Système d'efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire Mycobacterium tuberculosis

L’objectif global de ce protocole est de fournir une évaluation multidimensionnelle de la façon dont les composés affectent la survie de M. tuberculosis à l’intérieur des macrophages humains. Cette méthode est centrée sur un test d’efficacité basé sur la luciférase. Lorsqu’il est combiné à la cytotoxicité, un test de CMI peut fournir des informations utiles sur la modification des composés HIT dans le développement de médicaments contre la tuberculose.

Le principal avantage de notre méthode est qu’elle permet un gain de temps et de main-d’œuvre. Il remplace un test d’unité de formation de colonie CFU par un test basé sur la luciférase. En général, les personnes qui débutent dans cette technique auront du mal à être cohérentes avec le pipetage manuel au lieu de l’automatisation.

Une technique de pipetage cohérente est cruciale. Cultivez des cellules THP1 dans RPMI dans un milieu complet. Tout en maintenant une densité cellulaire de 0,2 à un million de cellules par millilitre de milieu entre les passages.

Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l’OD600 d’une suspension bactérienne en croissance active. Calculez ensuite la densité bactérienne à l’aide du facteur de conversion de 0,1 OD600 équivaut à trois fois 10 à la septième bactérie par millilitre. Pipetez suffisamment de bactéries pour un moment d’inertie de 10 à un dans un nouveau tube à centrifuger.

Ensuite, granulez les bactéries à 3 000 fois G pendant 10 minutes. Pour opsoniser les bactéries, ajoutez 50 microlitres de sérum humain à 450 microlitres de RPMI 1640 et utilisez-le pour remettre en suspension la pastille bactérienne à une densité d’un fois 10 à la huitième bactérie pour 500 microlitres de milieu. Laissez le mélange incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope inversé, déterminez la densité de culture cellulaire THP1. Ensuite, dans des tubes à centrifuger stériles, granulez les cellules à 100 fois G à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Aspirez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans le RPMI dans un milieu complet à une densité d’un million de cellules par millilitre.

Ajouter du PMA à une concentration finale de 40 nanogrammes par millilitre. C’est le mélange de différenciation. Combinaison de M. tuberculosis opsonisé avec un mélange de différenciation THP1 à un MOI de 10 pour un.

Et aliquote le mélange final à 100 microlitres par puits dans une plaque à fond plat blanc de 96 puits. Laissez ensuite la différenciation et l’infection incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, utilisez 100 microlitres de RPMI pour laver les puits deux fois.

Ajoutez ensuite les composés dilués aux concentrations souhaitées et RPMI dans un milieu complet. Incuber les assiettes pendant trois jours. Lorsque vous utilisez des pipettes multicanaux, n’oubliez pas d’effectuer une action lente et régulière du piston et de toujours placer les pointes de pipette au même endroit à l’intérieur de chaque puits afin de minimiser les perturbations pour les cellules THP1.

Après l’incubation, aspirez le milieu des puits et ajoutez 50 microlitres de réactif de dosage de la luciférase dans chaque puits. Utilisez ensuite des scelleuses de plaques adhésives transparentes pour sceller les plaques. Incuber les plaques à 22 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis à l’aide d’un luminomètre, obtenir une lecture à une seconde par puits.

Pour différencier les cellules THP1, après avoir préparé le mélange de différenciation comme démontré précédemment dans cette vidéo, distribuez 100 microlitres du mélange de différenciation dans chaque puits d’une plaque claire de cellules à 96 puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, aspirez le fluide des puits et utilisez le RPMI 1640 pour les laver deux fois.

Ajouter 100 microlitres de composés dilués dans des RPMI incomplets dans les puits. Ensuite, incubez les cellules pendant trois jours. Dissoudre 0,5 gramme de MTT dans 100 millilitres de PBS pour obtenir une solution mère de cinq milligrammes par millilitre.

