High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

L’objectif global de ce protocole est d’utiliser une seule combinaison de tests en temps réel pour identifier des inhibiteurs spécifiques de petites molécules de croissance bactérienne intracellulaire qui ne sont pas toxiques pour les cellules hôtes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte d’antimicrobiens. Plus précisément, quels types de composés peuvent pénétrer dans les compartiments intracellulaires et tuer les agents pathogènes sans nuire à la cellule hôte ?

Les principaux avantages de cette technique sont la croissance bactérienne, la toxicité des cellules de mammifères est détectée simultanément à l’aide de tests non destructifs en temps réel. En général, les personnes qui découvrent cette méthode auront du mal à s’adapter à l’évolutivité qu’elle offre. L’analyse de plus de dix mille composés en une session nécessite un tout nouvel ensemble de techniques et d’équipements.

En plus de Lucius, les boursiers postdoctoraux KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn et Kat Truelson, étudiante de premier cycle, font preuve d’un engagement communautaire envers la découverte universitaire des antimicrobiens et la microbiologie diagnostique translationnelle. Pour préparer les cellules hôtes, la culture J774A. 1 macrophage est en suspension dans RPMI 1640, avec neuf pour cent de sérum de veau supplémenté en fer.

Passage initial des cellules dans des flacons de culture tissulaire. Une fois que les cellules sont devenues confluentes dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés dans 15 millilitres de milieu, divisez les cellules en les grattant et en les diluant à 65 millilitres avec le même type de milieu. Remettez 15 millilitres dans le ballon de culture tissulaire et transférez 50 millilitres dans un ballon agitateur bactérien de 250 millilitres.

Aérez en réglant la vitesse de rotation à environ 120 tours par minute. Pour une croissance constante, incubez à exactement cinq pour cent de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Récoltez les cellules lorsqu’elles atteignent une densité de l’ordre de deux virgule cinq millions de cellules par millilitre, à cinq millions de cellules par millilitre.

Assurez-vous que le pourcentage de cellules mortes ne dépasse pas 25 %, car les cellules mortes augmenteront le bruit de fond dans les tests de cytotoxicité. Il est essentiel d’éviter que les cellules ne s’installent dans les réservoirs lorsque vous distribuez de grands volumes de macrophages et de bactéries avec des manipulateurs de liquides. Faites tourner les réservoirs toutes les quelques minutes pendant la distribution pour éviter la non-uniformité et analysez les puits de plaques.

Plaquez les cellules en culture de tissus blancs traitées, 384 microplaques à 50 000 cellules dans 30 microlitres de milieu de culture tissulaire par puits. Incuber des microplaques pendant la nuit pour obtenir une confluence de quatre-vingt-dix pour cent le jour de l’expérience. Préparez des patchs de bactéries pour les expériences, en étalant les organismes en couche épaisse sur une nouvelle plaque BCYE et en les incubant un jour pour obtenir une croissance confluente.

Remettre les organismes en suspension dans le même milieu de culture tissulaire que celui utilisé pour le J774A. 1 cellules. Pour effectuer l’infection par les macrophages, ajoutez des composés d’essai d’intérêt, y compris des composés de dépistage, et des témoins positifs et négatifs pour l’inhibition de la croissance bactérienne dans la lyse des cellules eucaryotes.

solutions mères doivent être dissoutes à une dose supérieure ou égale à 500 fois dans du DMSO ou une solution aqueuse, afin de permettre une dilution suffisante du véhicule. Diluer les bactéries luminescentes jusqu’à un objectif de deux virgule cinq millions d’UFC par millimètre dans un milieu de culture tissulaire. Ensuite, ajoutez un colorant de recherche d’acide nucléique imprégné à membrane non toxique approprié à deux virgule cinq fois la concentration finale du dosage.

