Système d'efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire

L'objectif général de ce protocole est de fournir une évaluation multidimensionnelle de la manière dont les composés affectent la survie de M. tuberculosis à l'intérieur des macrophages humains. Cette méthode repose sur un test d'efficacité basé sur la luciférase. Combiné à un test de cytotoxicité et à un test de CMI, il peut fournir des informations utiles sur la modification des composés HIT dans le développement de médicaments contre la tuberculose.

Le principal avantage de notre méthode est qu'elle permet de gagner du temps et de la main-d'œuvre. Elle remplace un dosage par unités formant colonies (UFC) par un dosage basé sur la luciférase. En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés à assurer une consistance lors du pipetage manuel par rapport à l'automatisation.

Une technique de pipetage rigoureuse est essentielle. Faites croître les cellules THP1 dans du RPMI en milieu complet, tout en maintenant une densité cellulaire de 0,2 à un million de cellules par millilitre de milieu entre les passages.

Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l'OD600 d'une suspension bactérienne en croissance active. Calculez ensuite la densité bactérienne à l'aide du facteur de conversion selon lequel 0,1 OD600 équivaut à trois fois dix puissance sept bactéries par millilitre. Prélève une quantité suffisante de bactéries pour un MOI de 10 par 1 dans un nouveau tube centrifuge.

Ensuite, faire un culottage des bactéries à 3 000 ×g pendant 10 minutes. Pour opsoniser les bactéries, ajouter 50 microlitres de sérum humain à 450 microlitres de RPMI 1640 et utiliser ce mélange pour resuspendre le culot bactérien à une densité de 1 × 10⁸ bactéries par 500 microlitres de milieu. Laisser le mélange incuber à 37 °C pendant 30 minutes.

Ensuite, à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope inversé, déterminez la densité de la culture cellulaire THP1. Puis, dans des tubes de centrifugation stériles, faites tomber les cellules en culot à 100 fois G à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu RPMI complet à une densité d’un million de cellules par millilitre.

Ajouter du PMA à une concentration finale de 40 nanogrammes par millilitre. Ce mélange est le milieu de différenciation. Combiner le *M. tuberculosis* opsonisé avec le mélange de différenciation THP1 à un MOI de 10 pour 1.

Et aliquoter le mélange final à raison de 100 microlitres par puits dans une plaque blanche à 96 puits à fond plat. Incuber ensuite la différenciation et l'infection pendant une nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, laver les puits deux fois avec 100 microlitres de RPMI.

Ensuite, ajoutez les composés dilués aux concentrations souhaitées ainsi que le RPMI dans le milieu complet. Incubez les plaques pendant trois jours. Lorsque vous utilisez des pipettes multicanal, n'oubliez pas d'adopter une action lente et régulière sur le piston et de toujours placer les embouts de pipette au même endroit dans chaque puits afin de minimiser les perturbations pour les cellules THP1.

Après l'incubation, aspirez le milieu des puits et ajoutez 50 microlitres de réactif d'essai de luciférase dans chaque puits. Scellez ensuite les plaques à l’aide de films adhésifs transparents. Incubez les plaques à 22 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis utilisez un luminomètre pour obtenir une lecture d’une seconde par puits.

Pour différencier les cellules THP1, après avoir préparé le mélange de différenciation comme indiqué précédemment dans cette vidéo, distribuez 100 microlitres du mélange de différenciation dans chaque puits d'une plaque transparente de 96 puits contenant les cellules. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le jour suivant, aspirez le milieu des puits et rincez-les deux fois avec du RPMI 1640.

Ajouter 100 microlitres de composés dilués dans du RPMI incomplet dans les puits. Incuber ensuite les cellules pendant trois jours. Dissoudre 0,5 gramme de MTT dans 100 millilitres de PBS pour préparer une solution mère de cinq milligrammes par millilitre.