Ensuite, filtrez et stérilisez la solution. Deux heures et demie avant la fin de la période d’incubation de trois jours, ajoutez 25 microlitres de solution MTT à chaque puits de cellules et terminez la période d’incubation. Préparez 50 % de diméthylformamide NN ou DMF en mélangeant 250 millilitres de DMF avec 250 millilitres d’eau déminéralisée.

Préparez le tampon d’extraction MTT comme suit. Déposez 100 grammes de FDS dans une bouteille de 500 millilitres et ajoutez 300 millilitres de DMF à 50 %. Appliquez une chaleur douce pour permettre au SDS de se dissoudre.

Ajoutez 10 millilitres d’acide acétique pur et 12,5 millilitres d’acide chlorhydrique molaire. Ensuite, utilisez 50 % de DMF pour remplir la bouteille jusqu’à la marque des 500 millilitres. À la fin de la période de traitement, ajoutez 100 microlitres de tampon d’extraction dans chaque puits.

Incuber le mélange à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, lecture de l’absorbance à 570 nanomètres. Pour effectuer un dosage de la résazurine, cultivez M. tuberculosis en 7H9 ADST jusqu’à la phase midlock.

Diluer la culture avec 7H9 ADST à une DO 600 de 0,01. Utilisez 7H9 ADST pour diluer les composés à deux fois les concentrations d’essai. Et aliquote 100 microlitres de chaque composé dilué dans chaque puits d’une plaque transparente de 96 puits.

Transférez 100 microlitres de suspension bactérienne diluée dans chaque puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié pendant cinq jours. Dissoudre 10 milligrammes de résazurine dans 100 millilitres d’eau déminéralisée.

Et le filtre stérilise la solution. Ajouter 30 microlitres de solution de résine dans les puits. Ensuite, incubez les cellules pendant 48 heures.

La croissance bactérienne est indiquée par une conversion de couleur du bleu au rose. Effectuer une analyse quantitative selon le protocole textuel. Ce nuage de points montre les données de luminescence brutes mesurées en unités de luminescence relatives pour le traitement de diverses concentrations de rifampicine sur les cellules de M. tuberculosis et THP1.

Dans ce graphique, le pourcentage de réduction et de luminescence dans les puits traités par rapport aux puits non traités est illustré. La rifampicine est capable de réduire 99,9 % des unités de lumière relatives, ou RLUs, de M. tuberculosis intracellulaire à une concentration de 0,1 microgramme par millilitre. Similaire aux résultats publiés précédemment déterminés par CFU.

Cette figure illustre la cytotoxicité causée par l’augmentation des concentrations de G1-1H utilisées dans le dosage MTT. Les concentrations de 10 et trois micromolaires sont nettement inférieures au seuil IC 50. Cette figure montre les effets de différentes concentrations de l’antibiotique apramycine sur la conversion de la résazurine par M. tuberculosis.

Le MIC90 dans le bouillon se situait entre 2,5 et cinq microgrammes par millilitre. C’est légèrement plus élevé que la valeur précédemment publiée de 1,5 microgramme par millilitre. Mais il reste bien en deçà de la fourchette acceptable.

Comme démontré ici, l’évaporation devient significative pour toutes les expériences avec des temps d’incubation prolongés. Il faut donc veiller à ce que les incubateurs soient bien humidifiés pour éviter les incohérences. Une fois maîtrisée, cette technique peut fournir des données intracellulaires fiables en aussi peu que quatre jours.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’être doux avec les cellules THP1 et d’être cohérent avec le pipetage si vous essayez sans automatisation. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le criblage à haut contenu peuvent être utilisées pour déterminer si les composés touchés sont bactériostatiques ou bactéricides. Après sa mise au point, ce protocole a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments contre la tuberculose pour évaluer rapidement l’efficacité des composés contre le MTB à l’intérieur des macrophages humains.

N’oubliez pas que travailler avec Microbacterium tuberculosis est dangereux. Prenez des précautions et utilisez un équipement approprié lorsque vous manipulez ce micro-organisme.