J774A.1 avant l’infection</td></tr><tr><td>Fioles agitatrices (1 000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>Pour agiter l’incubation des cellules J774A.1 avant l’infection</td></tr><tr><td>Pinces vibrantes pour flacons (1 000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>Pour agiter l’incubation des cellules J774A.1 avant l’infection</td></tr><tr><td>Capuchons en mousse éponge pour flacons (250 ml-1 000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>Pour l’incubation agitée des cellules J774A.1 avant l’infection ; réduit le risque de contamination par rapport aux capuchons métalliques standard</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique multicanal programmable MultiDrop Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Pour la distribution de cellules J774A.1, de milieux et de suspensions bactériennes contenant des fluorophores à un grand nombre de boîtes à 384 puits</td></tr><tr><td>Collecteur à alésage standard Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Volume de prédistribution par défaut de 20 &#956 ; l est insuffisant pour compenser le tassement &mdash ; augmentation à 80 &#956 ; l</td></tr><tr><td>Blancs 384 boîtes à puits traités pour la culture tissulaire</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Pour la lecture de la luminescence et de la fluorescence ; Le catalogue Greiner # 781080 a également été testé avec succès</td></tr><tr><td>DMSO (grade de culture tissulaire, en ampoules scellées)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Pour dissoudre les composés de contrôle positif et de test</td></tr><tr><td>Azithromycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>Contrôle positif antibiotique</td></tr><tr><td>Saponine (à partir de l’écorce de Quillaja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Pipette</td></tr> <tr><td></td><td>multicanaux de contrôle positif de cytotoxicitéThermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>Pour le transfert de quantités fixes de composés de contrôle positif ; le pipeteur doit disposer d’une distribution numérique avec crans pour permettre une distribution répétitive à volume fixe</td></tr><tr><td>Robot de transfert de broches Epson Epson</td><td>/ICCB-L</td> <td>(équipement personnalisé)</td><td>Pour le transfert de quantités fixes de composés de test à partir de réseaux de bibliothèques</td></tr><tr><td>Système de distribution numérique D300</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>D300</td><td>Pour le transfert de quantités variables de composés d’essai allant de 11 picolitres à 10 & micro ; l</td></tr><tr><td>Cartouches T8+ pour système de distribution numérique D300</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>T8+</td><td>Pour la distribution de composés de test</td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence avec appareil photo numérique connecté à l’ordinateur</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>Pour l’imagerie de cellules vivantes ; tout microscope fluorescent standard peut remplacer, avec une optique à contraste de phase ou DIC, capable d’imager la fluorescence verte (fluorescéine), rouge orangé à rouge (Texas Red) et rouge lointain (Cy5), avec de l’huile 100X objectif pour la résolution la plus élevée</td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire à fond de verre</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Pour l’imagerie de cellules vivantes. Les paraboles telles que le MatTek permettent une visualisation microscopique à un grossissement de 600X ou 1 000X grâce à l’utilisation d’un microscope épifluorescent inversé ou confocal. Ces plats spécifiques ont un diamètre nominal de 3,5 cm, un diamètre intérieur de 3,3 cm, avec des lamelles de recouvrement de 20 mm de diamètre #1,5 d’épaisseur insérées dans les fonds.</td></tr><tr><td>Photoshop, CS6</td>, <td>Adobe</td><td></td><td>, Adobe Photoshop ou des programmes similaires peuvent être utilisés pour pseudocolorier et fusionner des images microscopiques et fluorescentes.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>Pour la génération d’isobologrammes isocontours bidimensionnels et d’isobologrammes de surface tridimensionnels.</td></tr></tbody></table>

high throughput, en temps réel, à double lecture test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Les mesures traditionnelles d&#39;activité antimicrobienne intracellulaire et la cytotoxicité des cellules eucaryotes reposent sur des tests finaux. De tels tests finaux nécessitent plusieurs étapes expérimentales supplémentaires avant une lecture, telles que la lyse cellulaire, la formation de colonies de détermination de l&#39;unité, ou l&#39;addition de réactifs. Lorsque vous effectuez des milliers de tests, par exemple, au cours de criblage à haut-débit, l&#39;effort aval requis pour ces types d&#39;essais est considérable. Par conséquent, pour faciliter la découverte antimicrobienne à haut débit, nous avons développé un essai en temps réel pour identifier simultanément des inhibiteurs de la croissance bactérienne intracellulaire et d&#39;évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Plus précisément, la détection de la croissance bactérienne intracellulaire en temps réel a été activé par le marquage des souches bactériennes de criblage soit d&#39; un opéron bactérien lux (1 essai de génération st) ou reporters de protéines fluorescentes (2 ème génération, le dosage orthogonales). Une membrane cellulaire imperméant, un colorant de liaison aux acides non toxiques, Nucleica également été ajouté au cours de l&#39;infection initiale des macrophages. Ces colorants sont exclues des cellules viables. Cependant, les cellules hôtes non viables perdent l&#39;intégrité de la membrane permettant l&#39;entrée et le marquage fluorescent de l&#39;ADN nucléaire (acide désoxyribonucléique). Notamment, la liaison d&#39;ADN est associée à une forte augmentation du rendement quantique de fluorescence qui fournit une lecture à base de solution de la mort de la cellule hôte. Nous avons utilisé ce dosage combiné pour réaliser un écran à haut rendement en format microplaque, et pour évaluer la croissance intracellulaire et la cytotoxicité par microscopie. En particulier, les antimicrobiens peuvent présenter une synergie dans laquelle l&#39;effet combiné de deux ou plusieurs agents antimicrobiens, lorsqu&#39;il est appliqué en même temps est supérieur lorsqu&#39;ils sont appliqués séparément. Test de synergie in vitro contre les pathogènes intracellulaires est normalement une tâche prodigieuse permutations combinatoires d&#39;antibiotiques à différentes concentrations doivent être évaluées. Cependant, nous avons trouvé que notre analyse en temps réel combinée avec automatisé, distribution numérique technologie permitted tests de synergie facile. L&#39; utilisation de ces approches, nous avons pu étudier systématiquement l&#39; action d&#39;un grand nombre des seuls antimicrobiens et en combinaison contre le pathogène intracellulaire, Legionella pneumophila.