Ensuite, filtrer stérilement la solution. Deux heures et demie avant la fin de la période d'incubation de trois jours, ajouter 25 microlitres de solution de MTT dans chaque puits de cellules et terminer la période d'incubation. Préparer du diméthylformamide à 50 % ou DMF en mélangeant 250 millilitres de DMF avec 250 millilitres d'eau déionisée.

Préparez le tampon d'extraction MTT comme suit. Placez 100 grammes de SDS dans un flacon de 500 millilitres et ajoutez 300 millilitres de DMF à 50 %. Appliquez une faible chaleur pour permettre la dissolution du SDS.

Ajouter 10 millilitres d'acide acétique pur et 12,5 millilitres d'acide chlorhydrique un molaire. Ensuite, utiliser du DMF à 50 % pour compléter le flacon jusqu'au trait de 500 millilitres. À la fin de la période de traitement, ajouter 100 microlitres de tampon d'extraction dans chaque puits.

Incuber le mélange à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le jour suivant, mesurer l'absorbance à 570 nanomètres. Pour réaliser un test au résazurine, cultiver M.tuberculosis en milieu 7H9 ADST jusqu'à la phase de croissance exponentielle.

Diluez la culture avec du 7H9 ADST jusqu'à une DO600 de 0,01. Utilisez du 7H9 ADST pour diluer les composés à deux fois les concentrations d'essai. Puis prélevez par aliquots 100 microlitres de chaque composé dilué dans chaque puits d'une plaque claire de 96 puits.

Transférez 100 microlitres de la suspension bactérienne diluée dans chaque puits. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié pendant cinq jours. Dissolvez 10 milligrammes de résazurine dans 100 millilitres d'eau déionisée.

Et filtrer stériliser la solution. Ajouter 30 microlitres de solution de résazurine dans les puits. Puis incuber les cellules pendant 48 heures.

La croissance bactérienne est indiquée par une conversion de couleur du bleu au rose. Réalisez une analyse quantitative conformément au protocole décrit dans le texte. Ce graphique de dispersion montre les données brutes de luminiscence mesurées en unités de luminiscence relative pour le traitement par diverses concentrations de rifampicine sur des cellules M. tuberculosis et THP1.

Dans ce graphique, on observe le pourcentage de réduction et la luminiscence dans les puits traités par rapport aux puits non traités. La rifampicine est capable de réduire de 99,9 % les unités de lumière relative, ou RLU, provenant de Mycobacterium tuberculosis intracellulaire à une concentration de 0,1 microgramme par millilitre. Résultats similaires à ceux publiés précédemment et déterminés à partir des UFC.

Dans cette figure, la cytotoxicité provoquée par des concentrations croissantes de G1-1H utilisées dans le test MTT est illustrée. Les concentrations de 10 et de trois micromoles sont nettement inférieures au seuil de IC50. Cette figure montre les effets de différentes concentrations de l'antibiotique apramycine sur la conversion du résazurine par M. tuberculosis.

La CMI90 en bouillon se situait entre 2,5 et cinq microgrammes par millilitre. Cela est légèrement supérieur à la valeur publiée précédemment de 1,5 microgramme par millilitre. Mais cela reste bien dans la plage acceptable.

Comme le montre cet exemple, l'évaporation devient significative pour toutes les expériences nécessitant des temps d'incubation prolongés. Il est donc essentiel de maintenir une humidité adéquate dans les incubateurs afin d'éviter les incohérences. Une fois maîtrisée, cette technique peut fournir des données intracellulaires fiables en aussi peu que quatre jours.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement les cellules THP1 et d'être constant dans les pipetages si l'on travaille sans automatisation. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le criblage à haut contenu peuvent être utilisées pour déterminer si les composés actifs sont bactériostatiques ou bactéricides. Après son développement, ce protocole a permis aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments contre la tuberculose d'évaluer rapidement l'efficacité des composés contre le MTB à l'intérieur des macrophages humains.

N'oubliez pas que le travail avec le microbacterium tuberculosis est dangereux. Prenez des précautions et utilisez un équipement approprié lors de la manipulation de cet microorganisme.