Ajoutez bien 20 microlitres de ce mélange à chaque culture. Le volume final du test est de 50 microlitres et la concentration bactérienne finale doit être d’un million d’UFC par millilitre pour le rapporteur à l’épron lux, ou de quatre millions d’UFC par millilitre pour le rapporteur de protéines fluorescentes. Incuber à 37 degrés Celsius, pendant un à trois jours dans cinq pour cent de dioxyde de carbone à 100 pour cent d’humidité relative pour éviter les effets de bord d’évaporation.

Pour éviter les effets de bord associés à la température lors de la lecture des résultats d’essai, équilibrez thermiquement les microplaques avant la lecture de la luminescence en les plaçant en une seule couche sur une paillasse de laboratoire avec les couvercles entrouverts pendant environ 20 minutes. Lire la croissance bactérienne et la toxicité des cellules eucaryotes sur un luminomètre à microplaques et un fluoromètre, selon les besoins des déclarants utilisés. Retournez les microplaques dans l’incubateur si vous souhaitez une lecture en temps réel à des moments ultérieurs.

Analysez les données comme décrit dans le protocole texte. Pour les expériences de test de relation dose-réponse et de synergie, préparez les macrophages dans les bactéries comme précédemment. Juste avant l’infection par les macrophages ou l’incubation axénique, utilisez un système automatisé de manipulation de liquide pour faciliter la réponse à dose unique dans les tests de synergie combinatoire mis en place par l’ajout automatisé direct de dilutions antimicrobiennes selon le protocole du fabricant.

Ajouter des antimicrobiens d’intérêt expérimental dans une série de dilution de doublement. L’objectif est de couvrir, à l’extrémité supérieure, une concentration qui élimine complètement la croissance, et à l’extrémité inférieure, une concentration qui ne montre aucune activité évidente. Voici des résultats représentatifs dans le temps pour la luminescence bactérienne et la fluorescence associée à la cytotoxicité.

Notez les effets contrastés du traitement antimicrobien et du détergent cytotoxique à base de cellules eucaryotes. La double détermination de la relation dose-réponse IC50 et CC50 dans les mêmes puits de criblage a été utilisée pour déterminer la sélectivité de l’antibiotique Doxycycline. La réplication bactérienne a été inhibée par des concentrations intermédiaires d’antibiotiques.

Cependant, une cytotoxicité a été observée à des concentrations élevées correspondant à une sélectivité d’environ 100. Le même format d’essai a été utilisé pour tester la relation dose-réponse bidimensionnelle pour les combinaisons de minocycline et d’azithromycine. Les isocontours relient des points d’inhibition égale de la croissance intracellulaire.

Ici, les isocontours concaves suggéraient de forts effets synergiques pour les deux médicaments. La robotique de distribution numérique pour la configuration des tests, la lecture en temps réel et le format à haut débit ont permis des tests combinatoires à triple synergie. Ici, l’observation d’une surface nettement concave suggère un degré élevé d’effet synergique pour les combinaisons de Minocycline, d’Azithromycine et de Rifampicine contre la croissance intracellulaire de Legionella pheumophila.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de combiner la lecture d’un test fluorescent ou luminescent avec des tests de cytotoxicité en temps réel dans un format de test à haut débit. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le microscope confocal peuvent être appliquées pour répondre à des questions sur l’événement biologique dans la cellule entière, qui sont également situées avec leur activité antimicrobienne ou leur cytotoxicité de cellule entière. Bien que nous ayons étudié les effets sur la réplication de la légionelle, les mêmes techniques peuvent également être appliquées à d’autres agents pathogènes intracellulaires tels que Brucella et les microbactéries.

Nous avons d’abord conçu ce protocole en essayant de trouver un test suffisamment simple et fiable pour être utilisé dans un format de criblage à très haut débit. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes bactériens, des lignées cellulaires et de l’équipement robotique comporte certains risques inhérents et que des précautions appropriées doivent être prises, telles que l’utilisation d’un équipement de protection individuelle approprié lors de l’exécution de cette procédure.