essai de croissance intracellulaire microplaque Figure 1 schématise les étapes d&#39;essai. Les étapes automatisées indiquées peuvent être effectuées manuellement. Cependant, le débit est grandement facilité l&#39;utilisation de systèmes de manipulation de liquides. La figure 2 montre des résultats représentatifs d&#39;une microplaq...

Un test en temps réel à haut débit a été mis au point pour identifier simultanément (1) les antimicrobiens à pénétration de cellules eucaryotes ciblant un pathogène bactérien intracellulaire, et (2) évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Une variante de la même technologie a ensuite été combinée à la technologie de distribution numérique pour permettre des études faciles, à haute résolution, dose-réponse et en synergie bidimensionnelle et tridimensionnelle.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser un seul test combiné en temps réel pour identifier des inhibiteurs spécifiques de petite molécule de la croissance bactérienne intracellulaire qui soient non toxiques pour les cellules hôtes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte d'agents antimicrobiens. Plus précisément, quels types de composés peuvent pénétrer dans les compartiments intracellulaires et tuer les pathogènes sans nuire à la cellule hôte ?Les principaux avantages de cette technique sont que la croissance bactérienne et la toxicité pour les cellules mammales sont détectées simultanément à l'aide de tests non destructifs et en temps réel. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés avec la scalabilité qu'elle offre. Tester plus de dix mille composés au cours d'une même session exige un ensemble complètement nouveau de techniques et d'équipements.En plus de Lucius, les boursiers postdoctoraux KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn, ainsi que l'étudiante de premier cycle Kat Truelson, démontrent un engagement collectif envers la découverte académique d'antimicrobiens et la microbiologie diagnostique translationnelle. Pour préparer les cellules hôtes, cultiver les macrophages J774A.1 en suspension dans du RPMI 1640, complété par neuf pour cent de sérum de veau enrichi en fer.Transférer initialement les cellules dans des flacons de culture tissulaire. Une fois les cellules devenues confluentes dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés contenant 15 millilitres de milieu, fractionner les cellules en les raclant et en les diluant jusqu'à 65 millilitres avec le même type de milieu. Remettre 15 millilitres dans le flacon de culture tissulaire et transférer 50 millilitres dans un flacon de 250 millilitres destiné au shaker bactérien.Aérer en réglant la vitesse de rotation à environ 120 tours par minute. Pour une croissance constante, incuber à exactement cinq pour cent de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius. Récolter les cellules lorsqu'elles atteignent une densité comprise entre deux virgule cinq millions de cellules par millilitre et cinq millions de cellules par millilitre.Veiller à ce que le pourcentage de cellules mortes n'excède pas 25&nbsp;%, car les cellules mortes augmentent le bruit de fond dans les tests de cytotoxicité. Il est essentiel d'empêcher la décantation des cellules dans les réservoirs lors de la distribution de grands volumes de macrophages et de bactéries à l'aide de distributeurs liquides. Agiter doucement les réservoirs toutes les quelques minutes pendant la distribution afin d'éviter les hétérogénéités et les puits non uniformes dans la plaque de test.Ensemencer les cellules dans des microplaques de 384 puits traitées pour la culture tissulaire, de couleur blanche, à raison de 50 000 cellules dans 30 microlitres de milieu de culture par puits. Incuber les microplaques pendant la nuit afin d'obtenir une confluence de quatre-vingt-dix pour cent le jour de l'expérience. Préparer des patchs de bactéries pour les expériences, en étalant abondamment les organismes sur une nouvelle plaque BCYE et en incubant pendant un jour afin d'obtenir une croissance confluente.Ré-suspendez les organismes dans le même milieu de culture tissulaire utilisé pour les cellules J774A.1. Pour réaliser l'infection des macrophages, ajoutez les composés expérimentaux d'intérêt, y compris les composés d'analyse, ainsi que les témoins positifs et négatifs de l'inhibition de la croissance bactérienne dans la lyse des cellules eucaryotes.Les solutions mères doivent être dissoutes à une concentration supérieure ou égale à 500x dans du DMSO ou une solution aqueuse, afin de permettre une dilution suffisante du véhicule. Diluez les bactéries luminescentes à une concentration cible de deux virgule cinq millions d'UFC par millilitre dans le milieu de culture tissulaire. Ensuite, ajoutez un colorant nucléaire imperméant aux membranes, non toxique, à une concentration finale dans le dosage de deux virgule cinq x.Ajouter 20 microlitres de ce mélange dans chaque puits de culture. Le volume final du test est de 50 microlitres et la concentration bactérienne finale doit être d’un million d’UFC par millilitre pour le rapporteur lux epron, ou de quatre millions d’UFC par millilitre pour le rapporteur de protéine fluorescente. Incuber à 37 degrés Celsius, pendant un à trois jours, sous 5 % de dioxyde de carbone et à 100 % d’humidité relative afin d’éviter les effets marginaux par évaporation.Pour éviter les effets de bord liés à la température lors de la lecture des résultats de dosage, équilibrez thermiquement les microplaques avant la lecture de la luminescence en les plaçant en une seule couche sur un banc de laboratoire avec les couvercles entrebâillés pendant environ 20 minutes. Lisez la croissance bactérienne et la toxicité cellulaire eucaryote sur un luminomètre ou un fluoromètre de microplaque, selon les capteurs utilisés. Replaquez les microplaques dans l'incubateur si une lecture en temps réel à des points temporels ultérieurs est souhaitée.Analysez les données comme décrit dans le protocole écrit. Pour les expériences de réponse à la dose et de test de synergie, préparez les macrophages en présence de bactéries comme précédemment. Juste avant l'incubation axénique ou l'infection des macrophages, utilisez un système automatisé de manipulation des liquides pour faciliter la mise en place d'une réponse à dose unique dans les tests de synergie combinatoire, par ajout direct et automatisé de dilutions d'agents antimicrobiens conformément au protocole du fabricant.Ajoutez des antimicrobiens d'intérêt expérimental selon une série de dilutions doubles successives. L'objectif est de couvrir, à l'extrémité supérieure, une concentration qui élimine complètement la croissance, et à l'extrémité inférieure, une concentration qui ne montre aucune activité évidente. Ci-dessous, des résultats représentatifs en fonction du temps pour la luminescence bactérienne et la fluorescence associée à la cytotoxicité.Remarquez les effets contrastés du traitement antimicrobien et du détergent cytotoxique pour les cellules eucaryotes. La détermination simultanée des réponses dose-dépendante IC50 et CC50 dans les mêmes puits de criblage a été utilisée pour évaluer la sélectivité de l'antibiotique doxycycline. La réplication bactérienne a été inhibée par des concentrations intermédiaires d'antibiotique.Cependant, une cytotoxicité a été observée à des concentrations élevées, en accord avec une sélectivité d'environ 100. Le même format de test a été utilisé pour évaluer la réponse dose-dimensionnelle des combinaisons de minocycline et d'azithromycine. Les isoclines relient les points présentant une inhibition équivalente de la croissance intracellulaire.Ici, des isoclines concaves suggéraient de forts effets synergiques pour les deux médicaments. La robotique de dispensation numérique permettant la configuration des tests, la lecture en temps réel et le format à haut débit a permis des essais de synergie triple combinatoire. Ici, l'observation d'une surface nettement concave suggère un degré élevé d'effet synergique pour les combinaisons de minocycline, d'azithromycine et de rifampicine contre la croissance intracellulaire de Legionella pneumophila.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment combiner une détection fluorescente ou luminescente avec un test de cytotoxicité en temps réel, dans un format d'analyse à haut débit. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la microscopie confocale, peuvent être appliquées pour répondre à des questions concernant les événements biologiques dans la cellule entière, qui sont également associés à leur activité antimicrobienne ou à la cytotoxicité sur cellules entières. Bien que nous ayons étudié les effets sur la réplication de Legionella, les mêmes techniques peuvent également être appliquées à d'autres pathogènes intracellulaires tels que Brucella et les microbactéries.Nous avons conçu ce protocole pour la première fois en cherchant un dosage suffisamment simple et fiable pour être utilisé dans un format de criblage à très haut débit. N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes bactériens, des lignées cellulaires et du matériel robotique comporte certains risques inhérents, et que des précautions appropriées doivent être prises, telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle adaptés lors de la réalisation de cette procédure.

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